重组古菌组蛋白HPhA作为基因药物载体及在制备抗癌药物方面的应用的制作方法

专利名称：：重组古菌组蛋白HPhA作为基因药物载体及在制备抗癌药物方面的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种来自超嗜热古菌Pjro②"M/wn'few/^'的重组古菌组蛋白HPhA作为基因药物载体的应用，以及HPhA与质粒pCMV-p53(wt)形成的基因药物载体复合物在用于制备抗癌药物方面的应用。
背景技术：
：基因治疗(genetherapy)就是用外源正常基因校正或置换致病基因的一种治疗方法，目前基因治疗的对象主要是肿瘤。恶性肿瘤发病率高，缺乏有效的治疗手段，传统治疗方法治愈率低、复发率和死亡率高、治疗效果差。人们对肿瘤治疗除采用传统手段之外，尝试从基因水平上对其迸行根治。抑癌基因正常功能的丧失是肿瘤发生的重要环节之一，p53基因是目前发现的人类肿瘤中基因改变频率最高的抑癌基因，通过恢复肿瘤抑制基因p53的功能以治疗肿瘤的p53基因治疗已被广泛应用于鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌神经胶质瘤等肿瘤疾病的研究中，是近年来医学研究的热点。载体系统是基因治疗成功的关键技术之一，特别是分子生物学的快速进展，人类基因组计划的初步成功，可供选择的治疗基因很多，但是载体系统的发展却相对滞后。载体系统分为病毒和非病毒载体，各有利弊，基因治疗的方案中病毒载体还是占了巨大部分。随着近来对生物安全性的要求提高，以及病毒载体基因治疗发生的事故，使得非病毒载体的关注日益提高。目前己有的非病毒载体介导基因转染方法有裸DNA注射转染、磷酸钙介导转染、电转移法转染、阳离子脂质体转染及阳离子聚合物转染等。非病毒载体虽然没有病毒载体的缺点，但转染效率都不如人意。阳离子脂质体转染效率较高、重复性好、但其对细胞的形态及活力均有很强毒副作用。显微镜观察发现使用Lipofectin或Lipofectmanine非病毒载体，可引起细胞形态学改变，细胞破裂及降低细胞活力，使其应用受到很大限制。因此进一步开发安全，有效且有优良特性的非病毒载体系统是发展基因治疗的当务之急。组蛋白载体的出现有可能突破这一瓶颈，使基因治疗成为临床治疗手段。
发明内容本发明的目的之一，是将来源于超嗜热古菌P;rococa^/zor/few/^'的重组古菌组蛋白HPhA用作基因药物载体方面的应用。本发明的目的之二，是利用重组古菌组蛋白HPhA与pCMV-p53质粒构建HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物。本发明的目的之三，是上述基因药物载体复合物在用于制备治疗鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌祌经胶质瘤等恶性肿瘤药物方面的应用，从而弥补
背景技术：
中所述药物载体在基因药物治疗方面的缺陷。本实验室的前期工作制备了重组古菌组蛋白HPhA(参见WengL，FengY,JiX，etal.RecombinantexpressionandcharacterizationofanextremelyhyperthermophilicarchaealhistonefromPyrococcushorikoshiiOT3,ProteinExprPurif，2004,33:145-152)，在该文章中详细给出了该重组古菌组蛋白HPhA的制备过程，基因序列及该蛋白的性质。该重组古菌组蛋白HPhA的基因来源于超嗜热古菌尸;tococcm/wr汰oy/z〃，日本学者于1998年报道了尸少racocctw的全基因组序列，并在它的全基因组序列中预测有古菌组蛋白的开放阅读框PHS051和PHS046,编码两种古菌组蛋白。本实验室钓取超嗜热古菌尸yracoccM/7W7'A:M/n'/中的PHS051基因(Gen誦BankAccessionNo.AP000007),参照古菌组蛋白基因序列和大肠杆菌偏爱密码子表，采用PCR定点突变技术，得到组蛋白基因，克隆到表达载体pETllA，转入大肠杆菌8121-CodonPlus-(DE3)-RIL中，经表达、纯化，得到重组古菌组蛋白一HPhA。HPhA与真核组蛋白在氨基酸的序列上十分相似，但比真核组蛋白要小(真核组蛋白100—140aa，而古细菌组蛋白60aa)，它保留了真核组蛋白的核心结构。HPhA分子既保持了真核生物组蛋白的基本二级及三级结构，而且其分子量小(70aa)、稳定性好、DNA结合及组装(Compact)能力强，因此能够成为比真核生物组蛋白更好的基因药物载体。在本发明中，我们进一步将获赠的pCMV-p53质粒(第二军医大学附属长海医院病理科朱明华教授馈赠，E-mail:mhzhu@smmu.edu.cn，是商品化的质粒)进行了鉴定，结果证实该质粒全长约为8.4kb。