一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用的制作方法

专利名称：一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及ー种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用。应用两步法半巢式-多重PCR技木，设计用于深加工食品中鸡、牛、羊、猪同时检测的试剂盒，将其灵敏度相比现有的PCR和荧光定量PCR技术提高1-3个数量级，可用于DNA严重降解的深加工食品中肉类种属的检测。
ニ.
背景技术：
肉制品的掺杂掺假是我国食品质量控制面临的重要挑战之一。近 年来，不法企业在利益的驱使下，使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类原料，冒充牛肉、羊肉等价格相对较高的肉制品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益。“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进ー步成为公众关注的焦点。近期，河南等地又出现了使用鸡肉、鸭肉等冒充羊肉串的事件。肉类食品掺假已成为我国食品质量安全的又一“潜规则”。以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术已成为食品中肉类种属鉴定的核心方法。根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来，实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得肉类含量的定量溯源成为可能。如今，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，且进入了国内权威的检测技术标准(SN/T 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法、GB/T 21101-2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法)，市场上也出现了相关的商品化试剂盒(Takara RealTime PCR Porcine DNA Detection Kit)，在对肉制品掺假进行控制与监管中发挥了重要作用。本实验室也研发了对四种肉类进行同时快速鉴别的应用多重PCR方法(专利申请号201210099651. 1)，可对食品中猪牛羊鸡成分进行高通量的同时快速鉴别。然而，在我们(国家农副产品质检中心)对肉类样品种属的实际检测中，无论使用上述标准中的PCR或荧光定量PCR方法，还是使用商品化的PCR试剂盒，对ー些经过深加工的肉制品中提取的DNA进行检测时，常常无法得到扩增条带或荧光信号。这些深加工肉制品主要包括肉松、火腿肠及红肠、熟制面制品中的肉馅等。据统计，在我们近期检测的108份深加工食品中，使用已有方法未能鉴别的有27份，占25. 0%。我们推测，这些食品中的肉类DNA经过深加工已经严重降解并片段化，导致作为检测模板的完整目标DNA片段极少，カロ之有可能存在一定的PCR反应抑制剂，现有的PCR或荧光定量PCR方法的灵敏度已经不能满足检测的需要。为了解决这ー问题，我们尝试了优化反应条件、使用两步法半巢式-多重PCR技术、截短引物等多种策略，经过试验，使用半巢式-多重PCR在确保特异性的前提下显著提升了检测灵敏度，在此基础上，我们开发了同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的高灵敏度试剂盒，可有效地对深加エ食品进行种属鉴别。
三.发明内容本发明需要解决的问题是针对目前对DNA严重降解的深加工食品中肉类种属鉴定缺乏有效方法的现状，应用两步法半巢式-多重PCR技术，开发ー种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的高灵敏度试剂盒，优化并确定试剂盒的使用方法，可对应用现有标准方法和试剂盒方法无法检测的深加工肉类食品进行种属鉴别。本发明的总体技术路线是以深加工食品中提取的总DNA为模板，首先使用ー对通用引物进行第一轮扩增，扩增目标为猪、牛、羊(包括山羊和绵羊)、鸡4个物种线粒体基因组上490bp的同源片段；然后将第一轮扩增产物作为第二轮扩增的模板，正向引物仍使用第一轮扩增的正向引物，反向引物使用猪、牛、羊、鸡4个物种的特异性引物，进行第二轮多重PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带分子量不同对肉类种属进行鉴别。