专利名称：一种2-酮基-l-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌及其在维生素c发酵生产中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型菌种一氧化葡糖酸杆菌TL-1045及其在维生素C发酵生产中的应用，具体为其在发酵制备维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸及维生素C中的应用，属于微生物发酵生产领域。
背景技术：
维生素C又称L-抗坏血酸，它能参与体内多种氧化还原反应及羟化反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在人体内起到必不可少的重要生理作用，如治疗人类坏血病，增强人体抵抗力。绿色植物能够自己合成维生素C，然而人和许多动物由于身体肝脏中缺少古洛内酯氧化酶，因此不能自己合成，必须从外界摄取。目前维生素C已广泛应用于 医药、食品、保健品和化妆品等领域。并且随着其用途的开发和人们物质文化生活水平的提高,对维生素C的需求量也不断增加。1933年，德国化学家Reichstein等发明了以化学合成法为主的莱氏法，是最早工业化生产维生素C的方法，但此法合成路线过长，有毒有害的中间产物以及有机原料消耗量多，需要生产商在环境污染防治方面进行较大的投入，导致维生素C生产成本较高。七十年代初，我国首创了维生素C 二步发酵法并将其应用于工业生产。该法在莱氏法一步发酵的基础上，采用混菌发酵，使山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，工艺简单、成本低、无污染，是目前维生素C工业生产的主要方法。维生素C 二步发酵法，第一步是在醋酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，此步发酵工艺成熟，发酵周期约为20-30 h，且转化率很高，现已能达98%以上；第二步是将L-山梨糖进一步氧化生成2-酮基-L-古龙酸，此步发酵由两种微生物混菌发酵进行，一种为氧化葡糖酸杆菌，俗称小菌，另一种常采用巨大芽孢杆菌，俗称大菌。小菌能够转化山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸，但其单独培养生长较弱；大菌不能产酸，但和小菌混合培养，能够显著促进小菌产酸。目前维生素C生产第二步发酵，发酵周期约为40-50 h，产物浓度约为80-95 g/L，转化率约为80-95%。第二步发酵周期长、产物浓度和转化率相对较低，因此是限制维生素C发酵生产效率的关键环节。为了进一步提高维生素C发酵的生产效率，近年来许多研究机构对维生素C第二步发酵进行了研究。专利200910148114. X公开了一种维生素C第二步发酵菌种制备方法，菌种茄瓶制备过程中，先将小菌接种茄瓶，培养16-48 h，然后再接种大菌，继续培养24-72h，这种条件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌种活力，发酵45 h，2-酮基-L-古龙酸可达到100 g/L，转化率达到90%左右，该方法效率有所提高，但是发酵时间较长。专利200910069697. 7公开了一种在发酵过程中添加巯基化合物来取代大菌促进小菌的生长和产酸，但其实际生产效率仍低于大、小菌混菌发酵的效率。专利200910034773. 0公开了一种强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，通过添加海藻糖，提高菌体对古龙酸的耐受性，发酵52 h，2-酮基-L-古龙酸可达到69. 38 g/L，该方法需要添加海藻糖，海藻糖价格较高，导致生产成本上升，不具有实用性。
发明内容
本发明针对现有技术中氧化葡糖酸杆菌对2-酮基-L-古龙酸耐受性较差，导致维生素C生产中第二步发酵效率低下的问题，提供了一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌TL-1045，该菌种2-酮基-L-古龙酸耐受性强，在二步发酵中转化L-山梨糖的效率高，所得2-酮基-L-古龙酸产率显著提高。本发明还提供了该菌种在维生素C发酵生产中的应用，具体为其在维生素C及其中间体2-酮基-L-古龙酸发酵制备中的应用。发明人经过大量实验研究，发现对2-酮基-L-古龙酸耐受性越强的氧化葡糖酸杆 菌菌株，其和巨大芽孢杆菌混菌发酵转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的效率越高，推测可能是2-酮基-L-古龙酸耐受性强的菌株解除了产物反馈抑制效应，使得在第二步发酵过程中后期，高2-酮基-L-古龙酸浓度下，菌体生长和合成产物效率提高。针对这一发现，发明人通过对现有生产菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347进行反复多次紫外诱变筛选，选育得到了本发明2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)TL-1045(即该菌种能耐高浓度2-酮基-L-古龙酸)。本发明氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans) TL-1045,已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC NO. 6188，保藏日期为2012年6月6日。以筛选得到的氧化葡糖酸杆菌TL-347为出发菌株，TL-347对2_酮基-L-古龙酸的耐受浓度为85 g/L，发酵生产2-酮基-L-古龙酸的产量约为95 g/L。氧化葡糖酸杆菌TL-1045的诱变筛选过程为挑取出发菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347的单菌落，接入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，加30 ml无菌生理盐水，150 rpm震荡20 min，将菌落打散，制成菌悬液。取菌悬液5 ml加入培养皿中，于40瓦紫外灯下,20-40 cm处照射I min、5 min、10 min,然后将三个处理的菌悬液分别稀释至10_3-10_5，涂布含有筛选培养基(2-酮基-L-古龙酸90-130 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L，尿素0.1 g/L，玉米浆4 8/1，牛肉膏1.2 g/L,酵母膏I. 2 g/L，磷酸二氢钾I g/L，硫酸镁0.2 g/L，琼脂粉17 g/L,pH 6. 7)的平板中，避光培养72 h，挑取平板上的菌落，分别和巨大芽孢杆菌搭配，然后混菌接发酵摇瓶，检测发酵产2-酮基-L-古龙酸效率，将初步筛选的菌株反复多次诱变得到本发明中的2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌TL-1045，其在110 g/L或更高浓度的2-酮基-L-古龙酸中能够正常生长繁殖，其与巨大芽孢杆菌混菌发酵所得发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量在125g/L以上，L-山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率在90%以上。对氧化葡糖酸杆菌TL-1045的分类学特征进行研究，如下