根据pCMV-p53的图谱信息，用BamHl酶切此质粒。0.8%琼脂糖凝胶电泳显示酶切结果为2条带，分别约为1.8kb和6.6kb，对应目的基因p53片断和载体DNA。HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物，其由如下方法构建本实验室将获赠pCMV-p53质粒转化到大肠杆菌Eco//JM109中后，进行菌种扩大培养，使用去内毒素的质粒提取试剂盒提取pCMV-p53质粒(具体操作详见使用说明书)，溶于适量的TE缓冲液，质粒浓度为100300ng/ml。将重组古菌组蛋白HPhA溶于转染用1015mM、pH8.0-8.5Tris-HCl缓冲液中配制25mg/mL的溶液，将HPhA溶液以HPhA和pCMV-p53质粒质量比5~10:1逐滴加入到上述浓度为100300吗/ml的pCMV-p53质粒溶液中，室温下，移液枪轻轻吹打混合，避免产生浑浊，室温静置1530min后得到HPhA与pCMV-p53质粒形成的复合物，即HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物。本专利主要进行了HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物的应用及HPhA免疫原性的研究。如实施例2所述，主要通过real-timePCR、Westernblot、XTT、FCM等方法及技术分析外源基因的转录水平和蛋白质表达水平及基因表达产物对癌细胞周期及细胞凋亡的影响，建立了裸鼠肿瘤模型，进行荷瘤裸鼠的体内肿瘤生长情况及肿瘤细胞的凋亡的分析，来检测HPhA携带外源基因进入细胞的效率以及HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物在基因治疗方面的有效性。结果表明，HPhA能携带外源基因pCMV-p53高效转染肿瘤细胞，外源基因表达产物可有效启动细胞凋亡信号转导通路，抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤细胞调亡。因此，HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体系统是十分有效的载体系统，可广泛用于制备治疗鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌等癌症的药物。在临床应用过程中，是否具有免疫原性是探讨该非病毒载体安全性问题的一个重要的方面。为明确重组古菌组蛋白基因药物载体是否具有免疫原性，本专利在实施例3进行了在鼠模型中针对重组古菌组蛋白的体液和细胞免疫应答的研究，检测结果表明，在本专利技术操作条件下，重组古菌组蛋白不刺激小鼠产生抗重组古菌组蛋白抗体，不能诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，免疫原性低、毒性小，是理想的基因药物载体。图1:荧光显微镜观察HPhA/pCMV-p53(wt)复合物形成前后形态的变化；A:40ng/plpCMV-p53(x200);B:HPhA:pCMV-p53(6:1Ww)(x200).图2:核酸电泳检测RT-PCR产物；1、DL2000maker2、CNE细胞未转染pCMV-p53的空白对照组3、CNE细胞单独转染pCMV-p534、CNE细胞转染Lipofectamin/p53复合物5、CNE细胞转染HPhA/p53复合物图3:real-timePCR考察外源p53基因mRNA的表达量；图4:显微镜下观察细胞免疫组化结果；A、转染HPhA/pCMV-p53复合物的CNE细胞的免疫组化染色B、空白CNE细胞的免疫组化染色图5:Westernblot检测外源基因p53蛋白表达结果；1、CNE细胞未转染pCMV-p53的空白对照组2、CNE细胞单独转染pCMV-p533、CNE细胞转染HPhA/p53复合物4、CNE细胞转染Lipofectamin/p53复合物图6:XTT检外源基因p53对细胞生长影响；1、CNE细胞未转染pCMV-p53的空白对照(V)2、CNE细胞单独转染pCMV-p530)3、CNE细胞转染HPhA/p53复合物("4、CNE细胞转染Lipofectamin/p53复合物(—图7:FCM技术分析PI单染检测细胞周期结果；1、CNE细胞未转染pCMV-p53的空白对照2、CNE细胞单独转染pCMV-p533、CNE细胞转染HPhA/p53复合物4、CNE细胞转染Lipofectamin/p53复合物，*p<0.05图8:FCM技术分析AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡的结果；1、CNE细胞未转染pCMV-p53的空白对照组2、CNE细胞单独转染pCMV-p533、CNE细胞转染HPhA/p53复合物4、CNE细胞转染Lipofectamin/p53复合物图9:显微镜下观察皮下种植肿瘤细胞形态；图10:对移植瘤的生长的影响；1、未对移植瘤给药治疗的阴性对照组2、对移植瘤给药pCMV-p53治疗组3、对移植瘤给药HPhA/pCMV-p53复合物治疗组4、对移植瘤给药LipofectamineTM2000/pCMV-p53复合物治疗组图ll:体液免疫检测免疫小鼠血清IgG水平的变化；图12:细胞免疫检测小鼠脾细胞刺激指数；图13:小鼠脾细胞体外刺激后IFN-Y浓度测定。