1的该培养物滴涂在营养琼脂平板上并且允许风干。将50 μ 1的扭脱甲 基杆菌PAl培养物滴涂在营养琼脂平板上的大肠杆菌培养物的顶部并且允许风干。将平板 在30°C温育过夜以及在4°C下1天。在100 μ 1新鲜的hypho中悬浮生长菌落，并且平铺在 hypho+3.5mM琥?自酸+1.2%琼脂+四环素（10μg/ml)基本培养基平板上。将来自第一个 四环素平板的菌落在另一 hypho+3. 5mM琥珀酸+1. 2%琼脂+四环素（10 μ g/ml)基本培养 基板上划线以确保四环素抗性。抗四环素菌落是将等位交换载体整合在染色体中的那些。 然后这些菌落在没有任何抗生素的hypho+3. 5mM琥珀酸中生长过夜。将过夜生长物平铺在 hypho+琥?自酸+1. 2%琼脂+5%鹿糖基本培养基平板上。由于鹿糖是反选择剂，使用该步骤 以选择已经通过同源重组从染色体除去等位交换载体的菌落。通过测试蔗糖+菌落的四环 素抗性筛选出等位交换载体上的随意突变失活的sacB(对于蔗糖敏感性起作用）基因。使 用PCR在mptG位点上测试具有蔗糖+和四环素敏感表型的那些菌落的染色体的祖先的或 修饰版本。通过桑格测序验证剔除mptG位点的菌落，并且在-80°C冰箱中用10% DMSO冷 冻保存。
[0078] 敲除的丝氨酸循环中的特定基因是hprA(参考在扭脱甲基杆菌PAl染色体上的 Mext_1796)，其是在（Chistoserdova 等，J. Bacteriol. 185 (10) :2980-2987 (2003))中描 述的NADPH依赖的羟基丙酮酸还原酶。编码hprA的ORF为945个碱基长并且在染色体 上的碱基20161384至2017078之间的正链上发现。通过在5'端含有用于限制酶XbaI 的识别序列的正向引物（TCTAGACTC ATC GAC AAC GGC GTG AAG G)以及在5'端含有用 于限制酶Nde I的识别序列的反向引物（CATATGGGGCAATCGTGTCGCTCAC)来扩增用于结构 (2015764-2016107)的hprA的上游侧。通过在5'端含有用于限制酶ApaI的识别序列的 正向引物（GGGCCCCTCGTGGACAACGTCGAAGC)以及在5'端含有用于限制酶SacI的识别序列 的反向引物（GAGCTCTCT TCA CCG CCT CGA ACA CC)扩增用于结构（2017019-2017465)的 mptG的下游侧。
[0079] 在研究扭脱甲基杆菌PAl的基因组序列时，显然的是仅需要引入扭脱甲基杆菌 PAl代谢网络的异化RuMP循环中的基因是HPS和PHI。这些基因由甲基荚膜球菌Bath引 入。在甲基荚膜球菌Bath中，存在编码HPS的3种基因（在甲基荚膜球菌Bath的主染色 体上的MCA2738、MCA3043和MCA3049)，以及编码PHI的3种基因（在甲基荚膜球菌Bath 的主染色体上的MCA2738、MCA3044和MCA3050)。之前的工作（Ward等，PLoS Biology 2:e303(2004))已经表明大部分的碳通量通过MCA3049和MCA3050进入RUMP循环。因此， 引入这两个基因代替扭脱甲基杆菌PAl中的mptG基因用于构建菌株1。如上面描述的， MCA3049编码己酮糖6-磷酸合酶（HPS)基因，其在染色体从3236945位点至3237592位点 的正链上长648bp。MCA3050编码在染色体上从3237605位点至3238138位点的正链上长 534bp的己酮糖6-磷酸异构酶（PHI)基因。使用在5'端具有用于限制酶NdeI的识别序列 的正向引物（TCATATGACCGGTGTCGCCAGGTACA)和在5'端具有用于限制酶ApaI的识别序列 的反向引物（TGGGCCCACGGACAACATGCCACGC)以扩增甲基荚膜球菌Bath染色体上3236701 位点至3238196位点之间的区域，所述染色体包含用于MCA3049和MCA 3050的启动子、 RBS (核糖体结合位点）以及整个0RF。
[0080] 如在（Marx, BMC Research Notes 1:1 (2008))中描述的，以下面描述的顺序，在等 位交换载体（PCM433)的骨架上构建最终的结构。用限制酶NdeI和XbaI消化载体pCM433， 对于插入物，hprA上游侧也同样处理。使用由NEB (新英格兰生物实验室）制造的热敏磷 酸酶将消化的载体的5'端去磷酸化。使用由Zymo Research Inc.制造的凝胶提取试剂 盒凝胶提取消化的载体和插入物。使用由NEB(新英格兰生物实验室）制造的快速连接试 剂盒连接3:1摩尔比率的插入物和载体。将1 μ 1的连接混合物转化至由NEB(新英格兰 生物实验室）制造的50 μ 1的10 β化学感受态细胞。将转化的细胞平铺在LB+四环素 (12. 5 μ g/ml)+1. 2%琼指平板上并通过PCR筛选插入物。对于插入物筛选为阳性的菌落在 LB+四环素（12. 5 μ g/ml)中生长。