专利名称：小黄鱼微卫星dna分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及一种小黄鱼微卫星DNA分子标记。
背景技术：
小黄鱼(Larimichthys polyactis)隶属于S卢形目、石首鱼科、黄花鱼属，为广泛分布于渤海、黄海和东海北部的暖温性底层鱼类，是我国重要的海洋渔业经济种类，曾被誉为我国“四大渔业”之一。近些年来，高强度的捕捞压力已经使得小黄鱼资源处于过度捕捞状态。为了保护和管理小黄鱼渔业资源，研究其种群遗传结构和遗传变异水平是非常必要的。微卫星分子标记因具有多态性高、共显性等优点已经成为目前海水鱼类群体遗传 分析最常用的手段。然而，迄今为止针对小黄鱼开发的微卫星分子标记只有35个(Chen等，Conservation genetics2009,10 :1469-1471 ;Li 等，Molecular Ecology Notes 2006，6(1) : 188-190 ;Ma 等，Genetics and Molecular Research 2011,10(3) : 1455-1460),即使加上从近缘种如大黄鱼(Pseudosciaena crocea)和鯢鱼(Miichthys miiuy)筛选出可应用于小黄鱼的 20 个微卫星标记(Conservation genetics 2009,10:1629 - 1631 ；Geneticsand Molecular Research 2012,11(2) : 1469-1474)，数量也是非常有限，亟待开发更多新的小黄鱼微卫星分子标记。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于开发小黄鱼微卫星DNA标记，提供多态性引物，建立小黄鱼微卫星标记开发的技术体系，为小黄鱼的遗传背景分析提供更多新的微卫星标记，弥补目前小黄鱼微卫星标记较为缺乏的不足。本发明解决技术问题的技术方案通过构建小黄鱼微卫星(GT ) 17、( GGT ) 9和(CTAT)8富集文库，筛选小黄鱼多态性微卫星引物，以及对小黄鱼微卫星位点进行遗传多态性检测，开发了小黄鱼21个多态性丰富的微卫星标记。21个小黄鱼微卫星DNA分子标记的编号为H5, H22, H26, H31, H33, H37, H38, H43, H44, H47, H51, H54, H65, H70, H71, H75,H80，H82，H84，H106，H111，其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO. I, SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4，SEQ ID NO. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8，SEQ ID NO. 9，SEQID NO. 10，SEQ ID NO. 11，SEQ ID NO. 12，SEQ ID NO. 13，SEQ ID NO. 14，SEQ ID NO. 15，SEQID NO. 16，SEQ ID NO. 17，SEQ ID NO. 18，SEQ ID NO. 19，SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 所
/Jn ο21 个微卫星标记 H5, H22, H26, H31, H33, H37, H38, H43, H44, H47, H51, H54, H65,H70, H71, H75, H80, H82, H84, H106, Hlll 的引物序列分别为小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H5 primer sequenceH5-F:CTCAATGCTTCCAAATGCTGH5-R:ATTTGACCCGAAGCTGAATG ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H22 primer sequence
H22-F:TACGGCCTCTGTCTGTGAGAH22-R:GAGAGGATGAGGGGAGGAGT ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H26 primer sequenceH26-F:CCTCATCCTCTCTGCCTTTGH26-R:ACGAATCAAACGCACCTTTT ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H31 primer sequenceH31-F:CATTCACATTTTCCCCCAACH31-R:CCTGCTACTATGTGTGTGCGTA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H33 primer sequenceH33-F:GAAACGAGGACAGGGATGAAH33-R:ACCTCCTTACCGCCTCACTT ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H37 primer sequenceH37-F:CCCCTGGTGAGAGTGGAAATH37-R:AGAAGGCGAAAAAGTGCAAA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H38 primer sequenceH38-F:AAGAGAAATGAGGCGTCAGGH38-R:GGTTGGAAACAAGCCAAATG ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H43 primer sequenceH43-F:GATAGGACCACGGATGCTGTH43-R:CTTGCTGACGCGCACTATAA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H44 primer sequence
H44-F:GGTGGTGGCAAAATTTGATTH44-R:CCACACACCTAATGCCTCCT ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H47 primer sequenceH47-F:CAGCTTGGCTTCAATCCTTCH47-R:CTCATCGTCCACATGGTTTG ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H51 primer sequenceH5I-F:GGTGGAGCTGACCTTACTGCH51-R:CCTTGTTCCCTGCCTCTCTC ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H54 primer sequenceH54-F:TCCATGAACCACGGTTACTTC
