专利名称：一种细菌阿魏酸脱羧酶基因及其晶体结构的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌阿魏酸脱羧酶基因及其晶体结构，属分子生物学和应用微生物学技术领域。
背景技术：
阿魏酸(4-羟基-3甲氧基-2-丙烯酸)是一种广泛存在植物界的羟基肉桂酸，是麦麸中含量最高的酚酸，可达其干重0.5～1％。它主要通过酯键与多糖和木质素交联，或自身酯化或醚化形成二阿魏酸。许多植物、真菌、细菌、放线菌、微藻等能将阿魏酸分解生成香兰素，阿魏酸作为生物转化生产香兰素的前体物质，具有易得、价廉以及对微生物的毒性较小等优点，因此对以阿魏酸为前体物质转化生成香兰素的代谢途径的研究具有很大的理论意义和生产价值。
香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，又名香草醛，是一种重要的广谱型香料之一，香气幽雅、爽快，可直接应用于化妆品、香烟、糕点、糖果以及烘烤食品等行业，也可用作植物生长促进剂、杀菌剂、润滑油消泡剂等。香兰素是重要的有机合成中间体，在国内香兰素主要应用于食品添加剂，近几年来在医药领域的应用被不断拓宽，已成为香兰素最有发展潜力的应用领域。除此外，它还可在电镀工业中用作上光剂，农业中用作催熟剂等。
在阿魏酸代谢生成香兰素的途径中，阿魏酸脱羧酶催化阿魏酸生成4-乙基愈创木酚，是阿魏酸代谢形成香兰素的关键酶。另外4-乙烯基愈创木酚作为一种感觉阈值极低的物质，能产生一种特别的酚类物质的香气。这种物质能提高食品的感官品质，对酒、食品，饮料的自然香气也有很大影响。
以往对以阿魏酸为底物转化形成香兰素的研究主要集中于代谢途径方面，目前一些主要的代谢途径已经逐渐的被报道。然而参与细菌Enterobacter sp.Px6-4催化阿魏酸形成4-乙基愈创木酚的脱羧酶的基因还没有被报道。为了更加深入的了解Enterobacter sp.Px6-4中阿魏酸脱羧酶的结构与功能之间的关系，本发明通过基因克隆、表达和悬滴扩散结晶方法获得了阿魏酸脱羧酶的晶体，并通过X-衍射方法对阿魏酸脱羧酶的晶体结构进行了解析。经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容
本发明从能够转化阿魏酸形成4-乙基愈创木酚和香兰素的细菌Enterobacter sp.Px6-4中克隆得到阿魏酸脱羧酶的编码基因。该菌株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国，北京中关村；保藏日期2007年4月12日；保藏号CGMCC No.1999。
本发明的目的是通过基因克隆的方法扩增得到细菌Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶的编码基因，在大肠杆菌E.coli中表达，并运用悬滴扩散法得到阿魏酸脱羧酶的蛋白质结晶，并通过X-衍射方法对该酶的结构及活性中心进行了解析。为进一步研究阿魏酸脱羧酶的结构和功能之间的关系以及改变4-乙烯基愈创木酚产量提供理论上的指导。
1.本发明中从细菌Enterobacter sp.Px6-4中克隆得到阿魏酸脱羧酶的编码基因，并在大肠杆菌E.coli中成功表达的方法包括如下步骤 1)本发明根据GenBank(国际核苷酸序列数据库，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上报道的6条细菌来源的羟基肉桂酸脱羧酶的基因序列(AF017117，AJ276891，AJ27863，AJ492219，U63827 and X84815)设计了一对简并引物PS和Px2(表1)用于扩增阿魏酸脱羧酶的保守序列。
2)依据该保守片段设计了6条特异性引物PxT31，PxT32，PxT33，PxT51，PxT52，PxT53(表1)，并应用DNA Walking SpeedUpTM Premix试剂盒扩增得到Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶保守序列两端的未知序列。
3)通过DNAman生物学软件进行拼接获得Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶的全长编码基因序列(详见阿魏酸脱羧酶基因序列表)。
4)依据Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶的全长编码基因序列设计了特异性Px1e和Px2e(表1)用于扩增Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶编码序列。
表1.本发明所用到的引物序列
