专利名称：区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法
技术领域：
本发明涉及一种观察水稻纹枯病菌丝的方法，特别涉及一种区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，能应用于抗病品种的选育。
背景技术：
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)属半知菌亚门真菌,所引起的水稻纹枯病是我国水稻的“三大”病害之一，这使得选育抗病品种显得异常重要。抗病品种的选育以病原菌与植物的互作机制为基础，利用显微镜观察病 原菌在寄主植物细胞内菌丝生长发育以及形态变化是评价植物抗性的最直接的证据之一，而侵入寄主植物细胞内的菌丝不易染色，因而不利显微镜观察。目前对立枯丝核菌和寄主植物的互作研究中，采用火棉粘贴法，但只可以观察到立枯丝核菌浸染结构的形成；采用的整叶染色透明法，只可以观察到菌丝体在寄主植物表面的生长情况，不能有效区分水稻叶鞘表面和内部的菌丝体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，该方法用卡拉唑黑E染料染色水稻纹枯病组织，利用荧光显微镜的荧光差异显示从而有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体。为了解决上述技术问题，本发明提供一种区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，包括以下步骤I)、将直径为O. 8^1. 2mm的纹枯菌菌丝块接种到PDA培养基中进行培养，直至形成直径为I 2 mm的白色未成熟菌核(时间约为6 8天);培养条件为温度为27±1°C ;暗培养;2)、将步骤I)所得的白色未成熟菌核接种到水稻叶鞘内侧，直至水稻叶鞘的接种位点上出现病斑(时间约为3天);培养条件为16小时光照，光照强度45 60 μ mo I m-2.s-1，温度为27±1°C ；8小时暗培养，温度为27±1°C ;上述光照和暗培养交替进行；相对湿度彡95% ；3)、割取上述长度为2 4cm含有病斑的水稻叶鞘，放入透明缓冲液中浸泡至水稻叶鞘脱色透明，并用卡拉唑黑E染料室温染色h(即放入卡拉唑黑E染料中于室温下浸泡7 9 h);得染色叶鞘；4 )、将所述染色叶鞘进行荧光显微镜观察。作为本发明的区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法的改进步骤4)中的荧光显微镜观察为荧光显微使用荧光滤片模块A (激发滤片BP340 nm - 380 nm，分光镜400 nm，发射滤片LP 425 nm)、I3 (激发滤片BP450 nm - 490 nm，分光镜510 nm，发射滤片LP 515 nm)和N2. I (激发滤片BP515 nm - 560 nm,分光镜580 nm,发射滤片LP590 nm)。
作为本发明的区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法的进一步改进步骤3)中透明缓冲液的制作方法为将体积浓度为95%的乙醇溶液29(T310 ml、氯仿145 155 ml、体积浓度为90%乳酸溶液12(Tl30ml、苯酚145 155 g和水合氯醛440 460 g均勻混合；步骤3)中的卡拉唑黑E染料的制作方法为将O. 9^1. Ig卡拉唑黑E (Chlorazolblack E, C1144, Sigma)溶解于1000 ml的乳油中均勻混合；乳油由以下体积含量的成分组成78 82%的乳酸以及相同体积含量的甘油和蒸馏水。在本发明中，PDA培养基为常规培养基；其配方为马铃薯200 g/Ι+葡萄糖20g/Ι + 琼脂 5 10 g/l，pH 为 7.0。PDA培养基的制作方法具体如下称取洗净去皮后的马铃薯200 g并切成小块，力口 水煮烂，用多层纱布过滤，在所得的滤液中加葡萄糖20 g和琼脂5 10 g，用蒸馏水定容至IL ;均匀混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节pH为7. O ;于121°C灭菌20分钟左右，得PDA培养基。