基于上述两步法半巢式-多重PCR技木，对实验流程中的关键反应条件、试剂成分及浓度进行优化，将半巢式-多重PCR中两轮PCR反应所需试剂分别配制为预混液I和预混液2，开发出同时鉴别食品中猪、牛、羊、鸡四种成分的高灵敏度试剂盒。使用者只需将深加工食品中提取的总DNA与预混液I混合后进行第一轮PCR反应，继而将第一轮PCR产物与预混液2混合后进行第二轮PCR反应，大大筒化了操作步骤，降低了对操作者的专业要求，3-4小时即可对深加工食品中的4种肉类种属进行准确鉴别。 使用本发明研制的试剂盒对猪、牛、羊、鸡四种目标DNA及其组合、大豆、鱼、鹅、马、驴等物种DNA进行检测，结果表明本试剂盒的特异性良好，未有交叉反应和非特异性扩增；分别使用10倍梯度稀释的DNA模板，对本试剂盒对四种目标物种的检测灵敏度、Takara公司检测食品中猪源性成分的荧光定量试剂盒(Real Time PCR Porcine DNA DetectionKU)、出入境行业标准中SN/T 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法-实时PCR法、本实验室研制的多重PCR方法(专利申请号201210099651. I)的灵敏度进行验证并比较，本试剂盒方法的检测灵敏度比多重PCR方法提高了 2-3个数量级，比标准和商品化荧光定量试剂盒方法提高了 1-2个数量级。如“背景技木”中所述，在国家农副产品质检中心近期检测的108份深加工食品中，使用已有的标准方法和试剂盒未能鉴别的有27份，占25. 0%。应用本发明研制的试剂盒方法，成功地对这27份样品进行了种属鉴别，发现了 12例肉类掺假，验证了本试剂盒在深加工食品肉类种属鉴别方面的独特优势和实际应用价值。本发明的技术方案包括1.根据猪、牛、羊、鸡4个物种线粒体同源序列设计两步法半巢式-多重PCR的引物序列。2.应用两步法半巢式-多重PCR对各目标物种DNA和对照物种DNA进行检测，验证方法的特异性。3.优化反应条件和试剂浓度，设计构建鉴别食品中猪、牛、羊、鸡4种成分的试剂盒，确定试剂盒的使用方法。4.使用梯度稀释的目标物种DNA，验证本发明试剂盒的检测灵敏度，并与标准方法及商品化试剂盒的灵敏度作比较。5.使用本发明试剂盒方法，对应用现有方法未能鉴别的食品样品进行种属检測。详述如下
I.根据猪、牛、羊、鸡4个物种线粒体同源序列设计两步法半巢式-多重PCR的引物序列。本发明使用的引物包括第一轮PCR所使用的正向通用引物SMl和反向通用引物SM2，第二轮多重PCR使用的正向引物仍为SM1，反向引物为C(鸡)、M (羊)、B (牛)、P(猪)。本发明中，SIMl和C、M、B、P均采用本实验室研发的同时鉴别食品中这4种目标肉类成分的多重PCR技术的相同引物(专利申请号201210099651. I), SIM2为本发明根据4种目标物种线粒体基因组的高度同源序列设计的反向通用引物，与正向通用引物SIMl配对使用进行第一轮PCR反应，可以同时扩增出4个目标物种490 bp的同源序列作为第二轮多重PCR的模板。引物序列见表1，引物与各物种线粒体基因组的结合位点见附图I。表I.半巢式-多重PCR试剂盒所用引物序列
用途序 I (5’-3”
第一轮KR的IElSl aw切物
SM ICCCATC AAACATCTC ATCTTG ATGAAA
第二輪靈靈PCE 正fiM号Mfi
SIM2第一蛇 PCR 的反向 53用引物AAGTGGAAGGCGAAG AATCG
C第二轮多重FCR的S幽辨持异性引 物AAG ATACAG ATOAAGAAGAATG AGGCG
B* ニIfe多重 PCR 的 SfimiMi 引翁CTAGAAAAOTGTAACtACCCGTAATATAA
M第二轮多重 KR 的 S__ 辭お I.GCCTATC AATGCTGTCOCTATTGTCGC
P第二較多重 PCR SS_Stt5l )G CTGATAGTAG ATTTGTG ATG ACCGTA