5)将PCR产物用EcoR I和Hind III进行双酶切，回收纯化酶切后的小片段并与经EcoR I和Hind III双酶切后的pET-28a连接，构建表达载体。
6)将构建好的表达载体转化E.coli BL21；经IPTG诱导后，E.coli BL21大量表达有活性的阿魏酸脱羧酶。
7)经过亲和层析柱、阴离子柱、疏水柱纯化后，获得阿魏酸脱羧酶的纯酶。
2.本发明中阿魏酸脱羧酶的晶体结构和活性中心的确定方法 1)将纯化的阿魏酸脱羧酶浓缩至10mg/mL后，通过悬滴结晶法于0.1M HEPES(pH7.3)、26％w/v PEG10,000的结晶条件下获得阿魏酸脱羧酶的结晶。
2)将纯化的阿魏酸脱羧酶浓缩至10mg/mL与7mM的阿魏酸钠混合，通过悬滴结晶法于0.1M HEPES(pH7.3)、26％w/v PEG10,000的结晶条件下获得阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠复合体的晶体。
3)收集并分析步骤1)中得到的阿魏酸脱羧酶晶体的X射线衍射数据，获得阿魏酸脱羧酶的电子密度。
4)收集并分析步骤2)中得到的复合体的晶体的X射线衍射数据，获得与阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠结合的电子密度。
5)以步骤3)中获得的阿魏酸脱羧酶的电子密度为基础，获得阿魏酸脱羧酶精细三维结构。
6)以步骤4)中得到的阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠结合的电子密度，获得阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠复合体的精细三维结构，从而确定了阿魏酸脱羧酶的活性中心 步骤3)和4)中晶体的X射线衍射数据收集与整理可采用如下方法 首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从晶体浸泡液中获取浸泡一定时间(浸泡时间控制在2—48小时之间)的晶体，并迅速使用Rigaku公司的冷却系统或Oxford Cyrosystem公司的冷却系统，将晶体在以上所述的两种冷冻系统产生的低温氮气流中冷冻至零下150℃—180℃；使X射线通过晶体，使用旋进法收集X射线衍射数据。
在收集到晶体的X射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理 首先，使用HKL2000等(包括Mosflm、D*trek等)衍射数据处理程序包等常用的数据处理的方法，对收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件。
其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep等各种分子置换(MolecularReplacement)程序等本领域已知的常用的数据处理方法，利用分子置换(MolecularReplacement)的方法，以酚酸脱羧酶晶体结构(PDB code2P8G)为初始模型，得到阿魏酸脱羧酶的精细三维结构；以阿魏酸脱羧酶的母体晶体结构为初始模型，得到阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠复合体的精细三维结构。
本发明发现阿魏酸脱羧酶的总体结构的特征为阿魏酸脱羧酶的单体结构的分辨率为
呈圆筒形，总尺寸为
由9股β折叠股、2个α螺旋和3段η螺旋构象构成；每一个单体分子又分为三部分即中心部分、螺旋状的底部和C末端延伸；其中，中心部分从β折叠股1到β折叠股8和β折叠股9，这九股反平行的β折叠股环绕形成了末端开口的β桶状结构；螺旋状底部由α螺旋构象1、α螺旋构象2和η螺旋构象1、η螺旋构象2构成；C末端延伸是位于β折叠股9之后的一段长卷曲，其中η螺旋构象2位于卷曲的中部。本发明发现阿魏酸脱羧酶底物结合位点(活性中心)其特征为底物类似物阿魏酸钠结合到阿魏酸脱羧酶β桶状结构中心的中部和螺旋状的底部；在它半开式的底部，β折叠股8、β折叠股9和位于β折叠股1和β折叠股2、β折叠股3和β折叠股4之间的发夹结构构成的残基形成了一个相对疏水的底物结合口袋；位于β折叠股1和β折叠股2、β折叠股3和β折叠股4之间的发夹结构在底物结合口袋的前面担当了两扇门板的作用，我们在此将其命名为门板1和门板2；位于第25位的色氨酸担当了门锁的功能；在底物结合口袋关闭的状态下，门板1和门板2朝向β折叠股9移动约5
将口袋关闭并且将底物与接触反应的中心隔开；在底物结合口袋开启的状态下，门板1门板2移开将口袋从关闭的形式变为开放的形式；在开放的状态下，底物结合中心形成一个8×8×15
的口袋，有利于底物进入活性中心。
