专利名称：一种促进水稻生长和防治水稻纹枯病的假单孢菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种假单孢菌属的菌株，特别是涉及一种利用微生物筛选技术，从水稻叶围分离获得的对水稻苗期有较强的促生作用，以及对水稻纹枯病有较好防治效果的假单孢菌菌株。
背景技术：
水稻纹枯病(Rice sheath blight)是我国稻区，特别是华南及长江流域高温、高湿地区的重要病害，一方面，由于目前推广的水稻品种缺乏高抗纹枯病基因，利用抗病品种尚未获得较满意的防病效果，加之，随着矮杆品种和杂交水稻的大面积推广及受水田管理等措施的影响，水稻纹枯病发生面积正逐年扩大，因此导致我国水稻产量的年损失在10％以上；另一方面，目前在水稻生产上主要是使用井冈霉素来防治纹枯病，由于长期单一使用，造成其药效下降及产生抗药性，而Monceren等防治纹枯病的化学农药又存在有毒性及残留量的问题，且污染环境，所以探索新的防治途径是非常必要的。
对水稻纹枯病的生物防治研究目前国外已取得比较大的进展，我国先后在南京、北京、浙江、重庆等地筛选到对水稻纹枯病菌有一定拮抗作用的菌株。陈志谊等调查了水稻部分生理、生化指标和水稻纹枯病的抗性关系，并筛选到对水稻纹枯病菌有较强作用的枯草芽孢杆菌B-916(Bacillus subtilis)；另有报道芽孢杆菌属A30、R2以及青霉属(Penicillium spp.)的Z88、木霉属(Trichoderma spp.)的农抗120放线菌(actinomycetes)等菌株对水稻纹枯病菌有一定的拮抗、防治作用，其中B-916、农抗120在田间试验中取得了较好的防治效果。但在利用微生物进行农作物病虫害的防治中，对致黄假单孢菌的研究和利用还没有见相关报道。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供一种以四川稻区水稻纹枯病病原菌AG-1作为指示菌株，从水稻叶围分离获得的对水稻苗期有较强的促生作用，以及对水稻纹枯病有较好防治效果的假单孢菌菌株。
本发明的具体技术方案如下本发明属于假单孢菌属的菌种，该菌株为致黄假单孢菌(Pseudomonas aureofaciens B34)(以下简称为B34菌株)，是从我国四川省生态地区的水稻植株的叶围上分离、筛选出的，其已于2003年5月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM203033。
本发明所述的B34菌株具有下述性质A、形态特征在蛋白胨查氏培养基、牛肉浸汁琼脂培养基30℃培养2～4天后，用光学显微镜和电子显微镜进行观察，B34直杆状，不呈螺旋状，细胞单个，宽度为0.7～0.8微米，长度为1.2～2微米，以极生鞭毛运动，不产生鞘或突起物，没有菌柄，不产生芽孢。菌体革兰氏染色呈阴性，抗酸染色阴性。
B、细胞壁化学组分分析菌株不含有二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)，无特征性糖。
C、培养特征a、培养基牛肉浸汁琼脂菌落微黄，表面光滑，边缘整齐。
b、桑塔斯琼脂菌落乳脂色，表面小突起，边缘平滑。
c、营养琼脂菌落乳脂色，小脊状，边缘粗糙。
d、蛋白胨查氏琼脂菌落微黄，有突起，边缘叶片状。
D、B34菌株的生理、生化特征B34菌株在6.5％氯化钠培养基上不生长，接触酶、氧化酶、硝酸盐还原反应、精氨酸双水解酶反应呈阳性；能利用蔗糖作为碳源产果聚糖，能水解卵磷脂、七叶灵及乙酰胺；甲基反应、V-P反应、吲哚反应、H2S反应、赖氨酸脱羧酶反应、鸟氨酸脱羧酶反应、苯丙氨酸脱羧酶反应呈阴性；不能液化明胶，不能利用甘露醇，不能水解淀粉、尿素，脂酶实验呈阴性。不能利用蜜二糖、L-鼠李糖、肌醇产酸，能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、核糖产酸。