2.应用两步法半巢式-多重PCR对各目标物种DNA和对照物种DNA进行检测，验证方法的特异性。分别使用100 pg XI、牛、羊、猪4种目标物种的基因组总DNA及其各100 pg两两组合的混合DNA、以及100 pg大豆、鱼、马、驴四种对照物种DNA作为模板，首先使用SMl和SIM2作为引物进行20个循环的第一轮PCR反应，再取I UL反应产物作为模板，使用SIMl、C、B、M、P混合引物进行第二轮多重PCR反应，取10 ii L产物进行琼脂糖凝胶电泳，图谱(附图2)表明，各反应管均未发生交叉反应和非特异性扩增，作为对照的其他物种DNA也均未发生扩增，表明应用两步法半巢式-多重PCR检测个目标物种及其混合DNA特异性良好。3.优化反应条件和试剂浓度，设计构建鉴别食品中猪、牛、羊、鸡4种成分的高灵敏度试剂盒，确定其使用方法。在验证了两步法半巢式-多重PCR同时鉴别目标物种的特异性基础上，我们对第ー轮PCR和第二轮多重PCR的反应体系组成、PCR反应条件进行了优化，以设计高灵敏度试剂盒。优化的指标包括引物浓度、多重PCR引物配比、退火温度、反应循环数、延伸时间。在优化的条件下，我们将第一轮PCR和第二轮多重PCR的反应体系中除模板外的所有成分分别配制为试剂盒的预混液I和预混液2，制作试剂盒，其成分分别为
(I)预混液 I :其中包含引物 SMl 0.40.4 iiM，Taq_1.25 U，dNTP 各
0.2 uM, PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 I. 5 mM，预混液 I 储藏条件为 4 0C,保质期半年。(2)预混液 2 :其中包含引物 SMl 0. M，引物 P 0.4 iiMj_C0.4 y M，引物 B 0.4 iiM，Taq_1.25 U，dNTP 各 0.2 y M，PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM,KCl 50mM, MgCl2 I. 5 mM，溴酚蓝5% (v/v)预混液I储藏条件为4° C，保质期半年。将优化的两步法半巢式-多重PCR反应条件作为该试剂盒的说明书，详述如下
(I)将从肉松、火腿肠等深加工食品中提取的总DNA I ii L与19 UL本试剂盒中的预混液I在冰上混合均匀后，于普通PCR仪上进行扩增反应，反应条件如下95 0C预变性3min，20 个循环的 95 0C 30 s、54 0C 30 s、72 0C 40 s，最后 72 0C 延伸 7 min。(2)取2 UL反应产物，与48 U L本试剂盒中的预混液2在冰上混合均匀后，于普通PCR仪上进行扩增反应，反应条件如下95 °C预变性3 min，30个循环的95 °C 30 S、52 °C 30 s、72 °C 40 s，最后 72 °C 延伸 7 min。(3)取10 u L反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，使用100 bp至1000 bp的DNA分子量标准作为对照。将凝胶在紫外灯下观察、拍照，根据特异性条带的分子量大小对食品中四种肉类的种属进行同时鉴定，鸡、牛、羊、猪的特异性条带大小分别为216 bp, 263 bp,322 bp 和 387 bp。4.使用梯度稀释的目标物种DNA，验证本发明试剂盒的检测灵敏度，并与标准方法及商品化试剂盒的灵敏度作比较。分别使用10倍梯度稀释的4种目标物种DNA为模板，应用本发明试剂盒进行检 测，在反应体系中仅加入I Pg模板DNA吋，仍可观察到目标条带(附图3)，表明本试剂盒对于目标物种的检测灵敏度达到Ipg/反应。同样使用10倍梯度稀释的4种目标物种DNA为模板，应用本实验室开发的多重PCR方法(专利申请号201210099651. I)对4种目标物种进行检测，其检测限为100-1000pg/反应；应用我国出入境行业标准SN/T 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法和Takara公司猪源性检测试剂盒提供的实时荧光PCR法对猪的基因组DNA进行检测，按照Ct值小于35的模板量进行灵敏度确认，其检测限为10-100 pg/反应。综上，本发明试剂盒对食品中鸡牛羊猪四种物种鉴别的灵敏度较多重PCR法高2-3个数量级，较市售试剂盒和标准中提供的实时荧光PCR法提高1-2个数量级。5.使用本发明试剂盒方法，对应用现有方法未能鉴别的食品样品进行种属检測。在国豕农副广品质检中心近期检测的108份深加工肉制品中，使用已有的标准方法和试剂盒未能对其种属进行鉴别的有27份，占25. 0%，包括25份肉松、I份火腿肠和I份炒制肉馅，使用Takara种属鉴定试剂盒和出入境行业标准的Real-time PCR法鉴定时均未有任何荧光信号。