为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的具体实施例。下述实施例仅仅是用于解释本发明，而不应当理解为以任何方式限制本发明范围。
图1.是阿魏酸脱羧酶在大肠杆菌E.coli的表达和纯化电泳图谱。M蛋白质分子量标准；Lane 1无IPTG诱导的总蛋白质；Lane 2IPTG诱导的总蛋白质；Lane 3用Ni-chelating column洗脱的蛋白质；Lane 4用Resource Q column洗脱的蛋白质；Lane 5用HiLoad 16/60 Superdex column纯化的阿魏酸脱羧酶。
图2.阿魏酸脱羧酶的单体结构。阿魏酸脱羧酶的单体结构为桶状结构，大小为
图3.是阿魏酸脱羧酶和阿魏酸钠复合物的晶体结构图。A.阿魏酸脱羧酶的底物结合位点；B.阿魏酸钠和阿魏酸脱羧酶相互作用的氨基酸分子。
具体实施例方式 1.细菌基因组DNA的提取 1)将Enterobacter sp.Px6-4接种于液体LB培养基，37℃、200rpm培养12小时； 2)取1mL的培养物12000rpm离心2分钟，去掉上清； 3)沉淀用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA，pH8.0)洗两次； 4)用567μL的TE缓冲液重悬后加入30μL SDS(10％)和15μL蛋白酶K(20mg/mL)，混均后于37℃温浴1小时； 5)依次加入100μL NaCl(5M)、80μL的CTAB/NaCl(10％CTAB，0.7M NaCl)，混均后于65℃温浴10分钟； 6)加入700μL的苯酚氯仿异戊醇(25241v/v)颠倒数次混均后5000rpm离心5分钟； 7)将上清移至一个新的EP管中加入0.6倍体积的异丙醇，4℃、12000rpm离心10分钟； 8)沉淀用70％的乙醇洗两次，真空干燥5分钟后，用50μL的去离子水将沉淀溶解。
2.Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶保守序列的获得 1)PCR扩增体系 10 x Pfu Buffer 5μL dNTP Mixture 1μL PS(10μM) 1μL P x 2(10μM) 1μL Template <1μg Pfu DNA Polymerase(5u/μL) 0.5μL dH2O 50μL 2)PCR 反应程序 95℃ 5.5min1个循环 94℃1min 56℃40sec 72℃2min35个循环 72℃10min 1个循环 4℃ ∞ 1个循环 3)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶保守序列的纯化回收方法见百泰克生物公司胶回收试剂盒说明书 4)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶保守序列和载体pMD18-T连接 连接体系 SolutionI 5μL 回收的目的片段 4μL pMD18-T vector 1μL 16℃水浴过夜连接 5)重组质粒转化E.coli DH5α a.从-70℃冰箱中取出100μL感受态细胞悬液放在冰上进行解冻； b.加入连接产物，冰上放置30分钟；42℃水浴中热击90秒，热击后速置于冰上冷却3-5分钟； c.向管中加入0.8-1mL LB液体培养基，混均后37振荡培养1小时； d.菌液8000rpm离心1分钟，弃大部分上清，留约100μL菌液涂布于Amp筛选平板上，正面向上放置30分钟后37℃倒置培养10-20小时。
6)目的片段的克隆子培养液送测序公司测序 3.Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶基因全长序列的获得 1)应用DNA Walking SpeedUpTM Premix试剂盒扩增得到阿魏酸脱羧酶保守序列两端的未知序列，具体方法参见试剂盒的说明书。
2)扩增产物的回收、连接和测序，方法同上。
3)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶全长序列利用DNAman生物学软件进行拼接得到阿魏酸脱羧酶的全长序列(具体序列见附件1)。
4.Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶编码区序列的扩增 1)阿魏酸脱羧酶编码序列的扩增利用特异性P x 1e和P x 2e(表1)扩增得到Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶编码序列，具体方法同上。
2)扩增产物的回收、连接和测序，方法同上。