具体实施方案以下叙述本发明的具体实施方案，需要特别指出的是，在本发明的实施方案中，尽管详细叙述了HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物的构建，及此复合物在鼻咽癌治疗方面的应用，但这并不意味着本发明中HPhA只能与pCMV-p53(wt)基因形成载体复合物、只能高效的转导p53基因、形成的基因药物载体复合物只能用于制备对鼻咽癌进行治疗的药物。基因治疗领域中的任何一种治疗基因都可以应用于本专利所述基因药物载体复合物，同时此复合物可以用于包括任何肿瘤性疾病的治疗。实施例l:基因药物载体复合物的构建本实验室将获赠的pCMV-p53质粒转化到大肠杆菌五.co"JM109中后，进行菌种扩大培养，使用购于鼎国生物公司的去内毒素质粒提取试剂盒提取pCMV-p53质粒(具体操作详见使用说明书)，溶于适量TE缓冲液，浓度为200)ig/ml(Cary50测定OD26Q訓与OD28Q腿，根据OD260nm/OD28Qnm数值计算DNA纯度，并根据OD260nm数值计算质粒DNA浓度，OD26Gnm值为1相当于50吗/ml双链DNA)。将重组古菌组蛋白HPhA(本实验室前期工作WengL，FengY，JiX，etal.RecombinantexpressionandcharacterizationofanextremelyhyperthermophilicarchaealhistonefromPyrococcushorikoshiiOT3.ProteinExprPurif.2004，33:145-152.)溶于转染用缓冲液(lOmMTris-HCl，pH8.0)中配制2mg/mL的溶液，将HPhA溶液以HPhA和质粒pCMV-p53质量比6:1逐滴加入到20pL上述质粒pCMV-p53溶液中，室温下，移液枪轻轻吹打混合，避免产生浑浊，室温静置20min后得到重组古菌组蛋白HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物。HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物形态的观察为了检测复合物的形态变化，本专利按照DAPI试剂盒(购于上海杰美生物技术公司)操作说明将DAPI溶液分别加入到上述复合物溶液及对照组pCMV-p53质粒中，室温放置10-20min。用带有360nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察复合物形成前后的形态变化。电镜图片如图l(A)所示，pCMV-p53质粒在荧光显微镜下为短杆状，如图l(B)所示，HPhA与质粒结合后使后者发生凝聚、折叠的现象，与细胞核中组蛋白使DNA发生超螺旋的情况极为相似。由于这种复合物的形成，改变了质粒的拓扑结构，脱氧核糖核酸酶的作用位点可能被包埋，从而降低脱氧核糖核酸酶对质粒的降解作用。这点对基因转染是十分重要的。因为在体内转染中，由于细胞中存在脱氧核糖核酸酶，当质粒进入细胞后，很容易被降解，大大降低了外源基因的表达。HPhA作为基因载体可以很好的解决这一问题。实施例2:重组古菌组蛋白HPhA/pCMV-p53基因药物载体复合物在制备治疗鼻咽癌药物中的应用(一)、重组古菌组蛋白HPhA/pCMV-p53基因药物载体细胞水平研究l.CNE细胞转染(1)HPhA/pCMV-p53DNA转染复合物的制备将实施例l制备得到的HPhA与质粒pCMV-p53复合物32pL，直接加入到1.4mL含有10%小牛血清(购于天津TBD公司)的RPMI1640培养液(购自GIBCO公司)中，并加入CaCl2溶液至终浓度为2mM，形成转染复合物。(2)HPhA/pCMV-p53细胞转染实验组取用10X小牛血清RPMI1640培养液培养好的接种CNE细胞(中国军事医学科学院十一所朱平教授馈赠，是已商品化的细胞)的6孔培养板，轻轻吸去培养液，用PBS缓冲液冲洗一次，再用无血清RPMI1640培养液清洗CNE细胞两次。将步骤(1)中得到的转染复合物1.4mL加入到已经清洗好的CNE细胞培养板中(细胞密度为lxl0V孔)。