一、氧化葡糖酸杆菌TL-1045的菌体和菌落形态见表I。
上述氧化葡糖酸杆菌TL-1045可用于维生素C发酵生产中，具体的为用其发酵生产维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸，步骤包括以巨大芽孢杆菌(简称大菌，下同)为伴生菌，与氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045 (简称小菌,下同)组成混合菌种进行混菌有氧发酵，以L-山梨糖为原料进行混菌有氧发酵，将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。混菌发酵的培养基中除了 L-山梨糖外，还含有碳源、氮源、无机盐等营养成分。进一步的，维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸的制备方法包括以下步骤
(1)菌种的活化将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，然后在活化培养基中于27-32°C下培养18-24 h，得活化的菌种液；
(2)菌种的分离纯化在无菌条件下，用无菌生理盐水将步骤(I)得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10_5-10_7稀释液0. I ml涂布在平板上，平板在27-32°C下培养4_6天；
(3)混菌的培养用接种环将步骤(2)中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸杆菌菌落挑取到0. 2ml无菌生理盐水中，制成氧化葡糖酸杆菌菌悬液；然后从步骤(2)中平板上选择色白、饱满且边缘整齐的巨大芽孢杆菌菌落，用接种环在巨大芽孢杆菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小的巨大芽孢杆菌接到氧化葡糖酸杆菌菌悬液中，搅拌混匀制得混菌悬液；取混菌悬液0. 05-0. I ml接种到茄瓶培养基中，涂布均匀，27-32 °C培养3_5天；
(4)种子液的制备将步骤(3)中茄瓶培养得到的混菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-32°C、80-250 rpm的条件下培养18-24 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶；
(5)种子液的扩大培养将步骤(4)得到的种子液按5-20%的接种量接种到扩大培养基中，在 80-250 rpm、通气比 0. 3-0. 8 L/L*min、27_32°C条件下培养 20-30 h ；
(6)发酵培养将步骤(5)扩大培养所得的种子液按5-20%接种量接种到发酵培养基中，在80-250 rpm、通气比0. 3-0. 8 L/L*min、27_32°C条件下培养25-40 h，发酵过程中流加碱性物质溶液控制PH始终为6. 7-7. 3，L-山梨糖下降到5-15 g/L时，流加L-山梨糖保持L-山梨糖浓度为10-25 g/L。上述方法中，步骤(I)中活化培养基的组成为山梨糖5-15 g/L，葡萄糖2-5 g/L,酵母膏 3-8 g/L，玉米浆 3-10 g/L，尿素 0.05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步骤(2)中平板培养基组成为山梨糖5-20 g/L，胰蛋白胨1-5 g/L,尿素0.05-0. 2 g/L，玉米浆2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏0. 5-2. 0 g/L，磷酸二氢钾
0.5-1. 5 g/L，硫酸镁 0. 1-0. 3 g/L，琼脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步骤(3)中茄瓶培养基组成为山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸镁 1-3 g/L，琼脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步骤(4)中种子培养基的组成为山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L,玉米浆 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步骤(5)中扩大培养基组成为山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步骤(6)中发酵培养基组成为山梨糖20-30 g/L，玉米浆5-12 g/L,尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 3。上述方法中，步骤(6)中发酵时间优选为32-35 h，此外，步骤(6)中流加的碱性物质溶液可以是碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液等。上述2-酮基-L-古龙酸的发酵方法中，所用的伴生菌巨大芽孢杆菌无产酸作用，但能显著促进氧化葡糖酸杆菌TL-1045的产酸能力，本发明所用的巨大芽孢杆菌为现有技术中公开的普通巨大芽孢杆菌，可以在市场上买到。、
上述氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045还可以用于维生素C 二步发酵中，将L-山梨糖高效率转化为2-酮基-L-古龙酸。本发明的上述技术方案与现有技术相比具有以下优点
I、本发明中氧化葡糖酸杆菌TL-1045经过物理诱变所得，在含有110 g/L 2-酮基-L-古龙酸的培养基中正常生长繁殖，解除了维生素C生产第二步发酵中产物对菌体的反馈抑制，发酵生产2-酮基-L-古龙酸的产量可达到125 g/L以上，较初始菌株的产量有显著性提高，且传代稳定，高于目前文献报道的2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率。2、将本发明氧化葡糖酸杆菌TL-1045用于维生素C发酵生产中简单易行，能够显著提高维生素C第二步发酵的生产效率，提高2-酮基-L-古龙酸的产量，降低维生素C生产成本。保藏信息
本发明氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045 (即2_酮基_L_古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌)已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 6188，保藏日期为2012年6月6日。
