基因修饰的细菌的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求于2013年3月14日提交的美国临时专利申请第61/782, 141号的优 先权，并且通过引用将其全部结合于此，用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明总体涉及具有增加的生物量（biomass)生产能力的基因修饰的 (genetically modified)细菌，如甲基杆菌属（Methylobacterium)。这种基因修饰的细菌 可以用于从单碳（C1)化合物，如甲醇（CH3OH)和甲烷（CH4)生产有用的化学化合物。
【背景技术】
[0004] 甲基营养是微生物，如细菌和某些真菌，在作为唯一的碳和能量源的简单的 (reduced) (^化合物像CH 4和CH 30H上生长的能力。因为一些C1同化途径是非常低效的，因 此使更少的原料转向至二氧化碳（CO2)的代谢途径对于有利的碳基化合物（carbon-based compound)的生产是有用的。因此，优化基因修饰的微生物以减少CO2废气是合乎需要的。
【发明内容】
[0005] 本公开的实施方式指向当在(^化合物如甲醇上生长时，修饰细菌内的途径以相对 于必不可少浪费成CO2增加中间代谢中的碳的总保持量（retention)。根据一个方面，本文 描述的基因修饰的细菌具有与不存在基因修饰的细菌（包括野生型细菌）相比的增加的基 质产率（成为生物量的碳的克数相对于成为CO2的碳的克数）。在该方面，由于基因修饰的 细菌的增加的效率，每单位基质的生物量产量增加。根据可替代的方面，与包括野生型细菌 的不存在基因修饰的细菌相比，本文描述的基因修饰的细菌产生了更少的二氧化碳以及更 多的碳基生物量。在这方面，每单位基质的生物量产量增加。
[0006] 根据本公开的一些方面，提供了重组细菌，其已经被基因修饰以中断细菌的用于 异化以七合物像CH3OH的H4MPT(四氢甲烷碟呤）途径。根据该方面，除去、改变、抑制剂结 合、或另外地防止表达用于C1异化的细菌的H4MPT (四氢甲烷碟呤）途径之内的一个或多个 基因。以这种方式，中断、抑制、沉默用于C1异化的细菌的H 4MPT途径或另外地使其对于C1异化无效。根据该方面，通过中断H4MPT途径，不需要完全阻止C1异化。相反，基因修饰可 以导致途径的一些操作，然而，基因修饰旨在使H4MPT途径相对于未修饰的H4MPT途径失去 作用。
[0007] 根据本公开的一些方面，提供了重组细菌，其已经被基因修饰以中断用于低级碳 同化，如，C1同化的细菌的丝氨酸循环。根据该方面，除去、改变、抑制剂结合、或者另外地防 止表达用于(^同化的细菌丝氨酸循环内的一个或多个基因。以这种方式，中断、抑制、沉默 用于C1同化的细菌的丝氨酸循环或者另外地使其对于(^同化无效。根据该方面，通过中断 丝氨酸循环，不需要完全阻止C1同化。相反，基因修饰可以导致丝氨酸循环的一些操作，然 而，基因修饰旨在使丝氨酸循环相对于未修饰的丝氨酸循环失去作用。
[0008] 根据本公开的一些方面，可以基因修饰细菌以中断用于C1异化的细菌的H4MPT途 径或中断用于C1同化的细菌的丝氨酸循环。根据本公开的一些方面，可以基因修饰细菌以 中断用于C1异化的细菌的H 4MPT途径并且中断用于C1同化的细菌的丝氨酸循环。
[0009] 根据一些方面，可以基因修饰细菌以包括来自用于C1同化和C i异化的RuMP(核 酮糖单磷酸）途径的一个或多个基因。来自RuMP途径的一个或多个基因编码一些C1同化 酶，并且当酶包含于细菌中时，表达这些酶以进行C1同化。来自RuMP途径的一个或多个基 因编码一些C1异化酶，并且当酶包含于细菌中时，表达这些酶以进行C i异化。本领域技术 人员应该理解的是，并不是所有属于RuMP途径的基因都需要包括在细菌的基因组中以使 得细菌表达对于C1同化或C i异化起作用的酶。
[0010] 根据一个方面，可以基因修饰细菌以中断用于C1异化的细菌的H4MPT途径并且包 括用于C1同化和C i异化的RuMP途径的一个或多个基因。根据进一步的方面，可以基因修 饰细菌以中断用于C1同化的细菌的丝氨酸循环并且包括来自用于C1同化和C1异化的RuMP 途径的一个或多个基因。根据又进一步的方面，可以基因修饰细菌以中断用于(^异化的细 菌的H4MPT途径并且中断用于C1同化的细菌的丝氨酸循环以及包括来自用于C i同化和C i 异化的RuMP途径的一个或多个基因。
