专利名称：一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的方法和专用引物。属于分子生物学技术领域。
背景技术：
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起的一种世界范围的水稻病害，该病害引起水稻结实率和千粒重显著降低，甚至植株倒伏枯死，是造成水稻减产的主要原因之一。水稻纹枯病菌属于立枯丝核菌的AG-I融合群，其基因组序列未知，这也为该病原菌的深入研究带来一定困难。随着矮杆、早熟、多蘖型品种的大量推广，以及施肥水平的不断提高，水稻纹枯病危害逐步加重，近年来已成为我国水稻三大病害之首，严重影响了水稻产量和质量。目前对水稻纹枯病的防治以化学措施为主。噻呋酰胺(thifluzamide)商品名为“满穗”，是陶氏益农公司开发的噻二唑羧酰苯胺类化合物，是近年来推出的新型、高效防治纹枯病药剂。噻呋酰胺属于呼吸抑制剂中作用于复合物II处的琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHIs)，这类药剂还包括萎锈灵、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等，它们具有相似的作用机制和抗性机制，相互间具有正交互抗药性，多对担子菌或子囊菌特效。使用初期，这类药剂因其用药量少，防效显著而备受青睐，但因其作用位点单一，田间很快就产生了抗药性。已有研究发现，病原菌对此类药剂的抗性机制主要是琥珀酸脱氢酶B、C、D亚基(sdhB、sdhC、sdhD)发生点突变所致，如玉米瘤黑粉病菌、小麦壳针孢叶枯病菌、灰霉菌等均在sdhB第三个半胱氨酸簇的保守组氨酸位点发生点突变，灰盖鬼伞病菌、菌核病菌等则在膜锚蛋白sdhC、sdhD位点发生点突变，脱氮副球菌在sdhB、sdhD发生点突变，而链格孢菌、米曲霉菌、多主棒孢在sdhB、sdhC、sdhD基因均发生突变。水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性机制目前还未明确，明确其具体的抗性基因及抗性检测方法，可以对抗性菌株进行早期检测，了解其抗性发展动态，制定合理的病害管理方案，延缓抗药性的产生。传统的抗性检测方法主要为室内生物学测定，包括菌丝生长速率法、孢子萌发法、菌丝干重法、水平扩散法等。这些传统的敏感性测定方法均需要制备含药培养基，计算抑制中浓度，耗费时间长，工作量大，灵敏度低。随着分子生物学的快速发展，分子技术得以在抗药性检测中应用，其速度快，效率高，是田间抗性检测的理想方法。针对单碱基突变引起的抗性，AS-PCR和CAPS方法已成功应用于抗性菌株的分子检测。等位特异PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)是在引物的3’端设计一个碱基与突变位点匹配，在PCR扩增时引物只与突变菌株结合，敏感菌株的DNA则不能扩增，从而将敏感和抗性菌株区分开来。最近的研究发现，在原引物基础上，改变倒数第二个碱基为不同核苷酸后，可以显著提高引物的特异性，使得AS-PCR技术应用更为广泛。CAPS (Cleaved amplified polymorphicsequences)是酶切扩增多态性序列标记技术，也称为PCR-RFLP技术，敏感和抗性菌株由于核苷酸序列的差异可能导致了酶切位点的改变，对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切，经电泳分离后敏感和抗性菌株的表型不同，从而加以区分。
发明内容
本发明的一个目的是提供两种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中SdhB基因是否存在突变位点的方法及其专用引物。本发明所提供的第一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO : I和SEQ ID NO 2所示引物对进行PCR扩增，若能扩增出条带，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点；所述突变位点指水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核 苷酸为C和T杂合或T纯合。上述过程中，所述sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为56°C。本发明所提供的另一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，扩增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切产物中含有230bp片段，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点；所述突变位点指水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。上述过程中，所述sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本发明所提供的检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子组成。本发明的另一个目的是提供水稻纹枯病菌中sdhB基因或蛋白的突变位点。本发明所提供的水稻纹枯病菌中sdhB基因的一个突变位点，为水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。其中，所述sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ ID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本发明所提供的水稻纹枯病菌中sdhB蛋白的一个突变位点，为水稻纹枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸为组氨酸与酪氨酸杂合或纯合的酪氨酸。其中，所述sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸也就是SEQ ID NO :3中自N端起第249位氨基酸。上述任一所述突变位点在鉴定水稻纹枯病菌抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为抗噻呋酰胺。上述应用中，存在所述突变位点的水稻纹枯病菌具有或候选具有抗药性。SEQ ID NO :3所示蛋白或SEQ ID NO :4所示基因也属于本发明的保护范围。上述中，任一所述水稻纹枯病菌具体是立枯丝核菌。
上述中，所述敏感菌株为噻呋酰胺的平均EC5tl小于O. I μ g/ml，抗性菌株为噻呋酰胺的平均 EC50 为 19. 558 μ g/ml。本发明提供的检测水稻纹枯病菌对噻呋酰胺产生抗药性的点突变的方法，对抗性菌株进行高灵敏度、简单快速的分子检测，及时了解抗药性发生动态，对制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要意义。本发明方法具有以下技术优势和特点结果可靠用本发明建立的分子检测方法检测菌株DNA，所有的抗性菌株都能与敏感菌株区分开来，其结果可靠性有保证。简单快速传统的生物学测定方法从病菌分离，到敏感性检测，至少需要5天时间，工作量大，周期长。而分子检测从提DNA到PCR或酶切分析，最多需要I. 5天时间，省时 省工。