将获得质粒命名为pDN123。使用由Qiagen制造的标准 Miniprep试剂盒进行质粒提取。对于下一轮，使用pDN123的dam /dcm版本作为载体以及 包含hprA下游侧的pCRII-Blunt-Topo载体的dam /dcm版本作为插入物。重复上面描述 的相同方案。将获得的质粒命名为PDN127。对于最后一轮，使用pDN127的dam /dcm版本 作为载体以及具有包含MCA3049和MCA30500RF、启动子和RBS的荚膜甲基球菌Bath的区域 的pCRII-Blunt-Topo载体的dam /dcm版本作为插入物，并且重复上面描述的相同方案。将 获得的质粒命名为PDN132。通过桑格测序验证产生的所有质粒，并且用10% DMSO在-80°C 冰箱中将包含每个质粒的大肠杆菌菌株进行冷冻保存。
[0081] 使用3元杂交方案，将最终产生的结构（pDN132)引入至Acel AmptG扭脱甲基杆 菌PAl菌株中。含有pDN132的大肠杆菌菌株在IOml LB+四环素（12. 5 μ g/ml)中生长，包 含具有宽宿主范围的质粒RK2的接合转移基因的称为pRK2073的辅助质粒的菌株在IOml 的LB+链霉素（50. 0 μ g/ml)中生长，以及扭脱甲基杆菌PAl在具有3. 5mM琥珀酸作为碳源 的IOml Hypho基本培养基中生长。大肠杆菌菌株在早期静止期收获，以及扭脱甲基杆菌 PAl在指数期中期收获（OD6。。~0. 3)。在无任何抗生素的Iml新鲜LB培养基中再悬浮离 心的大肠杆菌细胞。在Iml Hypho基本培养基中再悬浮离心的扭脱甲基杆菌PAl细胞。将 50 μ 1在LB中再悬浮的pRK2073加入至具有pDN131的再悬浮的大肠杆菌菌株，并且在37°C 振荡培养箱中温育1小时。将10 μ 1的该培养物滴涂在营养琼脂平板上并且允许风干。将 50 μ 1的扭脱甲基杆菌PAl培养物滴涂在营养琼脂平板上的大肠杆菌培养物的顶部并且允 许风干。将平板在30°C温育过夜以及在4°C下1天。在100 μ 1新鲜的hypho中悬浮生长 菌落，并且平铺在hypho+3. 5mM琥珀酸+1. 2%琼脂+四环素（10 μ g/ml)基本培养基板上。 将来自第一个四环素板的菌落在另一 hypho+3. 5mM琥泊酸+1. 2%琼脂+四环素（10 μ g/ ml)基本培养基板上划线以确保四环素抗性。抗四环素菌落是将等位交换载体整合在染色 体的那些。然后这些菌落在没有任何抗生素的hypho+3. 5mM琥珀酸中过夜生长。将过夜生 长物平铺在hypho+琥?自酸+1. 2%琼脂+5%鹿糖基本培养基板上。由于鹿糖是反选择剂，使 用该步骤以选择已经通过同源重组从染色体除去等位交换载体的菌落。通过测试蔗糖+菌 落的四环素抗性筛选出等位交换载体上的随意突变失活的sacB(对于蔗糖敏感性起作用） 基因。使用PCR在hprA位点上测试具有蔗糖+和四环素敏感表型的那些菌落的染色体的 祖先的或修饰版本。通过桑格测序验证用RuMP途径的HPS和PHI基因代替hprA位点的菌 落，并且在_80°C冰箱中用10% DMSO冷冻保存。
[0082] 实施例V
[0083] 后续演化以改善由实施例1I-IV产生的菌株的生长特性
[0084] 由于产生了较少的CO2，上面的菌株产生了具有关于C1化合物的增加的产率的甲 基营养生物。这起因于在甲醛的水平上结合所有碳的化学计算的优点，而不是丝氨酸循环 的甲酸和CO2组合，或纯粹是自养生物的CO2。然而，可以进一步优化细胞。为了进一步研 发其中中间代谢设计为产生有价值的化学物质的菌株，菌株首先在分批培养中进化以选择 增加的增长率。这符合了扭脱甲基杆菌AMl的先例，其中，H4MPT依赖的C1异化途径用类 似的替换，而不是来自脱氮副球菌的非同源的谷胱甘肽-依赖性途径（Marx等，J.Bacter iol. 185:7160-7168(2003))。在含甲醇的培养基的后续进化导致生长急剧增加（Chou等， Science 332:1190-1192(2011))。大部分的改进发生在这些实验的首次的两三百代中，并 且改善的程度在整个复制品中区别相当大（Lee和Marx，Genetics 193:943-952(2013))。 简而言之，对于单个菌落，将待用作祖先的期望的起始菌株划线，使用其中的每个以发现独 立复制的群落。然后将培养物周期性地稀释（l/2n)成含有感兴趣的C1基质如甲醇的新鲜 的培养液，导致每次转移η的净后代。剩余的培养物的样品冷冻保存以提供实验的活化石 记录。可以筛选来自它们的群落或分离物用于期望条件下的增加的生长。
[0085] 贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和出版的专利申请的内容通过引用将其整 体结合于此用于所有目的。
[0086] 等价物