5.构建带有Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶编码区序列的重组质粒 1)阿魏酸脱羧酶编码序列的酶切处理，利用限制性内切酶EcoR I、Hind III酶切处理PCR扩增产物和载体pET-28a。
酶切体系 EcoR I 2.5μL Hind III2.5μL 编码区序列/pET-28a 30μL dd H2O 15μL 10 x Buffer M 5μL 37℃温浴6小时 2)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶编码序列与酶切处理后的pET-28a的连接。
连接体系 编码区序列 3μL pET-28a2μL 连接酶 5μL 3)重组质粒的转化和筛选方法同上。
6.阿魏酸脱羧酶在E coli BL21中的诱导表达 1)带有Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脱羧酶编码区序列的重组质粒转化E.coliBL21。
a.从-70℃冰箱中取出100μL感受态细胞悬液放在冰上进行解冻； b.加入连接产物，冰上放置30分钟；42℃水浴中热击90秒，热击后速置于冰上冷却3-5分钟； c.向管中加入0.8-1mL LB液体培养基，混均后37℃振荡培养1h；菌液8000rpm离心1分钟，弃大部分上清，留约100μL菌液涂布于Amp筛选平板上，正面向上放置30分钟后37℃倒置培养10-20小时。
2)IPTG诱导阿魏酸脱羧酶异源表达 a.LB平板过夜活化菌种；LB液体活化37℃、180rpm培养3小时； b.按1％接种量转接液体LB37℃、180rpm培养3小时后加入0.2mM的IPTG后30℃、200rpm过夜诱导。
7.阿魏酸脱羧酶的纯化 1)活化种子 a.以带有重组质粒的E.coli BL21作为种子； b.平板上活化的种子转接于50mL液体LB培养基，37℃、200rpm摇3小时，按3％的接种量转接1L的液体LB培养基，37℃，200rpm摇大约2小时，加入IPTG终浓度为0.2mM，30℃，200rpm过夜诱导； c.8000rpm离心20分钟收集菌体，用50mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)，洗两次； d.以1L发酵液用30mL的50mM、Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)的比例重悬。
2)超声波破碎获得粗酶液 将细胞重悬液放置于冰上，以50％的频率，超声8秒后停12秒的条件超声破碎约20分钟，直到完全清亮为止。
3)粗酶液过亲和层析柱 a.选择镍柱作为亲和层析柱； d.用50mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)将柱子平衡后上样； c.继续用50mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)将位与柱子结合的杂质冲去； d.用50mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)+100mM咪唑洗脱，收集洗脱液。
4)洗脱的酶液透析处理 将洗脱的酶液装入透析袋中，用20mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)作为透析液，放置于冰上透析处理24小时。
5)透析后的酶液过阴离子柱 a.用20mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)将柱子平衡后上样； d.继续用20mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)将位与柱子结合的杂质冲去； c.继续用缓冲液1M NaCl+20mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)作梯度洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液。
6)含有目的蛋白的洗脱液过疏水柱 a.将过阴离子柱后含有目的蛋白的洗脱液中加入0.5M的硫酸铵； d.用0.5M的硫酸铵加50mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)将柱子平衡后上样； c.继续用0.5M的硫酸铵加50mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)将位与柱子结合的杂质冲去； d.用50mM的Tris-Hcl缓冲液(pH7.0)作梯度洗脱后，用去离子水洗脱收集含有目的蛋白的洗脱液。
7)SDS电泳分析阿魏酸脱羧酶的纯度，实验结果见附图1。