同时在其它的6孔培养板中设对照组①未转染的CNE细胞、②单独转染与上述实验组含量相同的pCMV-p53质粒的CNE细胞、③转染LipofectamineTM2000/pCMV-p53质粒复合物的CNE细胞，并且pCMV-p53质粒的含量也与实验组相同。实验组和对照组均在37"C，5%C02培养箱中培养4h后，轻轻吸去上清液，再加入2mL含有10X小牛血清的培养基，继续培养48h、72h后应用于如下检测。LipofectamineTM2000/pCMV-p53复合物的制备将按照实施例l方法所得pCMV-p53质粒溶于适量TE缓冲液中，使其终浓度为60(Hig/ml轻轻加入到无血清的RPMI1640培养液中混合均匀，培养液中pCMV-p53的终浓度为400吗/ml，室温静置；再参照LipofectamineTM2000(购自Invitrogen公司)的使用说明，将LipofectamineTM2000轻轻加入到无血清的RPMI1640培养液中混合均匀，室温静置5min;再分别将含Lipofectamine2000与pCMV-p53的上述培养液按2.5:1(v/w)的比例轻轻混合均匀，补加说明书推荐量的无血清RPMI1640培养液轻轻混匀，室温下静置20min，得到LipofectamineTM2000/pCMV-p53复合物。2.检测外源基因p53mRNA的表达水平(1)总RNA的提取使用BBI公司的RNA提取试剂盒(EZ-10SpinColumnTotalRNAIsolationKit)提取转染后培养48hCNE细胞总RNA(具体方法参见使用说明书)，总RNA溶于50pl无RNA酶的双蒸水中，一7(TC保存。(2)逆转录利用primer软件设计引物。wt-p53基因引物序列如下上游引物5'TTTGCGTGTGGAGTATTTGG3'，下游引物5'GTTTTTTATGGCGGGAGG3'，扩增长度为549bp。内参照p-actin引物序列如下上游弓l物5'GGATCAGCAAGCAGGAGTATG3'，下游引物5'CACCTTCACCGTTCCAGTTT3'，扩增长度为225bp逆转录(RT)反应按照TaKaRa公司RT—PCR试剂盒(RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0)操作规程操作，逆转录得到wt-p53的cDNA。电泳检测RT—PCR产物，如图2所示各转染组均出现549bp的特异条带(内参照p-actin为225bp)，说明3种转染方式(转染HPhA/DNA复合物的CNE细胞、转染pCMV-p53质粒的CNE细胞、转染LipofectamineTM2000/DNA复合物的CNE细胞)均可将p53基因导入CNE细胞并在胞内表达，其中以HPhA/DNA导入组基因表达量较高。(3)Real-timePCR扩增反应为了精确定量3种转染方式的转染效果，我们采用real-timePCR技术对胞内p53基因mRNA表达水平进行定量比较。①利用primer软件设计引物。Real-timePCRwt-p53基因引物序列如下上游弓l物5'CCCTCCTCAGCATCTTATCCG3'，下游引物5'GGCACAAACACGCACCTCA3'，扩增长度为262bp内参照P-actin引物序列如下上游引物5'GGATCAGCAAGCAGGAGTATG3'，下游引物5'CACCTTCACCGTTCCAGTTT3'，扩增长度为225bp。②Real-timePCR反应体系灭菌蒸馏水，lO(xL;SYBRPremixExTaqTM，12.5ROXReferenceDye(50x)，0.5pL;上游引物，各0.5pL;下游引物，各0.5pL;cDNA样品，lpL;反应总体积为25pL;③Real-timePCR反应条件95°C10s，95°C60s，60°C30s，进行45个循环后，终止反应。得到各实验组的CT值，总结各组数值绘制图3，从此图中可以看出，HPhA转染组的p53基因mRNA的表达量显著高于lipofectamine转染组和单独pCMV质粒转染组(p<0.05)，说明HPhA的转染效果要明显优于lipofectamine和单独pCMV质粒转染。3.考察外源基因p53蛋白表达水平(1)细胞免疫组化法考察HPhA介导外源基因p53采用DAB显色法(间接细胞免疫染色)作p53蛋白表达分析，实验操作①标本制备PBS洗涤转染的细胞，200g离心5min收集细胞。用PBS适当稀释，制成细胞悬液。在洁净载玻片上滴片使成均匀单层，用冷风彻底吹干。放入湿盒中，4'C冰箱贮存备用。②标本固定玻片置-2(TC甲醇固定7分钟，冰预冷的PBS冲洗，接着于室温下用4%的甲醛(PBS中)处理15分钟。③DAB显色PBS洗涤标本玻片2次x3min;力B1%H202(或1%11202甲醇)抑制内源性过氧化物酶，置室温下1020min;滴加一抗DO-l，每片加入10ul，37°C，1h;PBS洗涤3次x3min;滴加HRP标记的抗体羊抗鼠二抗，室温1h;PBS洗3次x3min;0.04%DAB加入0.03。