应用本发明研制的半巢式-多重PCR试剂盒方法，成功地对这27份样品进行了种属鉴别，其中12份均存在着实际种属与标注的肉类种类不符的情况，均为使用猪肉冒充牛肉松或羊肉馅，证明了本试剂盒适用于现有方法不能鉴别的深加工食品中肉类种属的鉴定。本发明的有益效果是尽管现有检测标准、商品化试剂盒PCR和实时荧光PCR法已经为肉制品种属鉴定提供了快速、灵敏的检测技木，但在实际检测中，仍有部分深加工肉制品由于DNA严重降解及PCR反应抑制剂的存在，使得上述方法的灵敏度无法达到种属鉴定的要求。未解决这ー问题，本发明开发了基于半巢式-多重PCR的食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分同时检测的高灵敏度试剂盒，其灵敏度较现有PCR方法提高了 2-3各数量级，较实时荧光PCR法提高了 1-2个数量级，可达到Ipg/反应。在保证检测特异性和准确性的前提下，可对应用现有技术无法检测的深加工食品实现种属鉴定，是现有技术中灵敏度最闻的种属检测方法。应用本试剂盒，可成功地对现有方法不能鉴别的深加工食品进行肉类种属的鉴定，对深加工食品中肉类掺假进行控制。此外，本试剂盒分别将半巢式PCR两步反应的试剂进行集成，操作简便，降低了人员要求。因此，本发明提供的试剂盒是目前唯一专门针对深加工食品中多种肉类鉴别的方法，方法的灵敏度优于现有技术，可用于政府食品安全检测部门、大型食品销售企业对深加工肉制品掺假的监管与控制，具有显著的实用价值。
四.


图I各目标物种线粒体基因组中的半巢式-多重PCR引物结合序列。C:X| ;B:牛；P 猪；M:羊(包括绵羊S和山羊G);SM1 :正向通用引物；S頂2 :反向通用引物。方框内的序列为引物结合位置。图2半巢式-多重PCR试剂盒法对各目标物种和对照物种的检测特异性。泳道 1-15分别将鸡、牛、羊、猪、鸡加牛、鸡加羊、鸡加猪、牛加羊、牛加猪、羊加猪、4种目标肉类的混合物、鱼、马、驴、大豆的总DNA作为模板，使用半巢式-多重PCR试剂盒进行物种检測。姆种目标物种的模板DNA为100 pg/反应。M:DNA分子量标准。图3半巢式-多重PCR试剂盒法对各目标物种的灵敏度验证。各泳道代表的每反应中的模板量分别为泳道1-3 :鸡总DNA 10 pgU pg和0.1 pg ;泳道4-6 :牛总DNA 10pg、l pg 和 0.1 pg ;泳道 7-9 :羊总 DNA 10 pgU pg 和 0.1 pg ;泳道 10-12 :猪总 DNA 10pg、l pg和0.1 pgo M:DNA分子量标准。
五.
具体实施例方式 I.材料与试剂
Ex Taq DNA聚合酶及反应缓冲液、dNTP、MgCl2、DNA分子量标准DL 1000、电泳上样缓冲液、Tris-HCl等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；电泳级琼脂糖购自南京生兴生物公司；引物及探针委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。2.仪器与设备
PCR 仪(Veritee96-well，美国 ABI 公司)；核酸电泳仪(SUB-cell GT，美国 Bio-Rad 公司);凝胶成像系统(Universal Hood II,美国Bio-Rad公司);高速冷冻离心机(3-18K,美国Sigma公司)；荧光定量PCR仪(7500，美国ABI公司)。 3.两步法半巢式-多重PCR对各目标物种DNA检测特异性验证
两步法半巢式-多重PCR的引物设计见图1，方法设计策略见“发明内容”。測定试剂盒法或氛-氯仿抽提法提取的目标肉类的总DNA浓度，调整浓度至100 pg/yl，作为方法特异性验证的模板。分别将100 pg鸡、牛、羊、猪4种目标物种的基因组总DNA及其各100Pg两两组合的混合DNA、以及100 pg大豆、鱼、马、驴四种对照物种DNA作为模板，首先使用SIMl和SM2作为引物进行20个循环的第一轮PCR反应，反应体系20 u L，反应条件为95 °C 预变性 3 min，20 个循环的 95 °C 30 s、54 °C 30 s、72 °C 40 s，最后 72 °C 延伸7 min。再取I U L反应产物作为模板，使用SMI、C、B、M、P混合引物进行第二轮多重PCR反应，反应体系50 yL，反应条件为95 °C预变性3 min，30个循环的95 °C 30 s、52 °C30 s、72 °C 40 s，最后72 °C延伸7 min。取10 U L产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现交叉反应与非特异性扩增，判断半巢式-多重PCR方法的特异性。4.半巢式-多重PCR反应条件优化与试剂盒设计