依照本发明的方法，则可以利用荧光显微镜的荧光差异显示，叶鞘内部发红色荧光的菌丝体与在叶鞘表面呈黑色的菌丝体形成足够的反差，有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体。本发明的观察水稻纹枯病菌丝的方法，属于提供一种用卡拉唑黑E染料染色水稻纹枯病组织，利用荧光显微镜的荧光差异显示有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体的方法。水稻叶鞘纹枯病的病组织经透明处理后用卡拉唑黑E染色，荧光显微观察发现卡拉唑黑E染色使纹枯菌菌丝体的自发荧光红移。在透射明场下发现，叶鞘表面的菌丝体被卡拉唑黑E染色后呈黑色；在蓝光照射下，被染色的叶鞘内部的菌丝体发红色荧光，与叶鞘细胞所发的黄绿色背景荧光形成反差而易被分辨；在绿光照射下，染色叶鞘内部的菌丝体发很强的红色荧光，而除尽叶绿素的叶鞘细胞所发的红色荧光微弱，二者间形成的反差使叶鞘内部的菌丝体能被很容易地分辨出来。这样叶鞘内部发红色荧光的菌丝体与在叶鞘表面呈黑色的菌丝体形成足够的反差，二者间很容易被区分开来。综上所述，本发明首次应用卡拉唑黑E染色纹枯病菌丝，而且利用不易染色寄主组织内的菌丝体，而菌丝体自发红色荧光，与叶鞘表面染成黑色的菌丝体形成差异，从而易于观察。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图I是显微图像示卡拉唑黑E染色后水稻叶鞘内外纹枯菌菌丝体的荧光差异显7j\ (Fig. I: Microscopic images show the differential fluorescence display of R.solani mycelia inside and outside of rice leaf sheaths after chlorazole blackE staining)。图像是激光扫描共聚焦显微镜在透射光明场下的扫描成像与在514 nm激光激发下检测600-750 nm荧光的共聚焦成像的合并图。被卡拉唑黑E深染的菌丝体(主要是叶鞘表面的菌丝体)呈黑色；被弱染的叶鞘内部的菌丝体发红色荧光而呈红色。
A示从叶鞘表面的菌丝从侵染垫(星号)和裂片状附着胞样结构(箭)侵入及菌丝顶端(箭头)直接侵入叶鞘表皮细胞；标尺示75 μπι。B示叶鞘表面的菌丝形成裂片状附着胞样结构(箭)侵入和菌丝顶端(箭头)直接侵入叶鞘表皮细胞；标尺示50 μ m。C示叶鞘表面的菌丝从气孔(箭)侵入叶鞘并蔓延；标尺示75 μ m。
D示菌丝形成裂片状附着胞(箭)侵入叶鞘表皮细胞并形成菌丝侵入相邻细胞；标尺示50 μ m。E示可能在叶鞘角质层下细胞壁内生长的菌丝(箭头)；标尺示100 μπι。
具体实施例方式实施例I、一种观察水稻纹枯病菌丝的方法，依次进行以下步骤I)、将直径为Imm左右的纹枯菌菌丝块接种到PDA培养基中进行培养，直至菌丝体生长形成直径约I _左右的白色未成熟菌核(时间约为7天);培养条件为温度为27±1°C;暗培养；PDA培养基为马铃薯200 g/Ι+葡萄糖20 g/Ι +琼脂5 10 g/1，pH为7. O。2)、将步骤I)所得的白色未成熟菌核接种到水稻叶鞘内侧，直至水稻叶鞘的接种位点上出现病斑(时间约为3天)；培养条件为16小时光照，光照强度45 μ mo I m-2. s-1,温度为27土TC ；8小时暗培养，温度为27土TC ;上述光照和暗培养交替进行；相对湿度彡 95% ；3)、割取上述长度为2 4 cm左右的含有病斑的水稻叶鞘室温下放入透明缓冲液中浸泡至水稻叶鞘脱色透明，并用卡拉唑黑E染料室温染色8 h(即放入卡拉唑黑E染料中于室温下浸泡8小时)；得染色叶鞘。透明缓冲液的制作方法为按顺序依次加入体积浓度为95%的乙醇溶液300 ml、氯仿150ml、体积浓度为90%乳酸溶液125ml、苯酹150 g和水合氯醒450 g,均勻混合后得透明缓冲液。卡拉唑黑E染料的制作方法为将Ig卡拉唑黑E (Chlorazol black E, C1144,Sigma)溶解于1000 ml的乳油中均匀混合；乳油由以下体积含量的成分组成80%的乳酸、10%的甘油和10%的蒸馏水。