/。H202显色510min;充分水洗后，显微镜下观察，如图4所示。通过显微镜随机观察5个视野，选择每个视野100细胞，并换算其转染效率为75%。(2)Westernblot考察外源基因p53蛋白的表达①细胞总蛋白的提取制备将转染细胞培养48h后倒掉培养液，并将培养板倒扣在吸水纸上吸千培养液(或将培养板斜立放置一会使残余培养液流到瓶底，然后再用移液器将其吸走)。加入4'C预冷的PBS。轻轻摇动lmin洗涤细胞，然后弃去吸液。重复以上操作两次，共洗细胞三次已洗去培养液。将PBS弃净后把培养板置于冰上。加300uL细胞裂解液，摇匀置于冰上，裂解10min，为使充分裂解培养板要经常来回摇动。充分裂解后，用干净的刮棒将细胞刮于培养板一侧，然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作在冰上进行)。4°C，14，OOOg离心，5min。取上清，分装，冻存于一20。C冰箱。②蛋白浓度测定按照PERICE公司BCA蛋白含量测定试剂盒(BCAProteinAssayKit)说明书操作测定蛋白质含量，采用牛血清白蛋白(BSA)制做标准曲线。③SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):根据常规生物方法按分离胶，浓縮胶的顺序灌注凝胶。将CNE细胞裂解液中加入适量的电泳载样液，10(TC处理5分钟；电泳起始电压为80V，待蛋白电泳带进入分离胶后，电压调整为100V条件下进行。转膜切去浓縮胶，电转缓冲液漂洗电泳胶，平衡15min。剪2块滤纸和一张PVDF膜，大小与电泳胶相同。PVDF膜在100M甲醇中短暂浸泡后，用蒸馏水冲洗，再在电转缓冲液中浸泡平衡30min，滤纸用电转缓冲液浸泡。按以下顺序安装阳极一滤纸一PVDF膜一电泳胶一滤纸一阴极。每放置一层时，均要去除各层间的气泡，以免影响转移效果。稳压15V，电转膜lh。电转膜结束后，用TBS-T漂洗PVDF膜3次，每次室温振荡5min。⑤免疫结合封闭——将上述PVDF膜放于平皿中，加入约20mL封闭液，室温轻轻振荡12h。用TBS-T漂洗PVDF膜3次，每次室温振荡5min。一抗——封闭结束后，PVDF膜放入一杂交袋中，其中加入鼠抗人p53抗体溶液(1:1000稀释)，去除气泡，封口，室温振荡2h。用TBS-T漂洗PVDF膜3次，每次室温振荡5min。二抗——PVDF膜加入另一杂交袋中，其中加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(1:5000稀释)，去除气泡，封口，室温振荡2h。用TBS-T漂洗PVDF膜3次，每次室温振荡5min。⑥显色用TBS-T漂洗PVDF膜3次，每次室温振荡5min。将PVDF膜移入TMB显色液中，室温避光。观察显色反应，当条带达到所需浓度时(13min)立刻用水洗PVDF膜终止反应，扫描。结果如图5所示，表明在上样量一致时，HPhA/p53转染组p53蛋白表达量明显高于质粒单独转染和lipofectamine/p53转染组。可见作为基因药物载体HPhA有效介导外源基因转染、表达，同时HPhA较之LipofectamineTM2000更能高效介导wt-p53基因的转染、表达。4.XTT考察外源基因产物对细胞生长的影响(1)接种培养细胞利用消化液将生长状态良好的CNE细胞株消化，用含10。/。胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔2xl04个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔体积200^L;将细胞培养板移入C02培养箱中，在37'C，5%C02条件下，培养24小时，使细胞贴壁。(2)细胞转染移去RPMI1640细胞培养液，分别加入约1.4mLHPhA/pCMV-p53(6:lw/w)的转染复合物，同时设对照组①未转染的CNE细胞、②单独转染与上述实验组含量相同的pCMV-p53质粒的CNE细胞、③转染LipofectamineTM2000/DNA复合物的CNE细胞，在37。C，5%C02条件下，培养4小时后；更换为10%胎牛血清的RPMI1640培养液。(3)呈色反应每隔24h，取一组细胞培养板，按照Roche公司cellproliferationkitII试剂盒说明，将溶液I和溶液II按50:1(v/v)混匀后，以每孔50pL混合液加入96孔细胞培养板中，37°C，5XC02培养箱中染色2h。(4)比色于490nm波长下，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横坐标，以OD4卯nm值为纵坐标绘出各组细胞的生长曲线。