专利名称：一种通过同源重组敲除nagE的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
氨基葡萄糖(Glucosamine, 2-amino-2-deoxy-D-glucose)是葡萄糖的一个轻基被氨基取代后的化合物。几乎存在与所有有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分。氨基葡萄糖能特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛。因此，临床上多用于治疗骨关节炎。此外，氨基葡萄糖还具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生；在医药上作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿性关节炎和胃溃疡疾病。在食品中，是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，还是合成VB6和核黄素中间体的起始原料，此外也可用于化妆品和饲料添加剂中。甲壳素水解法是我国目前生产氨基葡萄糖的主要方法，甲壳素水解法转化效率低，产生大量酸性废水，因而产品成本高、污染严重。目前，国内外对生物法生产氨基葡萄糖的报道较少，发酵产量也较低，尚未达到工业化生产的要求。在发酵过程中当碳源葡萄糖浓度较低时，氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以被细胞当作碳源利用。氨基葡萄糖依靠甘露糖磷酸转移系统(marmose PTS，IIMan，由manXYZ 操纵子编码)和葡萄糖磷酸转移系统(glucose PTS, IIg1c,由pstG基因编码)对其进行磷酸化后从胞外向胞内转运，而N-乙酰氨基葡萄糖在从胞外向胞内转运时，依靠IIMan和乙酰氨基葡萄糖磷酸转移系统(GlcNAc PTS, IInag,由基因nagE编码)对其进行磷酸化后进行转运。因此，要想在胞外积累高浓度的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖，就必须对其转运途径进行阻断，减弱氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖从胞外到胞内的转运。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产氨基葡萄糖基因工程菌，所述重组菌为是克隆E. coli BL21(DE3)基因组中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和酿酒酵母 S. cerevisiae S288C基因组中氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因，同时敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统nagE基因和甘露糖磷酸转移系统manX基因构建而成的重组大肠杆菌。所述氨基葡萄糖合成酶的基因来源于GenBank No. CP001509. 3基因组中glmS 片断，氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因来源于GenBank NC_001138,大肠杆菌为E. coli K-12(ATCC25947)。将氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gnal连接到载体 pET-28a(+)上。
本发明还提供了一种构建高产氨基葡萄糖基因工程菌的方法，用限制性内切酶 Sac I和Hind III对glmS基因片断和pET48a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET48a(+)的Mc I和Hind III位点之间；用限制性内切酶Not I和Xho I对gnal基因片断和pET48a(+)进行酶切，并通过连接反应将gnal基因片断插入质粒 pET-28a(+)的Not I 和 Xho I 位点之间得到重组质粒pET_28a(+) -glmS-gnal。敲除Ε. coli ATCC 25947基因组中nagE基因片段，得到nagE基因失活的菌株E. coli-Δ nagE,再将携带有glmS和gnal基因片段的质粒pET18a (+)-glmS-gnal转化大肠杆菌E. coli-Δ nagE中得至Ij重组菌 E. coli-glmS-gnal-Δ nagE。所述重组菌培养环境条件培养时间为12h，温度37°C，摇床转速200rpm，待OD6tltl达到0. 6时，按照10%浓度加入乳糖(使发酵液中终浓度为5g/L)诱导glmS和gnal基因的表达。 所述重组菌培养基组成为种子培养基蛋白胨12g，酵母膏Mg，甘油細1，按照50μ g/ml加入卡那霉素，pH 自然；发酵培养基蛋白胨12g，酵母膏Mg，葡萄糖10g，按照50 μ g/ml加入卡那霉素， PH自然。本发明采用基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点。生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。
具体实施例方式1.重组质粒 pET18a(+)-glmS-gnal 的构建用于扩增glmS基因的引物上游5，-CGA GCT CAT GTG TGG AAT TGT TGG C-3，(下划线序列表示限制性内切酶识别位点Me I)下游5，-CCCAAG CTT TTA CTC AAC CGT AAC CGA-3，(下划线序列表示限制性酶切位点Hind III)。氨基葡萄糖合成酶基因glmS是利用E. coli BL21 (DE3)基因组(GenBank No. CP001509. 3)作为模版进行PCR得到的。用限制性内切酶Sac I和Hind III对glmS基因片断和pET48a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET48a(+)的 Sac I和Hind III位点之间，得到重组质粒pET48a(+)-glmS。用于扩增gnal基因的引物上游5，-AAGGAGATAAGAATGCGGCCGCATGAGCTTAC-3，(下划线序列表示限制性内切酶识别位点Not I)下游5，-CCGCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3'(下划线序列表示限制性酶切位点》ιο I)。氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal是利用酿酒酵母S.cerevisiae基因组 (GenBank NC_001138)作为模版进行PCR得到的。用限制性内切酶Not I和Xho I对 gnal基因片断和pET18a(+)-glmS进行酶切，并通过连接反应将gnal基因片断插入质粒pET-28a (+) -glmS 的 Not I 和 Xho I 位点之间，得到重组质粒 pET_28a (+) -glmS-gnal。