μ 1上述6种限制性内切酶酶切后的产物稀释1000倍作为6个标准品。
[0064] 标准品中DNA双链断裂碎片数量的计算：
[0065] 基因组DNA的拷贝数=基因组DNA的质量（μ g) X 6. 022 X IO23 (mol 1V [3· 15 X IO9 (bp) X IO6 X 650]=基因组 DNA 的质量（μ g) X 2· 94 X ΙΟ5。
[0066] 本实施例中，1 μ 1标准品所含基因组拷贝数=0. 1 μ gX (1/20) X 10 3Χ2. 94Χ IO5=I. 47,其中0. 1 μ g为限制性内切酶酶切SDF阴性精液标本的精子基因组DNA时所用基因 组DNA的质量，0. 1 μ gX (1/20) X 10 3为在20 μ 1酶切系统中取1 μ 1所含基因组DNA的拷 贝数。1 μ 1标准品中DNA双链断裂碎片数量分别为：PmeI (51699. 9)，EcoRV (569949. 135)， PsiI (2113164. 69)，SspI (3041673. 285)，Hae III (11519393. 34)，AluI (17476414. 725)。
[0067] 4.连接介导荧光PCR(LM-FQPCR)制备标准曲线
[0068] (1)制备用于与DNA双链断裂碎片连接的接头：将24bp 5'-AGC ACT CTC GAG CCT CTC ACC GCA-3'和12bp 5' -TGC GGT GAG AGG-3'未磷酸化的寡核苷酸分别用无菌双蒸 水溶解后，等摩尔混合，按照以下程序合成接头：95°C 3min，在45min内逐步冷却至25°C， 25 °C 10min〇
[0069] (2)用T4DNA连接酶将DNA双链断裂碎片与接头连接：
[0070] 标准品的连接体系为：
[0072] 用无菌双蒸水补至20 μ 1
[0073] 将上述连接体系在22°C孵育lh，连接产物作为荧光定量PCR的扩增模板。
[0074] (3)荧光定量PCR进行扩增：反应体系为：
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[0077] 荧光定量PCR的程序设为：72°C 7min，使接头中未与DNA双链断裂碎片连接的 12bp寡核苷酸释放，并在DNA聚合酶的作用下补平末端缺口；98°C预变性2min ;98°C变性 10s，72°C延伸2min，共35个循环；95°C熔解10s，60°C lmin，温度以0. 3%的速率上升，从 60 °C到95 °C收集熔解曲线数据。
[0078] 6 个标准品的 Ct 值分别为 25. 62 (PmeI)、24. 39 (EcoRV)、23. 64 (PsiI)、 23. 15 (SspI)、19. 29 (Hae III )、15. 95 (AluI)(图 2)。
[0079] (4)标准品焚光定量PCR的反应体系中所含DNA双链断裂碎片数的计算：标准品 荧光定量PCR的反应体系中所含DNA双链断裂碎片=1 μ 1标准品中DNA双链断裂碎片数 量Χ2Χ2/20,公式中的2为使用了 2μ1标准品与接头进行连接，2/20代表在20μ1的连 接体系中取2 μ 1进行荧光定量PCR (FQPCR);计算得到6个标准品荧光定量PCR反应体系中 所含 DNA 双链断裂碎片分别为 L 03 X IO4 (PmeI)、IL 40 X IO4(EcoRV)、42· 26 X IO4 (PsiI)、 60. 83 X IO4(SspI)、230. 39 X 104(Hae III )、349. 53 X IO4(AluI)。
[0080] (5)以6个标准品的Ct值为横坐标，荧光定量PCR的反应体系中所含DNA双链断 裂位点数（即碎片数）为纵坐标，做出标准曲线，通过曲线拟合获得拟合方程为：DNA双链 断裂碎片数=963. 61 X 104-38. 52 X IO4X Ct (R2= 0. 989)(图3)。将待测样本的Ct值代入 方程中即可换算得到DNA双链断裂碎片数值。
[0081] 5.方法学评价
[0082] (1)精密度评价
[0083] (a)制备含低、中、高DNA双链断裂碎片的样本：用AluI限制性内切酶酶切DNA碎 片阴性精液标本的精子基因组DNA，通过改变AluI限制性内切酶的酶切时间以获得低、中、 高DNA双链断裂碎片的样本。具体操作过程如下：
[0085] 用无菌双蒸水补至20 μ 1
[0086] 37°C分别孵育 5min、20min、40min，65°C 20min 灭活 AluI 限制性内切酶。
[0087] (b)批内重复性是1次对三个DNA双链断裂碎片水平的样本重复检测5次，批间 重复性是连续5天对三个不同DNA双链断裂碎片水平的样本进行检测。含低、中、高DNA 双链断裂碎片样本的批内变异系数分别为2. 45%、0. 99%和0. 67%，批间变异系数分别为 5. 65%、L 41 %和3. 18%。表明重复性好。
[0088] (2)正确度性能评价
[0089] 方法比较试验：收集湖南省妇幼保健院生殖中心精液标本40例，其中健康男性精 液标本20例，不育男性精液标本20例，同时采用中性单细胞凝胶电泳法和LM-FQPCR法检 测。
[0090] 健康男性组和不育男性组DNA双链断裂碎片是否存在差异用Mann-Whitney U检 验分析，采用本发明精子DNA双链断裂碎片标准品定量检测与中性单细胞凝胶电泳法均显 示不育男性DNA双链断裂碎片水平高于健康男性（P = 0. 000)，二种方法进行Spearman相 关性检验显示，采用本发明精子DNA双链断裂碎片标准品定量检测与中性单细胞凝胶电泳 的Spearman相关系数为0· 83 (P = 0· 000)，相关性强（图4)。