图I为水稻纹枯病菌敏感与抗性菌株的序列比对。A :sdhB、sdhC、sdhD基因的突变情况，B sdhB基因975位的碱基杂合，C :敏感菌株与抗性菌株的sdhB氨基酸比对。图2为抗性与敏感菌株的NlaIV酶切位点。图3为CAPS方法酶切检测结果。I 4泳道为敏感菌株，5 16泳道为抗性菌株。图4为AS-PCR方法检测水稻纹枯病菌抗性突变体。A :四对AS-PCR引物在不同温度条件下的电泳结果。B :引物BF975C/BR32在56°C下的扩增结果。S为敏感菌株，R为抗性杂合菌株，T为抗性纯合菌株。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。文中“抗性菌株”均指对噻呋酰胺抗性的立枯丝核菌(Rhizoctonia solaniKiihn);“敏感菌株”均指对噻呋酰胺敏感的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。下述实施例中使用的立枯丝核菌为抗性菌株J-I，J-3，J-3-1、J-6、J_10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、B-U B-I-U B-1-31、T2 ;敏感菌株 FBS-3、B310、D179、JHT158-3,JHM-4 和 E67。上述菌株分别采自FBS-3(福建)，B310、B-1、B-1-1、B-1-31 (广东)，D179 (广西)，JHM-4、JHT158-3, J-I、J-3、J-3-1、J-6、J-10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、T2 (吉林)，E67(江苏)。通过形态学并结合分子生物学方法鉴定所有菌株为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani Kiihn)。实施例I、立枯丝核菌对噻呋酰胺的敏感性测定五株立枯丝核菌敏感菌株，菌株编号分别为FBS-3，B310, D179，JHT158-3, E67 ;十株立枯丝核菌抗性菌株，菌株编号分别为J-3，J-3-1，J-24，J-20, B-I, B-1-31, J-14，J-6，J-I 和 T2。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基马铃薯200g，琼脂粉14g，葡萄糖18g，蒸馏水定容至1L，121°C湿热灭菌20分钟。
I、实验步骤如下I)将噻呋酰胺用二甲基亚砜(DMSO)配成105μ g/ml的母液。对于立枯丝核菌敏感菌株的敏感性测定，将噻呋酰胺逐级稀释成500 μ g/mL, 100 μ g/mL, 50 μ g/mL, 25 μ g/mL, 10 μ g/mL的浓度梯度；对于立枯丝核菌抗性杂合菌株的敏感性测定，将供试药剂噻呋酰胺逐级稀释成 2 X IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, I. 5 X IO3 μ g/mL, 500 μ g/mL, 200 μ g/mL 的浓度梯度；对于立枯丝核菌抗性纯合菌株的敏感性测定，将供试药剂噻呋酰胺逐级稀释成 2 X IO5 μ g/mL, 8 X IO4 μ g/mL, IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, 2. 5 X IO3 μ g/mL, IO3 μ g/mL,500 μ g/mL的浓度梯度。2)用移液枪吸取噻呋酰胺药液60 μ I加入已灭菌的冷却至45°C的60ml PDA培养基中，使溶剂含量为1%。，混匀，将带药的培 养基倒入直径为9cm的培养皿中，设只加60 μ I二甲基亚砜的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复。3)立枯丝核菌在PDA平板上培养3天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为O. 5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照培养基中，置于28°C培养箱中黑暗培养，I. 5d后测量菌落直径。4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各浓度药剂对供试菌株菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，求出噻呋酰胺对立枯丝核菌的毒力回归曲线方程Y=a+bX,以及相关系数r和有效抑制中浓度EC5tl值，并计算抗性倍数。
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抗性感菌株的ECso
抗件倍數= ____
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敏慼菌株I 平均EC502.结果表I.立枯丝核菌对噻呋酰胺的敏感性
权利要求
1.一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中SdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤 以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物对进行PCR扩增，若能扩增出条带，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点； 所述突变位点指水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中，退火温度为56°C。
3.—种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤 以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，扩增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切产物中含有230bp片段，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点； 所述突变位点指水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。
4.一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的引物对，由SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子组成。
5.水稻纹枯病菌中sdhB基因的一个突变位点，为水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。
6.水稻纹枯病菌中sdhB蛋白的一个突变位点，为水稻纹枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸为组氨酸与酪氨酸杂合或纯合的酪氨酸。
7.权利要求5或6所述突变位点在鉴定水稻纹枯病菌抗药性中的应用；所述抗药性为抗噻呋酰胺。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于存在所述突变位点的水稻纹枯病菌具有或候选具有抗药性。
9.SEQ ID NO 3所示蛋白。
10.SEQ ID NO 4 所示基因。
全文摘要
本发明涉及及一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的分子检测方法和专用引物。属于分子生物学技术领域。该引物对，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示核苷酸序列组成。本发明提供的检测水稻纹枯病菌对噻呋酰胺产生抗药性的点突变的方法，具有高灵敏度、简单快速、稳定性好的特点，可以有效地区分敏感菌株和抗药性菌株，用于检测田间水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性发生发展动态。本发明对于抗性病害的早期预警，以及制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要意义。
文档编号C12Q1/02GK102864220SQ201210281520
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者刘西莉, 牟文君, 李波涛, 刘鹏飞, 李健强, 王厚涵, 林东 申请人:中国农业大学