一种定量检测dna双链断裂碎片数的标准品的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及DNA双链断裂碎片数目的定量分析技术领域，具体涉及一种检测DNA 双链断裂碎片数目的标准品的制备方法以及标准品的应用。
【背景技术】
[0002] 生物体内部或外界的多种不利因素如细胞内代谢产物、电离辐射、亚硝铵类致癌 物等均可导致DNA分子断裂。若DNA发生双链断裂，则机体会启动同源重组修复通路或 (和）非同源末端连接修复通路对其进行修复，若不能被有效修复则会产生DNA双链断裂， 累积起来，可能会对细胞的正常生理功能造成影响，甚至导致病变的发生。因此，定量分析 DNA双链断裂数目的多少对评估生物遗传的稳定性非常重要。
[0003] 虽然检测DNA双链断裂的方法很多，但大部分方法如流式细胞术、TUNEL法等检测 的是DNA单链断裂和DNA双链断裂的总和，仅有小部分方法检测的是DNA双链断裂。目前 检测DNA双链断裂的方法主要有γ H2AX法、单细胞凝胶电泳法及脉冲电场凝胶电泳法等。 γ Η2ΑΧ法是利用DNA双链断裂后，会形成磷酸化的γ Η2ΑΧ，即γ Η2ΑΧ焦点。焦点数与DNA 双链断裂点数间存在一一对应关系，通过计数γ Η2ΑΧ焦点数可实现DNA双链断裂点的定量 分析。但在实际工作中，计数γΗ2ΑΧ焦点数需在荧光显微镜下采用手工方法或借助特定软 件进行，当γΗ2ΑΧ焦点数过多、γΗ2ΑΧ焦点过于密集甚至发生重叠时，手工计数或软件分 析均会出现较大偏差，因此，一般分析中γΗ2ΑΧ法的结果常以含γΗ2ΑΧ焦点细胞在总细胞 中所占百分比或γ Η2ΑΧ焦点的平均几何荧光强度表示，而非以DNA双链断裂点数目表示。 单细胞凝胶电泳法及脉冲电场凝胶电泳法检测的是DNA双链断裂在总DNA中所占的比例， 无法对DNA双链断裂数进行定量分析。综上所述，目前的主要检测方法均难以对DNA双链 断裂数目进行定量分析。难以定量DNA双链断裂数的主要原因是缺乏合适的已知量的标准 品用以推测未知样本中DNA双链断裂数，因此，我们试图提供一种应用于定量分析DNA双链 断裂碎片数的标准品的制备方法及其应用。
[0004] 限制性内切酶可以特异识别特定核苷酸序列并将其切割，使完整的DNA产生特定 断裂碎片数目。限制性内切酶切割完整的DNA分子后产生的DNA双链断裂的数目与该酶特 异识别的核苷酸序列在DNA分子中出现的频率成正比。不同限制性内切酶特异识别的核 苷酸序列不同，该核苷酸序列在DNA分子中出现的频率也不同，因而用不同的限制性内切 酶切割DNA分子可获得不同数量的DNA双链断裂片段。本法借助限制性内切酶完全酶切 DNA双链断裂阴性标本制备定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品，并通过识别特定序列 的软件扫描，计算出已知序列的基因（组）DNA标准品中限制性内切酶特异识别序列在基因 (组）中出现的次数，得到标准品中DNA双链断裂碎片的数目。制备方法简便，成本低廉，结 果可靠，并可广泛应用于各种生物已知基因（组）序列的DNA双链断裂碎片数的定量检测， 解决了目前暂无定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品这一难题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法以 及该标准品的应用，以克服由于暂无 DNA双链断裂标准品而导致现有检测技术难以对DNA 双链断裂碎片数进行定量分析的不足。
[0006] 一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法，用不同的限制性内切酶 分别完全酶切已知序列的基因或基因组DNA所得碎片即为标准品。
[0007] 上述用于制备标准品的对象为完整基因或基因组，即DNA双链断裂阴性标本，要 求出现DNA双链断裂的比例< 5 %。
[0008] 能够利用上述方法制备的标准品采用标准曲线法对待测样品进行DNA双链断裂 碎片数的定量分析，所述的标准品与待测样品的DNA类型相同。
[0009] 上述方法制备的标准品采用连接介导荧光定量PCR进行标准品扩增制备标准曲 线。
[0010] 上述方法制备的标准品的标准曲线以进行连接介导荧光定量PCR后的标准品的 Ct值为横坐标，DNA双链断裂碎片数为纵坐标，通过曲线拟合获得拟合方程。对于任何已知 DNA序列的基因或基因组进彳丁序列扫描，计算出基因或基因组中限制性内切酶特异识别序 列出现的次数，1个特异识别序列即为1个切割位点，从而计算限制性内切酶在基因或基因 组中的切割位点数，得到标准品基因或基因组DNA双链断裂碎片数。
[0011] 待测样品同样采用连接介导荧光定量PCR法扩增，将待测样本的Ct值代入方程中 即换算得到DNA双链断裂碎片数值。
[0012] 所述的方法制备得到的定量检测DNA双链断裂片段数的标准品的应用，用于对待 测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析。具体是利用所述的标准品采用标准曲线法对 待测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析。所述的标准品与待测样品的DNA类型相同。
[0013] 本发明标准品的制备时为保证酶切尽量完全，应尽量避免酶切序列的DNA甲基化 修饰，可通过限制性内切酶产品提供商提供的产品信息和DNA序列信息作出判断。所用限 制性内切酶的种类和数量根据待检测样品预估的断裂碎片数确定，保证待测样品的Ct值 和断裂数均在所选定的几种限制性内切酶处理后制备的标准曲线范围内，符合制备标准曲 线的原则。