H54-R:GTGGGCACACAACCACAC ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H65 primer sequenceH65-F:GCTTTGCGATGTAAAACACGH65-R:GTTGGGAGGAAGACGATGAA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H70 primer sequenceH70-F:CAGCTTCTCCTCCCAAAATGH70-R:ATGGTGTGCTGACAAAACGA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H71 primer sequence
H71-F:GGAGACAGCCAGTTTCACCTH71-R:CGACACTGTGACTCGATGCT ；小 黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H75 primer sequenceH75-F:AAGGACGTTCACGTTCTGTTGH75-R:GGTGGGATGTGACATGTTGA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H80 primer sequenceH80-F:TGCGTGTCAAGGCTGTTTAGH80-R:CACATGGAGGCAAACACAAA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H82 primer sequenceH82-F:ACCATTGTGAAGTGCGAGTGH82-R:GGCACAGTGGGCTTATTGTC ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H84 primer sequence
H84-F:ACGTGCACAGGCAGGTCTH84-R:TGTAGGTGTGAGCAGTCTGGA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite H106 primer sequenceH106-F:CCTGCCCAATAACAGCTTTCH106-R:GGCAATCTCCAGGGTTTACA ；小黄鱼(Larimichthys polyactis) microsatellite Hlll primer sequenceHlII-F:TCACCGTGTTCCAGTTTATCCHlI1-R:TGCGCAGTGTCTTTTCTTTGo
图I :位点H5的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图2 :位点H22的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图3 :位点H26的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图4 :位点H31的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图5 :位点H33的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图6 :位点H37的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图7 :位点H38的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图8 :位点H43的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图9 :位点H44的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图10 :位点H47的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图11 :位点H51的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图12 :位点H54的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图13 :位点H65的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图14 :位点H70的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图15 :位点H71的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图16 :位点H75的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图；图17 :位点H80的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICR0SATELLITE分型图18 :位点H82的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICROSATELLITE分型图；图19 :位点H84的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICROSATELLITE分型图；图20 :位点H106的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICROSATELLITE分型图；图21 :位点Hlll的引物扩增24尾小黄鱼基因组DNA的MICROSATELLITE分型图；在图1-21中，1-24表示24尾小黄鱼。