[0011] 根据一些方面，细菌可以是包括用于C1同化的丝氨酸循环或卡尔文循环，以及 H4MPT或硫醇基（thiol-based)(例如，谷胱甘肽、放线硫醇）(^异化途径中的任何一种。根 据本公开，这类细菌可以通过使丝氨酸循环、卡尔文循环、H4MPT C1异化途径或硫醇基（例 如，谷胱甘肽、放线硫醇）C1异化途径失去作用（disabling)，并且用于C i同化、C 1异化或二 者的RuMP途径起作用而改善。根据一些方面，细菌可以是甲基杆菌属。根据一些方面，细 菌可以是扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens)。根据一些方面，细菌可以是扭脱 甲基杆菌AMl。根据一些方面，细菌可以是扭脱甲基杆菌PAl。
[0012] 根据一个方面，基因修饰扭脱甲基杆菌PAl细胞以中断用于C1异化的细胞的 H4MPT(四氢甲烷碟呤）途径并包括用于C1异化的重组RuMP途径。
[0013] 根据可替换的方面，基因修饰扭脱甲基杆菌PAl细胞以中断用于C1同化的细胞的 丝氨酸循环并且包括用于C1同化的重组RuMP途径。
[0014] 根据可替换的方面，基因修饰扭脱甲基杆菌PAl细胞以中断用于C1异化的细胞的 H4MPT (四氢甲烷碟呤）途径，中断用于C1同化的细胞的丝氨酸循环并且包括用于C1同化和 C1异化的重组RuMP途径。
【附图说明】
[0015] 从结合附图的示例性实施方式的以下【具体实施方式】将更完全地理解本发明的前 述和其他特征和优点，其中：
[0016] 图1是存在于未改变的丝氨酸循环甲基营养生物中的代谢途径。有助于(；同化与 异化的天然途径以紫色示出；仅用于C1异化的途径为红色；用于C 1同化的途径为绿松色； 中间代谢途径为灰色。
[0017] 图2是存在于丝氨酸循环甲基营养生物中的代谢途径，其中，H4MPT-依赖的甲醛氧 化途径已经失去作用（鲜红的X)，并且，如通过HPS和PHI (深蓝的）的引入和表达已经引 入RuMP循环。这些引入了用于C1同化与异化（褐色）的新的反应，新的C1异化为橙色，以 及新的C1同化为绿色。其余颜色如图1描述的。
[0018] 图3是存在于丝氨酸循环甲基营养生物中的代谢途径，其中，用于C1同化的天然 的丝氨酸循环已经失去作用（鲜红的X)，并且如通过HPS和PHI的引入和表达已经引入了 RuMP循环。其余的颜色如图1和2中描述的。
[0019] 图4是存在于丝氨酸循环甲基营养生物中的代谢途径，其中，H4MPT-依赖的甲醛氧 化途径和丝氨酸循环已经失去作用（鲜红的X)，排除了（^同化与异化二者的作用，并且如 通过HPS和PHI的引入和表达已经引入了 RuMP循环。其余的颜色如图1和2中描述的。
[0020] 图5示出了制造为敲除丝氨酸循环中的hprA并且用编码来自荚膜甲基球菌 (Methylococcus capsulatus)Bath的己酮糖6_磷酸合酶（HPS)和己酮糖6_磷酸异构 酶（PHI)的基因将其替换的结构（构建体，construct)的质粒图谱。在pCM433[基因库 (GenBank) :EU118176]的骨架上制造该结构，其是8081bp长的具有ColEl复制起点和IncP 转移起点的 CamR、TetR、△!!^/载体（Marx, BMC Research Notes 1:1 (2008)) 〇
[0021] 图6示出了制造为敲除丝氨酸循环中的hprA并且用编码来自荚膜甲基球菌Bath 的己酮糖6-磷酸合酶（HPS)和己酮糖6-磷酸异构酶（PHI)的基因将其替换的结构的质粒 图谱。在PCM433 [基因库：EU118176]的骨架上制造该结构，其是8081bp长的具有ColEl复 制起点和 IncP 转移起点的 CamR、TetR、AmpR载体（Marx, BMC Research Notes 1:1(2008))。
[0022] 图7示出了制造为敲除扭脱甲基杆菌（M. extorquens) PAl中的mptG的结构 的质粒图谱。在PCM433[基因库：EU118176]的骨架上制造该结构，其是8081bp长的具 有 ColEl 复制起点和 IncP 转移起点的 CamR、TetR、Αηιρ1^^·^ (Marx, BMC Research Notes 1:1(2008))〇
【具体实施方式】
[0023] 本公开的实施方式包括含有一个或多个基因修饰的重组宿主微生物，所述基因修 饰导致减少的二氧化碳生成量以及流向生物量或副产物产量的伴随的增加。本公开的实施 方式包括含有导致细胞增殖的增加的速率的一个或多个基因修饰的重组宿主微生物。本公 开的实施方式包括含有导致每单位基质增加的生物量产量的一个或多个基因修饰的重组 宿主微生物。