8.纯化后的阿魏酸脱羧酶结晶及结构分析 1)阿魏酸脱羧酶结晶 a.将纯化后的阿魏酸脱羧酶浓缩到10mg/mL； b.在10mL的注射器中填入硅油； c.在每个培养孔边上画一个2mm宽的硅油圈； d.在组织培养板的培养孔中加入400μL的0.1M HEPES(pH7.3)+26％w/v PEG10,000缓冲液； c.将盖玻片放在干净的滤纸上，只接触其边缘； d.用加样器在盖玻片上点0.5μL缓冲液和0.5μL蛋白质溶液； e.用镊子夹住盖玻片边缘，将其翻转，使液滴悬垂在盖玻片下； f.置盖玻片于培养板相应的孔上，保证盖玻片边缘将孔密闭； g.用手指将盖玻片均匀而有力的压合在孔上； h.轻柔的盖上盖子，置于16℃储藏。
2)阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠共结晶 a.将纯化后的阿魏酸脱羧酶浓缩到10mg/mL； b.在10mL的注射器中填入硅油； c.在每个培养孔边上画一个2mm宽的硅油圈； d.在组织培养板的培养孔中加入400μL的0.1M HEPES(pH7.3)+26％w/v PEG10,000缓冲液； c.将盖玻片放在干净的滤纸上，只接触其边缘； d.用加样器在盖玻片上点0.5μL缓冲液、0.5μL的7mM阿魏酸钠、0.5μL蛋白质溶液； e.用镊子夹住盖玻片边缘，将其翻转，使液滴悬垂在盖玻片下； f.置盖玻片于培养板相应的孔上，保证盖玻片边缘将孔密闭； g.用手指将盖玻片均匀而有力的压合在孔上； h.轻柔的盖上盖子，置于16℃储藏。
3)阿魏酸脱羧酶晶体结构数据的收集及结构解析 通过悬滴扩散法获得阿魏酸脱羧酶的晶体，阿魏酸脱羧酶母体结构数据在100K的低温条件利用同步辐射装置Mar165 CCD探测器收集数据。衍射数据应用HKL2000软件包进行处理。阿魏酸脱羧酶的晶体结构以酚酸脱羧酶的晶体结构(PDB编号为2P8G)作为搜索模型应用PHASER程序通过分子置换来获得初始相位。阿魏酸脱羧酶结晶属于P21空间组，在晶胞不对称单元(unit)内包括两个单体分子。
4)阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠的复合晶体结构数据的收集及结构解析 阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠复合结晶的结构以阿魏酸脱羧酶的母体结构作为搜索模型，应用PHASER程序通过分子置换来获得初始相位。阿魏酸钠和脱羧酶的结合参照1Fo-Fc电子密度图进行构建。并应用软件COOT和Refmac根据2Fo-Fc和1Fo-Fc电子密度图对结构进行最终的手工重新构建和修正。在随后的位置修正、约束的不严格(restraints were relaxed)和体积溶剂的修正通过Rfree的指导来实现。模型几何学的修正用了PROCHECK程序。溶剂分子的定位依据于在σA-weighted Fo-Fc差值电子密度图上的立体化学的合理的峰值。阿魏酸脱羧酶晶体结构和复合物晶体结构的衍射数据见表2。阿魏酸脱羧酶与阿魏酸钠复合晶体结构见附图2。
表2.晶体衍射数据的收集和修正
aRmerge＝∑h∑1|Iih-<Ih>|/∑h∑I<Ih>，<Ih>是观测值的平均Iih的参照h bRwork＝∑(||Fp(obs)|-|Fp(calc)‖)/∑|Fp(obs)|；Rfree指没有包括在优先细化的衍射点抽取子集(5％)后的R因子 c圆括号中的值表示相应的最高分辨率的数值. 9.阿魏酸脱羧酶的应用 本发明克隆、表达、纯化的阿魏酸脱羧酶能快速、高效的分解阿魏酸使之生成其脱羧产物4-乙烯基愈创木酚。通过酶作用获得的产物符合欧洲经济共同体(EEC)对天然产品的要求。
本发明通过X-射线衍射方法解析了阿魏酸脱羧酶的三维结构，并且通过对阿魏酸脱羧酶和阿魏酸钠的共结晶的衍射结果确定了该酶的底物结合位点和活性中心，这些晶体结构学上的数据能全方位的反映该酶的氨基酸间构象，为阿魏酸脱羧酶的结构改造提高4-乙烯基愈创木酚产量提供理论上的指导，具有良好的应用前景。
本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。
阿魏酸脱羧酶基因[1][1].ST25
SEQUENCE LISTING
<110> 云南大学
<120> 一种细菌阿魏酸脱羧酶基因及其晶体结构
<130> 01
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 930
<212> DNA
<213> Enterobacter sp.Px6-4
<220>
<221> fad gene
<222> (100)..(606)
<223>
<220>