具体实施例方式实施例II、小黄鱼微卫星分子标记富集文库的构建I. I基因组DNA的提取采用酚氯仿法提取基因组DNA，具体步骤如下剪取20mg尾鳍于I. 5ml离心管中，加入 570 μ L STE buffer (10mmol/L Tris-Cl, pH=8. 0; lOOmmol/L EDTA, pH=8. 0; IOOmmol/L NaCl)并将组织剪碎。加入10 μ L 20mg/ml的蛋白酶K和20 μ L 20% SDS，55-56°C消化。力口入600yL酹:氯仿:异戍醇(25:24:1)抽提两次，13000r/min离心5min,取上清。加入等体积-20°C预冷的无水乙醇,混勻，13000r/min离心5min,弃上清,用70%乙醇洗漆沉淀2 次，室温下晾干，然后加入 50-100 μ L TE buffer (lmmol/L EDTA，IOmmoI/L Tris-HCl,pH=8. 0)溶解DNA。紫外分光光度计检测DNA浓度，用TE buffer将其稀释至100 μ g/mL,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。DNA样品存于_80°C冰箱中备用。I. 2酶切、加接头及预扩增取250ng基因组DNA，用5U MseI内切酶充分酶切，反应体系为25 μ L。取IOyL上述酶切产物用Τ4连接酶与MseI街头(A:5，-TACTCAGGACTCAG-3 ’和B:5’ -GACGATGAGTCCTGAG)连接。以连接产物作为模板，用AFLP预扩增引物(5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3，)进行扩增。PCR 反应体系为 25μ L :1. 5mM MgCl2，0· 2mMdNTP,ΙμΜ MseI-N, IU Taq DNA polymerase 和 5 μ L 稀释的酶切连接的 DNA。PCR 反应程序94°C30s, 53°C Imin, 72°C Imin 20 个循环。PCR 产物用 Wizard PCR preps (Promega)纯化回收。I. 3磁珠富集，扩增、克隆测序及引物设计纯化回收产物与IOOnM生物素标记的(GT) 17、(GGT) 9和(CTAT) 8探针在60°C下杂交I小时。用连接有重复序列的链霉亲和素包裹的磁珠捕获杂交产物中的重复序列。然后洗脱、变性将目的片段富集并回收。回收得到的片段用上述PCR程序重新扩增、回收，然后与PMD18-T plasmid vector连接转化到DH5 α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选进行克隆测序。利用Primerf在线软件对获得的重复序列设计引物。2、小黄鱼多态性微卫星引物的筛选按I. I方法提取24尾小黄鱼个体的基因组DNA，然后I. 3得到的引物进行PCR扩增(正向引物5’端用荧光染料HEX或者6-FAM标记)。扩增反应体系为20μ :0. 5μΜ引物，0.2mM dNTP, I. 5mM MgCl2, IXPCR buffer, IU Taq DNA 聚合酶以及 50ng 模板 DNA。反应程序94°C 5min，94°C 30s，每个SSR位点最佳退火温度30s，72°C 30s，最后延伸5min。PCR产物用ABI PRISM 3730 DNA自动测序仪(Applied Biosystems)分离，片段长度用软件GeneMapper根据内标R0X-500确定。
3、小黄鱼多态性微卫星位点的遗传多态性检测利用软件Genepop3. 4检测哈迪-温伯格平衡(HWE)和连锁不平衡(LD)，软件Cervus2. O检测每个微卫星位点的等位基因数目(A)，观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。结果表明我们获得了 21个多态性的小黄鱼微卫星标记。每个位点的等位基因数目为2-22，观测杂合度和期望杂合度分别为O. 250-1. 000和O. 454-0. 958 (表I)。表I小黄鱼21个微卫星标记的遗传特征(基序、引物序列、退火温度和遗传多态
性参数)
Lckbs 级零就漏爾Primer scqBCBcesCS^S*)NTa HoHef
__range_values HS (CA)hiCTCAATGCTTCCAAATGCTG 17 128 W0J17 0J20 0319
ATTTGACCCGAAGCTGAATG H22 (CA)22I'ACGGCCTCTGICTGIGAGA 20 131-IE9 58 (K583 0JM5 0,000
GAGAGGATGAGGGGAGGAGT H26 (CT)uCCTCATCCTCTCTGCCTTTG 14 172-216 60 0J92 0J82 0,285
ACGAATCAAACGCACCTTTT H31 (CA)7(CA)4 CATTCACATTTTCCCCCAAC 2 1·162 59 §,250 0.454 0,058 CCTGCTACTATGTGTCiTCCGTA M33 (CA)1, GAAACGAGGACAGGGATGAA 16 167-199 _ OJOR (k.926 O.
ACCTCCTTACCGCCTCACTT M37 (CA)4(CA)5 CCCCTGGTGAGAGTGGAAAT 9 175-195 58 0M3 M34 0.016 AGAAGGCGAAAAAGTGCAAA H38 (CAG)n AAGAGAAATGAGGCGTCAGG 6 183-195 58 0J83 0.584 0.4S9 GGTTGGAAACAAGCCAAATG H43 (GThGATAGGACCACGGATGCTGT 8 16&1M 59 (X583 0J09 0.025
CTTGCTGACGCGCACTATAA 1144 (TG)11GGTGGTGGCAAAATTTGATT 21 196*276 59 0,542 0.952 0,000
CCACACACCTAATGCCTCCT H4 (CA)7c AGCTTQGCTTC A ATCCTTC 4 241-249 6Θ OM 0,471 0M7
CTCATCGTCCACATGGTTTG HS! (CAMCT)lj ΙΤΟΟΑΓιΓΤΟΑΓΓΤΤΛΓΤΓιΓ 7 193-2· 60 0M7 0M3 0.580 CCTTGTTCCCTGCCTCTCTC H54 (GT)1 /TCCATGAACCACGGTTACTTC 10 135-1 m 59 H411 U.785 Ο, ΗΚ
GTGGGCACACAACCACAC Mm (TG hnGClll'GCGArGlAAAACACG 5 135-153 5S 0.625 CI.6I0 QM7
G*I TGCiGACiCiAMiACCiATC AA _ (CT)1,CAGCnCrCCTCCCAAAATG 22 I 26 働 0,317 QS5B 0,398
ATQQTQTQdQAi'AAAAi'QA Mn (CA)7GGAGACAGCCAGTTTCACCT 12 149-173 62 0,917 0.874 0,780