E、菌种鉴定结果通过形态特征、细胞壁化学成分，以及革兰氏染色、抗酸性实验等结果表明B34菌株形态为杆状、细胞单个、以极生鞭毛运动，不形成鞘或突起物，没有菌柄，不产生芽孢，革兰氏为阴性，抗酸染色为阴性，专性好氧，从细胞壁成分看属于假单孢菌属(Pseudomonas)，从培养特征和生理生化实验定种原则分析，由于B34菌株的宽度为0.7～0.8微米×1.2～2微米，菌株表面有微黄色调，基内菌体无色素，且生理生化特征与致黄色假单孢菌很相似，所以菌株定名为致黄假单孢菌(Pseudomonasaureofaciens)。
本发明对水稻苗期有较强的促生作用，且对水稻纹枯病有较好的防治效果，其用量少，见效快，抑菌率达到71.5％以上，有效地解决了水稻病虫害对现有生物农药所产生的抗药性问题。
图1为B34菌株的菌落形态(20 000×)图2为B34菌株对水稻纹枯病病原菌的致畸效应(包括A、B和C)图中标记A为扭曲的菌丝(900×) B为空壳菌丝(500×) C为正常菌丝(1800×)
具体实施例方式实施例1B34菌株的筛选方法将从四川温江各试验田采集的水稻根、茎、叶等组织按每份2.5克称取，用无菌水漂洗3次，再将切成2厘米长的根、茎、叶及菌核，挑取适量置于装有无菌水的250毫升锥形瓶中，在25℃下以120转/分的转速振荡培养12小时，然后分别吸取1毫升菌液，用浓度梯度法涂布于PDA平板上(马铃薯200克、蔗糖10～20克、琼脂17～20克、水1000毫升)，置于26～28℃恒温培养箱中培养。待48小时后挑取培养特征相异的单个菌落，经反复纯化后待测。先用点接法初选，然后把有抑菌圈的菌株采用平板对峙培养法。
用点接法共检测分离到150个细菌菌株对水稻纹枯病菌菌丝生长有抑制作用。通过对峙法测定筛选到来源于水稻根部编号为B34的菌株，其生长速度最快，经过4次重复测定其抑菌带宽度达到10.3毫米。
实施例2拮抗菌对水稻纹枯病菌离体防效试验选拔节期水稻的稻一完全叶，剪去叶尖和叶基，取中部8cm长的叶段。将叶段在发酵菌液(浓度约为108个/毫升)中浸5分钟，再将处理后的叶段置于滤纸上并放入有无菌水的培养皿中，重复12皿(3叶段/皿)。同时在叶段一端接种直径为4毫米的同菌龄的纹枯病菌菌丝块，置于培养箱中光照培养，3天后调查发病叶片数和病斑长度。
B34菌株对水稻纹枯病的离体防效远高于清水处理，且防效高于井冈霉素。其中，B34菌株的离体防效达到81.00％，井冈霉素的离体防效为73.56％。在田间小区试验中，B34菌株的防效最高达到48.74％，而井冈霉素的田间防效为27.38％，真菌木霉的田间防效为24.17％。B34菌株还表现出水稻千粒重有较好的促进作用，千粒重为26.31克，而未处理的水稻的千粒重为23.80克，两者差异显著。
实施例3拮抗菌抗生性研究A、拮抗菌对纹枯病菌的抑菌率测定将同龄菌丝块置于经过微孔滤膜过滤的细菌发酵液中浸5分钟，然后置于PDA平板上28℃培养，清水对照，计算抑菌率。结果抑菌率达到71.5％。
B、拮抗菌对纹枯病菌丝的致畸作用测定将拮抗菌用对峙法接种，挑取对峙边缘的纹枯病菌丝体和正常菌丝体于普通光学镜下观察，并经过电镜扫描检测。
通过光学显微镜及电子显微镜的观察，可以检测到正常的纹枯病菌丝大小，其原生质均匀、菌丝呈圆形、健壮、菌丝节间较长。而经B34菌株作用的菌丝体呈严重的扭曲、原生质溢出、所剩菌丝体成空壳。