分别调整两步反应中的引物浓度、多重PCR引物配比、退火温度、反应循环数、延伸时间，通过对条带亮度和反应特异性的比较，以获得最佳的反应条件。
在优化的条件下，将第一轮PCR和第二轮多重PCR的反应体系中除模板外的所有成分配制为试剂盒的预混液I和预混液2，分别直接用于半巢式-多重PCR的第一轮和第二轮反应。5.半巢式-多重PCR试剂盒灵敏度确认以及与现有标准、试剂盒方法的比较 将上述目标物种的总DNAlO倍梯度稀释，分别应用本发明试剂盒、多重PCR法(专利申请号201210099651. I)、荧光定量PCR法(出入境行业标准SN/T2051-2008、Takara试剂盒)进行物种检测，通过观察电泳条带确定半巢式-多重PCR和多重PCR的检测灵敏度，通过Ct值为35的模板量确定荧光定量PCR的灵敏度并进行比较。
权利要求
1.一种基于半巢式-多重PCR的同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种肉类成分的试剂盒，其特征是由以下试剂构成 (1)预混液I :含引物 SMl 0.4 iiM，引物 SM2 0.4 y M，Taq 酶 I. 25 U，dNTP 各 0. 2U M, PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 I. 5 mM，预混液 I 储藏条件为 4 °C，保质期半年； (2)预混液2:含引物SMl 0. 4u M，引物P 0. 4 PM，引物C 0. 4 PM，引物B 0. 4 u M,引物 S 0. 4 u M, Taq 酶 I. 25 U，dNTP 各 0. 2 u M, PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM,MgCl2 I. 5 mM,溴酹蓝5%v/v,预混液2储藏条件为4° C,保质期半年。
2.权利要求I所述试剂盒用于深加工食品中肉类成分的种属鉴定方法，其特征是由以下步骤构成 (1)将从肉松、火腿肠深加工食品中提取的总DNAI ii L与19 UL本试剂盒中的预混液I在冰上混合均匀后，于普通PCR仪上进行第一轮扩增反应，反应条件如下95 0C预变性 3 min，20 个循环的 95 0C 30 s、54 0C 30 s、72 0C 40 s，最后 72 0C 延伸 7 min ； (2)取2UL反应产物，与48 UL本试剂盒中的预混液2在冰上混合均匀后，于普通PCR仪上进行第二轮扩增反应，反应条件如下95 °C预变性3 min，30个循环的95 °C 30s、52 °C 30 s、72 °C 40 s，最后 72 °C 延伸 7 min ； (3)取10U L反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，使用100 bp至1000 bp的DNA分子量标准作为对照，将凝胶在紫外灯下观察、拍照，根据特异性条带的分子量大小对食品中四种肉类的种属进行同时鉴定，鸡、牛、羊、猪的特异性条带大小分别为216 bp, 263 bp, 322 bp和 387 bp。
3.权利要求I所述试剂盒在现有PCR、荧光定量PCR方法无法鉴别肉类种属的深加工食品进行检测或肉类掺假鉴别中的应用。
全文摘要
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用。基于两步法半巢式-多重PCR技术，设计了一种用于深加工食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分同时鉴别的高灵敏度试剂盒。经验证，本试剂盒通过使用半巢式-多重PCR技术，在保证检测特异性的前提下，极大地提高了现有以PCR技术为基础的食品物种检测方法的检测灵敏度，其灵敏度相比于普通PCR方法提高了2-3个数量级，比荧光定量PCR方法提高了1-2个数量级。本试剂盒可成功地对PCR、荧光定量PCR不能有效鉴别的肉松、肉丸等深加工食品中的肉类成分进行准确鉴定。
文档编号C12Q1/68GK102776289SQ20121028103
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者张弛 申请人:南京市产品质量监督检验院