[0024] 本公开的实施方式包括本文描述的重组宿主微生物，其已经被进一步基因修饰以 包括用于目标含碳化合物的生物合成途径。根据一个方面，重组宿主微生物已经被基因修 饰以通过重组宿主微生物降低生产二氧化碳的碳原料的使用，导致碳生物量的增加的产 量。当重组宿主微生物已经被进一步基因修饰以包括用于目标含碳化合物的生物合成途径 时，与本文描述的未经重组修饰的宿主微生物相比，重组宿主微生物产生了更大量的目标 化合物。
[0025] 本公开的方面涉及基因修饰的重组甲基营养微生物（recombinant methylotrophic microorganism)以增加来自低级含碳化合物，如C1化合物的总生物量产 量。甲基营养微生物是在作为碳源和能量源的以七合物像CH 4和CH 30H上生长的那些，如 细菌和一些真菌。甲基营养微生物也可以包括在除了 C1化合物之外的低级碳化合物如C2至C5碳化合物上生长的那些。
[0026] 本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的并且在以 下中进行描述：Sambrook，J.，Fritsch，E. F.和 Maniatis，Τ·，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed. ；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989)和 Silhavy, T. J.，Bennan, M. L.和 Enquist, L. W.，Experiments with Gene Fusions ；Cold Spring Harbor Laboratory:CoId Spring Harbor, N. Y. , (1984)；以及 AusubeI, F. M.等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience (1987)，其中的每个通过引用将其整体结合于此。
[0027] 另外有用的方法在包括以下各项的手册中进行描述：Advanced Bacterial Genetics (Davis, Roth和Botstein, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980), Experiments with Gene Fusions (Silhavy, Berman 和 Enquist，Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), Experiments in Molecular Genetics(Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)Experimental Techniques in Bacterial Genetics(Maloy, in Jones 和 Bartlett, 1990)，以及 A Short Course in Bacterial Genetics (Miller, Cold Spring Harbor Laboratory 1992)，其中的每个通过引用将其整体结合于此。
[0028] 通过本领域技术人员已知的方法可以基因修饰甲基营养微生物以剔除基因或 结合基因。待抑制的甲基营养微生物内基因对本领域技术人员是已知的或者使用本领 域技术人员已知的方法可以确定。加入至甲基营养微生物的基因组的基因或其同源物 是本领域技术人员已知的或者使用本领域技术人员已知的方法可以鉴定并获得。可用 于一些宿主细胞的转化的载体和质粒可以是常用的并且可商购自如Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)、Stratagene(La Jolla, CA)和 New England Biolabs, Inc. (Beverly1MA) 的公司。其他生物体将要求宽的宿主范围载体，如产生自最小的IncP复制子的pCM系列 (Marx 和 Lidstrom, Microbiology 147-2065-2075 (2001))，或者利用接合转移以引入自杀 载体（Marx 和 Lidstrom, BioTechniques33:1062-106