C、拮抗菌对纹枯病菌核萌发的影响将无菌载玻片浸入融化的无菌PDA培养基中，使之表面附上一层培养基琼脂，取出放在培养皿内，每皿2片，皿内加5毫升无菌水保湿。从预先培养纹枯病菌的平板上筛选大小、形成时间一致的菌核，置于浓度为108个/毫升的发酵菌液中处理10秒，然后放在载玻片的琼脂上，每片3粒，粒距为1.5厘米，每次处理8片(24粒)，于30℃培养箱中培养，24小时后镜检菌核的萌发情况。结果表明，经过菌液处理后菌核萌发指数降低了69.0％。
D、拮抗菌株对菌核形成的影响将同龄直径为5毫米的纹枯病菌丝块置于发酵滤液经过微孔滤膜反复过滤的收集液体与PDA混合的培养基上，置于30℃培养，检测菌核形成的时间。结果菌核形成时间延长了24小时。
实施例4拮抗菌在水稻植株上的定殖实验A、抗Amp菌的诱导将B34菌株接种到含有少量氨苄青霉素的YSP液体培养基中，诱导震荡培养，待3天后，稀释并涂布含有氨苄青霉素的PDA平板，培养，48小时后挑取单菌落，在逐步加高抗生素的平板上诱导筛选。在PDA平板上转数代后，挑取拮抗性和外部菌落形态与原菌落无差异的菌株备用。将菌株在YSP液体培养基中以120转/分培养48小时，待用。
B、定殖曲线的测定将水稻两优681按常规方法浸种、催芽播于实验水泥池中，供两个小区，每小区重复4次，随机排列。待分蘖盛期喷施菌液。分别在喷施菌液2小时、1天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、17天、20天，从每个重复中随机剪取叶片20叶，剪成1厘米小段于150毫升无菌水中震荡培养4小时。然后用常规方法稀释，涂布于含有最终选择浓度的PDA平板上28℃培养48小时，记载菌落数。当取到13天时，在其中两个重复小区喷施营养液(主要成分为土豆浸出液)。取材时间和方法同上处理。依据记载菌落浓度变化，绘制定殖曲线，其中浓度取其常用对数值表示。
结果表明拮抗菌在引入1天后，B34的数量急剧降，随着进入菌株的适应期，经过拮抗细菌的增殖期后，其数量逐渐下降，进入消退期。待20天后，拮抗菌B34的数量降致105个/毫升，并在水稻叶围上定植、生长。
C、菌液浸种小区生防试验将各拮抗细菌于YSP培养基中28℃振荡培养48小时后，稀释成浓度约为108个/毫升的菌液，在28℃下浸种48小时，种子催芽2天，播于育秧田中，地膜覆盖。以井冈霉素、对水稻纹枯病菌有拮抗效果的黄绿木霉的孢子悬液及清水作为对照，木霉孢子浓度为109个/毫升，井冈霉素的浓度为40微克/毫升。待25天后，移栽于水泥池中，单株插栽，株、行距为23.3厘米×26.6厘米，小区随机排列，小区之间以保护行隔离，试验田按常规管理。分蘖盛期接种纹枯病菌。距收获期20天随机抽取50株调查水稻植株的株高、分蘖数及病情指数。
实施例5拮抗菌株对水稻促生作用每次处理取II优838水稻品种15克，分别用在不同菌株振荡培养72小时后的菌液中浸12小时，菌液处理后的种子播于培养盘里，置于生化培养箱中培养，温度为30～34℃，光、暗时间长度分别为12小时，光照强度3500LUX，重复7次。培养至一叶一心期，分别测定出苗率、叶片、根干重，按常规方法进行，所用检验方法均为多重比较法。
结果表明，水稻苗的地上部分干重，与用清水浸种的水稻苗的地上部分干重的差异不显著(P＞0.01)。而根的干重，经B34菌株处理的高于清水对照。说明所筛选的拮抗菌株对根的促生作用很明显，地下部分根系重量比对照增加达到42.8％，而且根系发达程度增加，根毛增多。
实施例6菌株的鉴定A、形态特征蛋白胨培养基、牛肉浸汁琼脂上30℃培养2～4天后用电子显微镜及光学显微镜进行常规的菌体形态观察并照相。