[0091] 6.临床标本的检测
[0092] (1)收集临床精液标本40例，其中健康男性精液标本20例，不育男性精液标本20 例。采用试剂盒提取精子基因组DNA，并测定基因组DNA的浓度，调整浓度至100ng/ml。
[0093] (2)制备用于与DNA双链断裂碎片连接的接头：将24bp 5'-AGC ACT CTC GAG CCT CTC ACC GCA-3'和12bp 5' -TGC GGT GAG AGG-3'未磷酸化的寡核苷酸分别用无菌双蒸 水溶解后，等摩尔混合，按照以下程序合成接头：95°C 3min，在45min内逐步冷却至25°C， 25 °C 10min〇
[0094] (3)用T4DNA连接酶将DNA双链断裂碎片与接头连接：
[0095] 待测样本的连接体系为：
[0097] (4)荧光定量PCR进行扩增：反应体系为：
[0098] CN 105177128 A 说明书 9/9 页
[0099] 荧光定量PCR的程序设为：72°C 7min，使接头中未与DNA双链断裂碎片连接的 12bp寡核苷酸释放，并在DNA聚合酶的作用下补平末端缺口；98°C预变性2min ;98°C变性 10s，72°C延伸2min，共35个循环；95°C熔解10s，60°C lmin，温度以0. 3%的速率上升，从 60°C到95°C收集熔解曲线数据。以无模板对照（无菌双蒸水）和无 T4DNA连接酶对照（连 接步骤中未加入T4DNA连接酶）作为阴性对照。40例精液标本的Ct值在17. 97到24. 25 间。其中，20例健康男性精液标本的Ct值在20. 72到24. 25间，20例不育男性精液标本的 Ct值在17. 97到21. 36间（图5)。通过标准曲线即可计算出待测样品的DNA双链断裂点 数。
[0100] 本发明实施例关于临床精液标本的检测，并非指本发明用于疾病治疗或诊断目 的，仅仅作为实施例验证本发明的方法能够用于任意已知序列的基因或基因组DNA双链断 裂点数目的检测，包括各种动物、植物或者微生物的DNA双链断裂的检测。
【主权项】
1. 一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法，其特征在于，用不同的限 制性内切酶分别完全酶切已知序列的基因或基因组DNA所得碎片即为标准品。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，用于制备标准品的对象为完整基因 或基因组，即DNA双链断裂阴性标本，要求出现DNA双链断裂的比例< 5%。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，能够利用所述的标准品采用标准曲 线法对待测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析，所述的标准品与待测样品的DNA类 型相同。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用连接介导荧光定量PCR进行标准 品扩增制备标准曲线。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，标准曲线以进行连接介导荧光定量 PCR后的标准品的Ct值为横坐标，DNA双链断裂碎片数为纵坐标，通过曲线拟合获得拟合方 程。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，对于任何已知DNA序列的基因或基因 组进行序列扫描，计算出基因或基因组中限制性内切酶特异识别序列出现的次数，1个特异 识别序列即为1个切割位点，从而计算限制性内切酶在基因或基因组中的切割位点数，得 到标准品基因或基因组DNA双链断裂碎片数。7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，待测样品同样采用连接介导荧光定 量PCR法扩增，将待测样本的Ct值代入方程中即换算得到DNA双链断裂碎片数值。8. 权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的定量检测DNA双链断裂片段数的标准品 的应用，其特征在于，用于对待测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用所述的标准品采用标准曲线法对待 测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的标准品与待测样品的DNA类型相 同。
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法及应用，其解决了现有DNA双链断裂碎片数目检测中不能定量的问题。主要是采用限制性内切酶完全酶切待分析的完整目标基因(组)获得标准品，再利用标准曲线法对任何已知DNA序列的基因(组)双链断裂碎片数目进行定量分析。本标准品制备方法简便、成本低廉、定量结果可靠，可广泛应用于已知DNA序列的各种生物的基因(组)双链断裂碎片数目的定量分析。
【IPC分类】C12P19/34, C12Q1/68
【公开号】CN105177128
【申请号】
【发明人】徐克前, 邓爽, 阎祖炜, 朱燕, 王雷, 李鹏
【申请人】中南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月24日