2.nagE基因的敲除根据Ε. coli JW0665_1(该菌购自麻省理工学院，其nagE基因已经被kan插入失活)基因组序列设计上游引物5，-TACGAGAAGCCAGAGAAGACGC-3，下游引物5，-GGTGTTCAGCAAATTTAATACGG-3，该菌株信息详见:http //cgsc. biology, yale. edu/Mutation. php ？ ID = 101996扩增该菌nagE基因座及上下游约SOObp片段，将该片段转化含有质粒pKD46的 E. coliK-12，利用Red同源重组技术敲除E. coli K-12基因组nagE基因片段，再转化质粒 PCP20，去除kan片段后得到nagE基因失活菌株E. coli-AnagE。将重组质粒pET_28a (+) -glmS-gnal转化E. coli-Δ nagE,得到重组大肠杆菌 E. coli_glmS_grial_ Δ nagE。4.发酵用LB斜面培养基培养大肠杆菌E. coli-glmS-gnal-AnagE，培养1 后用接种环取1环接入装有20mL种子培养基的250mL的三角瓶中进行种子培养。种子培养基为种子培养基蛋白胨12g，酵母膏Mg，甘油細1，按照50yg/ml加入卡那霉素，pH自然。培养时间为12h，温度37°C，摇床转速200rpm。再以5%的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml的三角瓶中进行发酵培养。 发酵培养基蛋白胨12g，酵母膏Mg，葡萄糖10g，同时按照50μ g/ml加入卡那霉素，pH自然。培养时间为12h，温度37°C，摇床转速200rpm，待OD600达到0. 6时，按照10%浓度加入乳糖诱导glmS和gnal基因的表达。发酵结束后发酵液中氨基葡萄糖浓度可以达到70g/L。5.氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的检测方法；氨基葡萄糖标准曲线绘制准确称取氨基葡萄糖0. 0100g，加入20. Oml蒸馏水， 配制成0. 5000g/l的氨基葡萄糖溶液，然后分别稀释成浓度为0. 2500g/l，0. 1250g/l, 0. 0625g/l，0. 0313g/l的溶液。分别取相应浓度氨基葡萄糖溶液0. 5mL于玻璃塞试管中，加入乙酰丙酮试剂1.0ml，90°C水浴处理lh，冷却至室温，慢慢加入96% (ν/ν)乙醇 10. OmL (勿搅动)，然后加入DMAB试剂1. OmL,混合均勻。因反应体系由碱性变为酸性，需注意有大量二氧化碳气体产生。混合后室温放置Ih稳定，530nm比色，以试样浓度为横坐标， OD值为纵坐标绘制标准曲线。氨基葡萄糖的检测取发酵液5.0ml加入5mL离心管中，8000rpm离心8min，取 0. 5mL于玻璃塞试管中，加入乙酰丙酮试剂1. 0ml，90°C水浴处理lh，冷却至室温，慢慢加入 96% (ν/ν)乙醇10. OmL (勿搅动)，然后加入对二甲胺基苯甲醛(DMAB)试剂1. OmL，混合均勻，混合后室温放置Ih稳定，530nm比色，根据标准曲线计算GlcN产量。乙酰氨基葡萄糖的检测用HPLC检测，安捷伦1200，RID检测器，C18柱，内径 4. 6mm,柱长250mm，流速0. 7ml/min,柱温30°C，流动相70%乙腈。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种氨基葡萄糖基因工程菌，是克隆E. coli BL21(DE!3)基因组中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和酿酒酵母S. cerevisiae S288C基因组中氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因，同时敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统nagE基因构建而成的重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖合成酶的基因来源于GenBankNo. CP001509. 3基因组中glmS片断，氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因来源于 GenBank NC_001138。
3.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，将氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS 和氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gnal连接到载体pET48a(+)上。
4.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，大肠杆菌为E.coli ATCC 25947。
5.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，具体步骤如下1)用限制性内切酶SacI和Hind III对glmS基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET48a(+)的Mc I和Hind III位点之间；2)用限制性内切酶NotI和Xho I对gnal基因片断和pET-28a(+)进行酶切，并通过连接反应将gnal基因片断插入质粒pET48a(+)的Not I和Bio I位点之间得到重组质粒 pET-28a(+)-glmS-gnal ；3)通过Red同源重组技术敲除重组菌Ε.coli ATCC 25947基因组中nagE基因片段，得到nagE基因失活的菌株E. coli-Δ nagE ；4)将质粒pET18a(+)-glmS-gnal转化E.coli-ΔnagE，得到基因工程菌 E. coli_glms_grial_ Δ nagE。
全文摘要
本发明公开了一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其应用，是将氨基葡萄糖合成酶的基因(glmS)和氨基葡萄糖乙酰化酶基因(gna1)导入大肠杆菌E.coli K-12，并敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统编码基因nagE，得到的基因工程菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE，该菌株用于发酵生产氨基葡萄糖，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点，生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。
文档编号C12N15/70GK102268399SQ201110174249
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者何菊, 刘龙, 堵国成, 李江华, 陈坚, 陈欣 申请人:江南大学