B、培养特征在蛋白胨查氏琼脂、桑塔斯(Santon’s)、牛肉浸汁琼脂、营养琼脂4种培养基上30℃培养2～4天后观察其菌落形状及菌体颜色。
C、化学分类细胞壁化学组分分析按Hasegawa改进的快速薄板层析法(TCL)进行全细胞水解液的氨基酸和糖型分析。
D、生理生化实验参照《Bergeys Manual of Systematic Bacteriology》VO1.II的内容对菌株进行生理生化鉴定。
权利要求
1.一种促进水稻生长和防治水稻纹枯病的假单孢菌菌株，其特征在于致黄假单孢菌(Pseudomonas aureofaciens)B34 CCTCC NOM203033。
2.根据权利要求1所述的一种促进水稻生长和防治水稻纹枯病的假单孢菌菌株，其特征在于所述的B34菌株具有下述性质A、形态特征在蛋白胨查氏培养基、牛肉浸汁琼脂培养基30℃培养2～4天后，用光学显微镜和电子显微镜进行观察，B34直杆状，不呈螺旋状，细胞单个，宽度为0.7～0.8微米，长度为1.2～2微米，以极生鞭毛运动，不产生鞘或突起物，没有菌柄，不产生芽孢。菌体革兰氏染色呈阴性，抗酸染色阴性。B、细胞壁化学组分分析菌株不含有二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)，无特征性糖。C、培养特征a、培养基牛肉浸汁琼脂菌落微黄，表面光滑，边缘整齐。b、桑塔斯琼脂菌落乳脂色，表面小突起，边缘平滑。c、营养琼脂菌落乳脂色，小脊状，边缘粗糙。d、蛋白胨查氏琼脂菌落微黄，有突起，边缘叶片状。D、B34菌株的生理、生化特征B34菌株在6.5％氯化钠培养基上不生长，接触酶、氧化酶、硝酸盐还原反应、精氨酸双水解酶反应呈阳性；能利用蔗糖作为碳源产果聚糖，能水解卵磷脂、七叶灵及乙酰胺；甲基反应、V-P反应、吲哚反应、H2S反应、赖氨酸脱羧酶反应、鸟氨酸脱羧酶反应、苯丙氨酸脱羧酶反应呈阴性；不能液化明胶，不能利用甘露醇，不能水解淀粉、尿素，脂酶实验呈阴性。不能利用蜜二糖、L-鼠李糖、肌醇产酸，能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、核糖产酸。E、菌种鉴定结果通过形态特征、细胞壁化学成分，以及革兰氏染色、抗酸性实验等结果表明B34菌株形态为杆状、细胞单个、以极生鞭毛运动，不形成鞘或突起物，没有菌柄，不产生芽孢，革兰氏为阴性，抗酸染色为阴性，专性好氧，从细胞壁成分看属于假单孢菌属(Pseudomonas)，从培养特征和生理生化实验定种原则分析，由于B34菌株的宽度为0.7～0.8微米×1.2～2微米，菌株表面有微黄色调，基内菌体无色素，且生理生化特征与致黄色假单孢菌很相似，所以菌株定名为致黄假单孢菌(Pseudomonasaureofaciens)。
全文摘要
本发明公开了一种以四川稻区水稻纹枯病病原菌AG－1作为指示菌株，从水稻叶围分离获得的对水稻苗期有较强的促生作用，以及对水稻纹枯病有较好防治效果的假单孢菌菌株，该菌株为致黄假单孢菌(Pseudomonas aureofaciens B34)，是从我国四川省生态地区的水稻植株的叶围上分离、筛选出的，其已于2003年5月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM 203033，本发明用量少，见效快，抑菌率达到71.5％以上，有效地解决了水稻病虫害对现有生物农药所产生的抗药性问题。
文档编号A01N63/00GK1519309SQ03117909
公开日2004年8月11日 申请日期2003年5月22日 优先权日2003年5月22日
发明者郑爱萍, 李平 申请人:郑爱萍