4)、将染色叶鞘进行荧光显微镜观察荧光显微镜观察为荧光显微使用荧光滤片模块A (激发滤片BP340 nm - 380nm,分光镜400 nm,发射滤片LP 425 nm)、13 (激发滤片BP450 nm - 490 nm,分光镜510nm,发射滤片LP 515 nm)和N2. I (激发滤片BP515 nm - 560 nm,分光镜580 nm,发射滤片 LP 590 nm)。依照上述方法，则可以利用荧光显微镜的荧光差异显示，叶鞘内部发红色荧光的菌丝体与在叶鞘表面呈黑色的菌丝体形成足够的反差，有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体。如图I所示。S卩，在本发明中，上述已经染色叶鞘用荧光显微镜观察，则可以利用荧光显微镜的荧光差异显示有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体。即，本发明能应用于抗病品种的选育。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本 发明的保护范围。
权利要求
1.区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，其特征是包括以下步骤 1)、将直径为O.8^1. 2mm的纹枯菌菌丝块接种到PDA培养基中进行培养，直至形成直径为I 2 mm的白色未成熟菌核；培养条件为温度为27±1°C ;暗培养； 2)、将步骤I)所得的白色未成熟菌核接种到水稻叶鞘内侧，直至水稻叶鞘的接种位点上出现病斑；培养条件为16小时光照，光照强度45 60 μ mo I m_2. s_l，温度为27± 1°C;8小时暗培养，温度为27±1°C ;上述光照和暗培养交替进行；相对湿度彡95% ； 3)、割取上述长度为2 4cm含有病斑的水稻叶鞘，放入透明缓冲液中浸泡至水稻叶鞘脱色透明，并用卡拉唑黑E染料室温染色h ;得染色叶鞘； 4 )、将所述染色叶鞘进行荧光显微镜观察。
2.根据权利要求I所述的区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，其特征是所述步骤4)中的荧光显微镜观察为荧光显微使用荧光滤片模块A(激发滤片BP340 nm -380 nm,分光镜400 nm,发射滤片LP 425 nm)、13 (激发滤片BP450 nm - 490 nm,分光镜510 nm,发射滤片LP 515 nm)和N2. I (激发滤片BP515 nm - 560 nm,分光镜580 nm,发射滤片LP 590 nm)。
3.根据权利要求I或2所述的区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，其特征是所述步骤3)中 所述透明缓冲液的制作方法为将体积浓度为95%的乙醇溶液29(T310 ml、氯仿145 155 ml、体积浓度为90%乳酸溶液12(Tl30ml、苯酚145 155 g和水合氯醛440 460 g均勻混合； 步骤3)中的卡拉唑黑E染料的制作方法为将O. 9^1. Ig卡拉唑黑E溶解于1000 ml的乳油中均匀混合；所述乳油由以下体积含量的成分组成78 82%的乳酸以及相同体积含量的甘油和蒸馏水。
全文摘要
本发明公开了一种区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，包括以下步骤 1)将直径为0.8~1.2mm的纹枯菌菌丝块接种到PDA培养基中进行培养，直至形成直径为1～2 mm的白色未成熟菌核； 2)将白色未成熟菌核接种到水稻叶鞘内侧，直至水稻叶鞘的接种位点上出现病斑；3)割取上述长度为2～4cm含有病斑的水稻叶鞘，放入透明缓冲液中浸泡至水稻叶鞘脱色透明，并用卡拉唑黑E染料室温染色7~9 h；得染色叶鞘；4)将所述染色叶鞘进行荧光显微镜观察。采用本发明的方法可以利用荧光显微镜的荧光差异显示有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体。即，本发明能应用于抗病品种的选育。
文档编号G01N21/76GK102866146SQ20121019963
公开日2013年1月9日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年3月23日
发明者毛碧增, 安千里, 刘雪辉 申请人:浙江大学