<221> promoter
<222> (8)..(57)
<223>
<400> 权利要求
1、一种细菌阿魏酸脱羧酶基因，其特征在于阿魏酸脱羧酶编码基因的核苷酸序列如下
aattaatcta aaatttggat gaatttgatt caaacatagc gttattcatt cgttttttga 60
aggaataaga tcgtctcatc aaaacaaagg agacatctta tgaacacctt cgacaaacat 120
gatttaagcg gcttcgtcgg caaacatctg gtttatacct acgataacgg ctgggaatat 180
gaaatttacg tcaaaaacga aaacaccctc gactaccgta ttcacagcgg cctggtcggc 240
aaccgctggg tgaaagacca gcaggcgtac atcgtccgcg ttggggagag catctataaa 300
atctcctgga ccgagcccac cggcaccgac gtgagcctga ttgtgaacct gggtgacagc 360
ctgttccacg gcacgatctt cttcccgcgc tgggtaatga acaatccgga aaaaaccgtc 420
tgcttccaga acgatcacat tccgttgatg aatagctatc gcgatgcggg cccggcatat 480
ccaaccgaag tgattgatga atttgccact attacttttg ttcgcgactg cggtgccaac 540
aatgaaagcg ttatcgcgtg cgctgccagt gaacttccaa aaaactttcc tgataattta 600
aaataagcgc gacaattaac taaaaagaaa agttcccggc ccatttcata tttattcgaa 660
atggtcggga atttttttgt ttgttgatgt ttggtttaga taaaaagcgc gttaacggtg 720
agcgtaatca caaaacaaat aattcataat ttaataacgc tttgattatt aattggtttt780
2、一种细菌阿魏酸脱羧酶晶体结构，其特征为阿魏酸脱羧酶的单体结构的分辨率为
呈圆筒形，总尺寸为
由9股β折叠股、2个α螺旋和3段η螺旋构象构成；每一个单体分子又分为三部分即中心部分、螺旋状的底部和C末端延伸；其中，中心部分从β折叠股1到β折叠股8和β折叠股9，这九股反平行的β折叠股环绕形成了末端开口的β桶状结构；螺旋状底部由α螺旋构象1、α螺旋构象2和η螺旋构象1、η螺旋构象2构成；C末端延伸是位于β折叠股9之后的一段长卷曲，其中η螺旋构象2位于卷曲的中部。
3、权利要求2所述的细菌阿魏酸脱羧酶晶体结构，其特征在于细菌阿魏酸脱羧酶的底物结合位点为底物类似物阿魏酸钠结合到阿魏酸脱羧酶β桶状结构中心的中部和螺旋状的底部；在它半开式的底部，β折叠股8、β折叠股9和位于β折叠股1和β折叠股2、β折叠股3和β折叠股4之间的发夹结构构成的残基形成了一个相对疏水的底物结合口袋；位于β折叠股1和β折叠股2、β折叠股3和β折叠股4之间的发夹结构在底物结合口袋的前面担当了两扇门板的作用，我们在此将其命名为门板1和门板2；位于第25位的色氨酸担当了门锁的功能；在底物结合口袋关闭的状态下，门板1和门板2朝向β折叠股9移动约
将口袋关闭并且将底物与接触反应的中心隔开；在底物结合口袋开启的状态下，门板1门板2移开将口袋从关闭的形式变为开放的形式；在开放的状态下，底物结合中心形成一个
的口袋，有利于底物进入活性中心。
全文摘要
本发明涉及阿魏酸脱羧酶的表达、纯化、结晶方法、结构解析和应用技术领域，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明通过基因克隆的方法获得Enterobacter sp.Px6-4中分解阿魏酸生成4-乙烯基愈创木酚的关键酶阿魏酸脱羧酶的编码区序列、并通过异源表达技术在大肠杆菌(E.coli BL21)中大量表达了该酶；通过纯化的方法获得了阿魏酸脱羧酶的纯品；运用悬滴结晶法得到阿魏酸脱羧酶的蛋白质结晶，并且掌握了该酶的结构及活性中心。本发明能获得大量的高活性阿魏酸脱羧酶，并且通过对该酶活性中心的分析为改造工程菌以及提高4-乙烯基愈创木酚产量提供理论上的指导，具有良好的应用前景。
文档编号C12N9/88GK101397568SQ20081023351
公开日2009年4月1日 申请日期2008年10月31日 优先权日2008年10月31日
发明者张克勤, 饶子和, 孟照辉, 娄智勇, 杨金奎, 雯 顾 申请人:云南大学