[0014] DNA双链断裂检测的标准品标本DNA类型与待测标本DNA类型相同，可以是任何已 知DNA序列生物的基因组，也可以是某个已知序列的DNA片段。
[0015] 本发明用于非疾病治疗或者诊断目的的已知DNA序列的任何基因或基因组DNA双 链断裂碎片数目的检测，包括各种动物、植物和微生物等。
[0016] 与现有技术相比，采用本发明所用技术方案，可以达到以下技术效果：
[0017] 1.这是一个定量的方法：对于任何已知DNA序列的基因或基因组，采用本法均可 用标准曲线法获得未知样品中DNA双链断裂碎片的数目。
[0018] 2.适用性广：对于已知基因组DNA序列的所有生物或者已知DNA序列的各种DNA 片段均可适用。它可和连接介导荧光定量PCR等技术配合使用。
[0019] 3.简单实用：本发明中标准品制备方法技术简便，结果可靠，成本低廉。
【附图说明】
[0020] 图I :含不同水平SDF的精子细胞在SCGE法中所呈现的"彗星"图形；
[0021] 图2 :6个标准品的连接介导荧光定量PCR曲线图；
[0022] 图3 :连接介导荧光定量PCR分析精液DNA双链断裂碎片数标准曲线；
[0023] 图4 :中性单细胞凝胶电泳法与LM-FQPCR法相关性比较；
[0024] 图5 :40例临床精液标本LM-FQPCR的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0026] 实施例
[0027] 1.利用软件对人基因组DNA双链断裂碎片数的确定：
[0028] 人染色体的核苷酸全序列可从 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/ genome/guide/human/index. shtml 的 download DNA sequence 下载。
[0029] 2.选择平末端核酸内切酶，通过识别特定序列用软件对染色体DNA进行扫描，核 酸内切酶识别序列的出现次数即为理论上的DNA双链断裂的碎片数。
[0030] 如 Afe I 识别序列 5' AGCi GCT 3'，
[0031] 3' TCGt CGA 5'
[0032] 对人基因组每一染色体分别扫描，用软件确认的限制性内切酶识别的特定序列结 果见表1。
[0033] 表1限制性内切酶特异识别序列在人类染色体中出现的次数
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[0036] 3.人精子DNA双链断裂碎片（sperm DNA fragmentation, SDF)标准品的制备
[0037] 在人精子DNA双链断裂碎片分析中，习惯用SDF代表DNA双链断裂碎片。首先需 确定DNA双链断裂阴性精液标本，一般采用碱性单细胞凝胶电泳法（SCGE)和中性单细胞凝 胶电泳法同时测定其"慧尾"DNA < 5%，即为SDF阴性（non-SDF)，如图1。
[0038] 再用 Pmel，EcoRV，Psil，SspI，HaeIII, AluI 限制性内切酶分别完全酶切 IOOng DNA 双链断裂阴性精液标本精子基因组DNA以获得6个标准品。通过优化酶切条件，6种限制性 内切酶完全酶切DNA碎片阴性精液标本的精子基因组DNA的具体操作过程如下：
[0039] (I)PmeI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA :
[0041] 用无菌双蒸水补至20 μ 1
[0042] 37°C孵育3h，65°C 20min灭活MssI限制性内切酶
[0043] (2)EcoRV限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA :
[0044] CN 105177128 A 说明书 5/9 页
[0045] 用无菌双蒸水补至20 μ I
[0046] 37°C孵育3h，80°C 20min灭活EcoRV限制性内切酶
[0047] (3)PsiI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA :
[0049] 用无菌双蒸水补至20 μ 1
[0050] 37°C孵育3h，65°C 20min灭活AanI限制性内切酶
[0051] (4) SspI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA :
[0053] 用无菌双蒸水补至20 μ 1
[0054] 37°C孵育2h，65°C 20min灭活SspI限制性内切酶
[0055] (5)Hae III限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA :
[0057] 用无菌双蒸水补至20 μ 1
[0058] 37°C孵育2h，80°C 20min灭活BsuRI限制性内切酶
[0059] (6) AluI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA :
[0060] CN 105177128 A 说明书 6/9 页
[0061] 用无菌双蒸水补至20 μ I
[0062] 37°C孵育lh，65°C 20min灭活AluI限制性内切酶。
[0063] 分别取1