由图6可见，经转染wt-p53基因后，细胞生长曲线各时间点上细胞数有显著性差异。细胞生长在第一天，各组无明显差别；各组细胞生长在第2天开始出现抑制作用差别，第4天这种抑制作用更加显著，与未转染的空白对照组细胞相比，单独转染p53组、HPhA/p53组和Lipofectamin/p53组的细胞抑制率分别为31.2%、64.1%和53.7%。XTT检测证实不同的转染p53基因方式，对细胞生长作用有较大差异。HPhA介导的wt-p53基因表达质粒转染效率明显高于LipofectamineTM2000/p53和单独pCMV-p53质粒转染，可见作为基因药物载体HPhA有效介导外源基因转染、表达，同时HPhA较之LipofectamineTM2000更能高效介导wt-p53基因的转染、表达。5.考察外源基因产物对细胞周期的影响(1)PI单染色检测细胞周期将转染后的细胞培养72h后，消化，冷PBS洗涤细胞两次，制备单细胞悬液，血球计数板法计数细胞，约为2xl(^个/ml。PBS洗涤细胞，去上清，加入预冷的70%乙醇，4'C过夜。离心去除固定液，PBS重悬细胞，洗涤两次，离心除去PBS。加入lmlPI染液，4°C，避光30min。上流式细胞仪检测。检测结果如图7所示，转染wt-p53基因可以有效的抑制CNE细胞的增殖、诱导细胞凋亡。同时，从细胞周期分布可看出HPhA介导的wt-p53基因转染效率高于单独wt-p53基因的转染效率。这可能是由于质粒DNA与HPhA形成复合物后，更容易进入靶细胞中，而且对质粒有保护作用，使质粒不容易被细胞内各种酶类降解。说明HPhA可以作为基因载体介导转染，在介导体内转染时，效果明显优于裸DNA的转染，具有很好的应用前景。(2)AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡将转染后的细胞培养72h后，先将细胞培养液置于离心管，3000rpm,5min，彻底去上清，收集细胞。再用冷PBS洗涤转染细胞两次，加入0.25%胰酶消化液，置37t)5min。弃培养液，加入新培养液，反复轻微吹打。在细胞从培养瓶表面脱落后，将细胞转移到离心管，3000rpm，5min，彻底去上清。将2次离心，所得细胞沉淀混合。用PBS洗涤细胞两次，离心3000rpm，5min，收集细胞。用500pL的lxBindingbuffer染色缓冲液重悬细胞，浓度为"106个/ml。加入lpLAnnexinV-FITC(购自南京凯基生物技术公司)混匀后，再加入5pLPI(购自北京鼎国生物技术公司)，混匀，室温避光5min。上流式细胞仪检测。同时以不AnnexinV—FITC及PI的一管作为阴性对照。平行三次实验，取平均。检测结果如图8所示，HPhA/p53组、Lipofectamine/p53组以及裸DNA组均可体外转染p53基因，诱导CNE细胞凋亡，其细胞凋亡率均高于对照组(p<0.05)。HPhA/p53组所诱导的细胞凋亡率较高，是Lipofectamine/p53组的1.5倍。采用非病毒载体HPhA将p53基因导入肿瘤细胞，进而恢复程序性死亡的信号，使肿瘤细胞发生凋亡而达到治疗肿瘤的目的，这是肿瘤基因治疗的有效手段。(二)、重组古菌组蛋白HPhA与质粒pCMV-p53基因药物载体在动物体内实验研究l.裸鼠肿瘤模型的建立裸鼠在吉林大学中日联谊医院实验动物中心恒温(25-27°C)、恒湿MO-SOX)和无特殊病原菌(specificpathogenfree,SPF)条件下饲养。观察裸鼠皮色光亮，活波好动，无体重减轻，进食水均正常，无其它异常病态表现，开始构建裸鼠肿瘤模型。(1)细胞准备将长满瓶底的CNE细胞，0.25%胰蛋白酶消化液，37'C消化5min，倒掉消化液，用含10X血清的RPMI1640培养液终止消化，用无菌生理盐水悬浮细胞后，2000rpm，离心10min，弃上清。用无菌生理盐水洗涤细胞2次，无菌生理盐水重新悬浮细胞，取少量细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，加入无菌生理盐水至细胞终浓度为lx107/1111。(2)接种细胞以酒精消毒裸鼠背部皮肤，用无菌lml注射器抽取上述处理的CNE细胞悬液，穿刺针头在皮下穿行一段后，避免刺破皮肤或刺破肌肉层，接种于裸鼠右侧肩胛区皮下，每只注射200pl。继续在SPF条件下饲养。在细胞接种后7—10天可在接种部位发现肉眼可见的肿块。2.荷瘤裸鼠成瘤实验裸鼠成瘤后随机分组实验将24只裸鼠随机分为4组A组为对照组、B组为pCMV-p53转染组、C组为HPhA/pCMV-p53转染组、D组为LipofectamineTM2000/pCMV-p53转染组，每组6只裸鼠。各组瘤内注射转染复合物，每隔5天一次，连续6次。并在末次给药后，继续观察20天。