权利要求
1.小黄鱼微卫星DNA分子标记,其特征在于所述的21个微卫星标记编号为H5,H22,H26, H31, H33, H37, H38, H43, H44, H47, H51, H54, H65, H70, H71, H75, H80, H82, H84, H106,H111，其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO. I, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ IDNO. 11，SEQ ID NO. 12，SEQ ID NO. 13，SEQ ID NO. 14，SEQ ID NO. 15，SEQ ID NO. 16，SEQ IDNO. 17，SEQ ID NO. 18，SEQ ID NO. 19，SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 所示。
2.根据权利要求I所述的小黄鱼微卫星标记，其特征在于所述21个微卫星标记H5，H22, H26, H31, H33, H37, H38, H43, H44, H47, H51, H54, H65, H70, H71, H75, H80, H82,H84，H106, Hlll的引物序列分别为 小黄鱼 microsatellite H5 primer sequence H5-F: CTCAATGCTTCCAAATGCTGH5-R: ATTTGACCCGAAGCTGAATG ； 小黄鱼 microsatellite H22 primer sequence H22-F: TACGGCCTCTGTCTGTGAGA H22-R: GAGAGGATGAGGGGAGGAGT ； 小黄鱼 microsatellite H26 primer sequence H26-F: CCTCATCCTCTCTGCCTTTG H26-R: ACGAATCAAACGCACCTTTT ； 小黄鱼 microsatellite H31 primer sequence H3I-F: CATTCACATTTTCCCCCAAC H31-R: CCTGCTACTATGTGTGTGCGTA ； 小黄鱼 microsatellite H33 primer sequence H33-F: GAAACGAGGACAGGGATGAA H33-R: ACCTCCTTACCGCCTCACTT ； 小黄鱼 microsatellite H37 primer sequence H37-F: CCCCTGGTGAGAGTGGAAAT H37-R: AGAAGGCGAAAAAGTGCAAA ； 小黄鱼 microsatellite H38 primer sequence H38-F: AAGAGAAATGAGGCGTCAGG H38-R: GGTTGGAAACAAGCCAAATG ； 小黄鱼 microsatellite H43 primer sequence H43-F: GATAGGACCACGGATGCTGT H43-R: CTTGCTGACGCGCACTATAA ； 小黄鱼 microsatellite H44 primer sequence H44-F: GGTGGTGGCAAAATTTGATT H44-R: CCACACACCTAATGCCTCCT ； 小黄鱼 microsatellite H47 primer sequence H47-F: CAGCTTGGCTTCAATCCTTC H47-R: CTCATCGTCCACATGGTTTG ；小黄鱼 microsatellite H51 primer sequenceH5I-F: GGTGGAGCTGACCTTACTGCH51-R: CCTTGTTCCCTGCCTCTCTC ；小黄鱼 microsatellite H54 primer sequenceH54-F: TCCATGAACCACGGTTACTTCH54-R: GTGGGCACACAACCACAC ；小黄鱼 microsatellite H65 primer sequenceH65-F: GCTTTGCGATGTAAAACACGH65-R: GTTGGGAGGAAGACGATGAA ；小黄鱼 microsatellite H70 primer sequenceH70-F: CAGCTTCTCCTCCCAAAATGH70-R: ATGGTGTGCTGACAAAACGA ； 小黄鱼 microsatellite H71 primer sequenceH7I-F: GGAGACAGCCAGTTTCACCTH71-R: CGACACTGTGACTCGATGCT ；小黄鱼 microsatellite H75 primer sequenceH75-F: AAGGACGTTCACGTTCTGTTGH75-R: GGTGGGATGTGACATGTTGA ；小黄鱼 microsatellite H80 primer sequenceH80-F: TGCGTGTCAAGGCTGTTTAGH80-R: CACATGGAGGCAAACACAAA ；小黄鱼 microsatellite H82 primer sequenceH82-F: ACCATTGTGAAGTGCGAGTGH82-R: GGCACAGTGGGCTTATTGTC ；小黄鱼 microsatellite H84 primer sequenceH84-F: ACGTGCACAGGCAGGTCTH84-R: TGTAGGTGTGAGCAGTCTGGA ；小黄鱼 microsatellite H106 primer sequenceH106-F: CCTGCCCAATAACAGCTTTCH106-R: GGCAATCTCCAGGGTTTACA ；小黄鱼 microsatellite Hlll primer sequenceHlII-F: TCACCGTGTTCCAGTTTATCCHlll-R: TGCGCAGTGTCTTTTCTTTG。
全文摘要
本发明公开了小黄鱼微卫星DNA分子标记。本发明通过构建小黄鱼微卫星(GT)17、(GGT)9和(CTAT)8富集文库，筛选小黄鱼多态性微卫星引物，以及对小黄鱼微卫星位点进行遗传多态性检测，开发了小黄鱼21个多态性丰富的微卫星标记。本发明可应用于小黄鱼种群的种群遗传结构和遗传变异水平等研究。
文档编号C12Q1/68GK102876668SQ20121028113
公开日2013年1月16日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者蒙子宁, 王乐, 林浩然 申请人:中山大学