[0087] 其他实施方式对于本领域技术人员将是明显的。应该理解的是提供上述说明仅用 于澄清，并且仅是示例性的。本发明的精神和范围不限于上面的实施例，而是由权利要求涵 盖。出于所有目的，上面引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体结合于此至 如同具体指出每个单独的出版物或专利申请通过引用如此并入的程度。
【主权项】
1. 一种重组细菌细胞 被基因修饰以中断所述细胞的用于C1异化的H4MPT途径并且包括用于C1异化的重组RuMP途径。2. 根据权利要求1所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是甲基杆菌属 (Methylobacterium)〇3. 根据权利要求1所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是扭脱甲基杆菌 (Methylobacteriumextorquens)〇4. 根据权利要求1所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是扭脱甲基杆菌PAl。5. -种重组细菌细胞 被基因修饰以中断所述细胞的用于C1同化的丝氨酸循环并且包括用于Ci同化的重组RuMP途径。6. 根据权利要求5所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是甲基杆菌属。7. 根据权利要求5所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是扭脱甲基杆菌。8. 根据权利要求5所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是扭脱甲基杆菌PAl。9. 一种重组细菌细胞 被基因修饰以中断所述细胞的用于C1异化的H4MPT途径，中断所述细胞的用于C1同化 的丝氨酸循环，并且包括用于C1同化和Ci异化的重组RuMP途径。10. 根据权利要求9所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是甲基杆菌属。11. 根据权利要求9所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是扭脱甲基杆菌。12. 根据权利要求9所述的重组细菌细胞，所述重组细菌细胞是扭脱甲基杆菌PAl。13. -种制备基因修饰的细菌的方法，包括 基因修饰目标细菌以中断所述目标细菌的用于C1异化的H4MPT途径并且包括用于(^异 化的重组RuMP途径。14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述目标细菌是甲基杆菌属。15. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述目标细菌是扭脱甲基杆菌。16. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述目标细菌是扭脱甲基杆菌PAl。17. -种制备基因修饰的细菌的方法，包括 基因修饰目标细菌以中断所述目标细菌的用于C1同化的丝氨酸循环并且包括用于C1 同化的重组RuMP途径。18. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述目标细菌是甲基杆菌属。19. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述目标细菌是扭脱甲基杆菌。20. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述目标细菌是扭脱甲基杆菌PAl。21. -种制备基因修饰的细菌的方法，包括 基因修饰目标细菌以中断所述目标细菌的用于C1异化的H4MPT途径，中断所述目标细 菌的用于C1同化的丝氨酸循环，并且包括用于Ci同化和C2异化的重组RuMP途径。22. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述目标细菌是甲基杆菌属。23. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述目标细菌是扭脱甲基杆菌。24. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述目标细菌是扭脱甲基杆菌PAl。
【专利摘要】本发明涉及基因修饰的甲基营养菌。
【IPC分类】C12N1/21, C12N1/15
【公开号】CN105209597
【申请号】CN201480028028
【发明人】克里斯托弗·J·马克斯, 迪普蒂·D·纳亚克
【申请人】哈佛大学校长及研究员协会
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年2月26日
【公告号】CA2905265A1, EP2970860A1, US20160040118, WO2014158590A1