同时用游表卡尺测量瘤体，根据公式V=axb2/2，绘制肿瘤生长曲线，如图10所示。正常对照组瘤体可见增长迅速，其余组别瘤体增长缓慢。3.免疫组化法检测皮下种植瘤细胞形态颈椎脱臼处死荷瘤裸鼠，取出移植瘤，10%中性福尔马林固定，石蜡切片，4pm切片。(1)切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗二甲苯(I)5min—二甲苯(II)5min—100X乙醇2min—95X的乙醇lmin—80X乙醇lmin—75%乙醇lmin—蒸馏水洗2min。(2)苏木素染色5min，自来水冲洗。(3)盐酸乙醇分化30s(提插数下)，自来水浸泡15min或温水(约5(TC)5min。置伊红液2min。(4)常规脱水，透明，封片95%乙醇(I)min—95%乙醇(II)lmin—100%乙醇(I)lmin—100%乙醇(II)lmin—二甲苯石碳酸(3:1)lmin—二甲苯(I)lmin—二甲苯(II)lmin—中性树脂封固。镜检如图9所示，结果表明肿瘤组织石蜡包埋后苏木素染色，病理学检査验证皮下种植肿瘤，可见癌细胞大小形态不一，异性明显，极性紊乱，核分裂相多见。4.TUNEL法检测原位细胞凋亡TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒(购自美国Roche公司)是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。实验步骤按美国Roche公司细胞凋亡原位检测试剂盒说明进行操作。结果判定阳性结果细胞核呈棕黄色。400倍高倍显微镜下，随机观察5个视野，每个视野计数200个细胞，计数细胞核染色呈棕黄色的阳性细胞所占的百分数，计算其平均值即为AI(apoptoticindex)。统计学分析所得数据均以均数±标准差(X±S)表示。分析结果如表l，显示HPhA/p53治疗组的凋亡指数高于其它两种转染方式的治疗组和对照组。结果表明HPhA介导wtp53转染到体内，高效表达，调节细胞周期调控元件，抑制肿瘤恶性生长。有研究发现动物导入野生型p53基因具有旁观者效应。在肿瘤发展阶段，可以通过自分泌途径形成促血管生成因子，刺激营养血管在瘤体实质内增生，而p53基因的突变或缺失又导致新生血管生成，有利于肿瘤的快速生长。导入野生型p53基因后，补偿体内抑癌基因的缺失，使p53蛋白发挥功能，上调血管生成抑制基因的表达，抑制肿瘤血管形成，同时抑制肿瘤细胞的生长或引起细胞凋亡。表l:TUNEL法获得原位细胞凋亡指数(AI)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例3:重组古菌组蛋白免疫原性的研究1.免疫方案及免疫血清的制备将昆明种小鼠随机分成3组，每组6只。第l组为重组古菌组蛋白组(HphA),剂量为25pg/只；第2组为重组古菌组蛋白辅以弗氏完全佐剂组(购于鼎国生物)，剂量为25pg/只；第3组为牛血清白蛋白佐剂组(BSA-AA)，剂量为50pg/只，辅以弗氏完全佐剂。间隔2周腹腔注射免疫，共免疫5次。分别于初次免疫后第2、4、6、8、10和12周通过眼眶采血制备血清。收集的血液于1.5mLEP管内，37°C，放置30min;4。C放置过夜后；4°C，5000r/min，离心20min，收取血清，-80匸保存备用。2.体液免疫检测间接ELISA方法测定小鼠血清中总IgG含量.用lng/mL重组古菌组蛋白包被96孔酶标板，,L/孔，4'C，12h;PBS洗涤3次；5%脱脂奶粉封闭，37°C，2h;取出-8(TC冻存的小鼠血清，融化，梯度稀释，加入经上述处理的96孔酶标板中，同时做阴性对照(免疫前小鼠血清)，37°C，lh;PBS洗涤3次；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1:5000)，100nL/孔，37°C,lh;PBS洗涤3次；加入酶底物TMB溶液，100pL/孔，37°C，避光放置20min;加入50pL，2MH2S04终止反应。于ThermoLabsystem354型microplatereader上测量OD450nm值。以免疫前血清作为阴性对照，P/N〉2.1者判为阳性。表2:小鼠体液免疫应答诱导产生的抗体<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>从图ll中所示的检测结果可以看出，各实验组免疫小鼠产生的体液免疫应答有较大差别。从表2.可以看出，在各个时间点上，重组古菌组蛋白组免疫小鼠中未检测出特异性抗体。重组古菌组蛋白佐剂组在6、8和12周，检测出l只免疫小鼠血清中有特异性抗体。而牛血清白蛋白佐剂组，在初次免疫后第2周，检测出有3只免疫小鼠血清中有特异性抗体，在第4周，全部免疫小鼠的血清中均检测出特异性抗体。这表明，重组古菌组蛋白免疫小鼠可相对于实验对照组，其体液免疫作用较差。3.细胞免疫检测(1)小鼠脾细胞悬液的制备将小鼠颈椎脱臼处死，置于75%的酒精中浸泡消毒。以无菌手续取小鼠脾脏，置无菌平皿内，在200目和400目不锈钢丝网上过滤，得到单个脾细胞悬液。采用Tris-NH4Cl(pH7.4)去除脾细胞悬液中的红细胞，并用RPMI1640培养液洗涤2次。细胞浓度用含有10%FBS的RPMI1640调整至lxlO々mL。(2)刺激指数的测定于96孔平底培养板中加上述淋巴细胞悬液200pL/孔。分别加入重组古菌组蛋白或牛血清白蛋白(刺激组)，10%FBS的RPMI1640(非刺激组)，于37°C、5%C02培养箱中培养72h。培养结束前4h，轻轻吸取上清液5(HtL，同时加入lmg/mLMTT溶液，50pL/孔，振荡器上振荡lmin，继续培养4h。培养结束后，每孔加入10(^LDMSO，震荡混匀，使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测各孔OD570nm值，计算刺激指数(SI)作为判断淋巴细胞增殖程度的指标，计算方法为SI-实验组A值/阴性对照组A值，SI大于2者为阳性。检测结果如图12所示。可看出，牛血清白蛋白组产生细胞免疫应答(SI>2)，其余两组对细胞免疫应答的作用不明显。这表明，从淋巴细胞的体外增殖能力来看，重组古菌组蛋白免疫小鼠后未产生细胞免疫应答。(3)脾细胞分泌IFN-Y水平测定取(2)培养淋巴细胞上清液，测IFN-Y水平，按小鼠IFN々定量免疫检测试剂盒(R&DSYSTEMS公司)说明书进行操作。结果如图13所示，牛血清白蛋白组小鼠脾细胞分泌的IFN-Y浓度明显高于未刺激组，差异有统计学意义(P<0.05)。而其余两组小鼠脾细胞分泌的IFN-Y与未刺激组比较，IFN-Y浓度有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。这表明，从脾细胞分泌IFN-Y水平来看，重组古菌组蛋白免疫小鼠后，不能产生细胞免疫应答，这一结果与淋巴细胞的体外增殖能力结果相一致。这表明重组古菌组蛋白HPhA具有可以作为一类低免疫原性、无毒的非病毒载体而应用于肿瘤疾病的基因治疗的应用潜力。权利要求1、重组古菌组蛋白HPhA在用作基因药物载体方面的应用。2、如权利要求1所述的重组古菌组蛋白HPhA在用作基因药物载体方面的应用，其特征在于利用重组古菌组蛋白HPhA与pCMV-p53质粒，构建HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物。3、如权利要求2所述的重组古菌组蛋白HPhA在用作基因药物载体方面的应用，其特征在于将重组古菌组蛋白HPhA溶于转染用10~15mM、pH8.0~8.5Tris-HCl缓冲液中配制2~5mg/mL的溶液，将上述HPhA溶液以HPhA和pCMV-p53质粒质量比5~10:1逐滴加入到质粒浓度为100300ng/ml的TE缓冲液溶液中，室温下，移液枪轻轻吹打混合，避免产生浑浊，室温静置15~30min后得到HPhA/pCMV-p53(wt)基因药物载体复合物。4、如权利要求3述的重组古菌组蛋白HPhA在用作基因药物载体方面的应用，其特征在于用于制备抗癌药物。5、如权利要求4述的重组古菌组蛋白HPhA在用作基因药物载体方面的应用，其特征在于用于制备治疗鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌或肝癌神经胶质瘤的药物。6、如权利要求5述的重组古菌组蛋白HPhA在用作基因药物载体方面的应用，其特征在于用于制备治疗鼻咽癌的药物。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种来自超嗜热古菌Pyrococcushorikoshii的重组古菌组蛋白HPhA作为基因药物载体的应用，以及HPhA与质粒pCMV-p53(wt)形成的基因药物载体复合物在用于制备治疗鼻咽癌药物方面的应用。通过对重组古菌组蛋白在鼠模型中体液免疫和细胞免疫应答的研究，表明重组古菌组蛋白具有较低的免疫原性，是理想的基因药物载体。同时实验结果表明，HPhA能携带外源基因pCMV-p53高效转染肿瘤细胞，外源基因表达产物可有效启动细胞凋亡信号转导通路，抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤细胞调亡。该基因药物载体系统可广泛用于制备治疗鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌等癌症的药物。文档编号A61K48/00GK101168065SQ20071005628公开日2008年4月30日申请日期2007年11月7日优先权日2007年11月7日发明者万艾玲,雁冯,李媛媛,蕊王申请人:吉林大学