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图I为本发明所述的氧化葡糖酸杆菌TL-1045和巨大芽孢杆菌混菌发酵过程中的镜检图片，图中大型杆菌为巨大芽孢杆菌，小型球菌为氧化葡糖酸杆菌TL-1045。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。但是本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。以下实施例中所用2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌TL-1045简称为小菌，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCCN0.6188，保藏日期为2012年6月6日；所用巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌ATCC 14581，简称为大菌，购于上海复祥生物科技有限公司。以下实施例中所用氧化葡糖酸杆菌TL-1045是以现有生产菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347 (保藏于本单位研发中心)为出发菌株，通过紫外诱变处理获得，其在110 g/L或更高浓度的2-酮基-L-古龙酸中能够正常生长繁殖。下述实施例中所用到的TL-1045菌种和巨大芽孢杆菌接种在同一茄瓶中在冰箱中进行保存，温度在4°C左右，在使用时将茄瓶上保存的大、小菌洗下进行活化等处理进行进一步的应用。保存所用的培养基为山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸镁1-3 g/L,琼脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。实施例I
氧化葡糖酸杆菌TL-1045的诱变筛选
挑取出发菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347的单菌落，接入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，力口30 ml无菌生理盐水，150 rpm震荡20 min，将菌落打散，制成菌悬液。取5 ml菌悬液加入培养皿中，于40瓦紫外灯下，20-40 cm处照射I min、5 minUO min，然后将三个处理的菌悬液分别稀释至10_3_10_5，涂布含有筛选培养基(2-酮基-L-古龙酸110 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L，尿素0. I g/L，玉米浆4 8/1，牛肉膏1.2 8/1，酵母膏1.2 g/L，磷酸二氢钾I g/L，硫酸镁0. 2 g/L，琼脂粉17 g/L, pH 6. 7)的平板中，避光培养72 h，挑取平板上的菌落，分别和巨大芽孢杆菌搭配，然后混菌接发酵摇瓶，检测发酵产2-酮基-L-古龙酸效率，将初步筛选的菌株反复诱变多次，获得多株古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌菌株(见表3)，其中氧化葡糖酸杆菌TL-1045对2-酮基-L-古龙酸高耐受性最好，发酵产酸最高。
表3不同葡■糖酸杆菌菌株对2" 基-L-古龙Klt受性及产簾水平
权利要求
1.一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型菌种，其特征是所述菌种为氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)TL_1045,该菌种已于2012年6月6日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6188。
2.—种维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸的发酵方法，其特征是，步骤包括以巨大芽孢杆菌为伴生菌，与权利要求I所述的氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)TL_1045组成混合菌种，以L-山梨糖为原料进行混菌有氧发酵，将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征是，具体包括以下步骤 (1)菌种的活化将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，然后在活化培养基中于27-32°C下培养18-24 h，得活化的菌种液； (2)菌种的分离纯化用无菌生理盐水将步骤(I)得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10_5-10_7稀释液0. I ml涂布在平板上，然后将平板在27-32 °C下培养4_6天； (3)混菌的培养用接种环将步骤(2)中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸杆菌菌落挑取到0. 2 ml无菌生理盐水中，制成氧化葡糖酸杆菌菌悬液；然后从步骤(2)中平板上选择巨大芽孢杆菌菌落，用接种环在巨大芽孢杆菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小的巨大芽孢杆菌接到氧化葡糖酸杆菌菌悬液中，搅拌混匀制得混菌悬液；取混菌悬液0.05-0. I ml接种到茄瓶培养基中，涂布均匀，27-32 °C培养3_5天； (4)种子液的制备将步骤(3)中茄瓶培养得到的混菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-32°C、80-250 rpm的条件下培养18-24 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶； (5)种子液的扩大培养将步骤(4)得到的种子液按5-20%的接种量接种到扩大培养基中，在 80-250 rpm、通气比 0. 3-0. 8 L/L min、27_32°C条件下培养 20-30 h ； (6)发酵培养将步骤(5)扩大培养所得的种子液按5-20%接种量接种到发酵培养基中，在80-250 rpm、通气比为0. 3-0. 8 L/L.min、27-32°C条件下培养25-40 h，发酵过程中流加碱性物质溶液控制PH始终为6. 7-7. 3，L-山梨糖下降到5-15 g/L时，流加L-山梨糖保持L-山梨糖浓度为10-25 g/L。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是步骤(I)中活化培养基的组成为山梨糖 5-15 g/L,葡萄糖 2-5 g/L,酵母膏 3-8 g/L,玉米衆 3-10 g/L,尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH6. 7-7. 2。
5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是步骤(2)中平板培养基组成为山梨糖 5-20 g/L，胰蛋白胨 1-5 g/L，尿素 0.05-0. 2 g/L，玉米浆 2-6 g/L，牛肉膏 0.5-2 g/L,酵母膏 0.5-2. 0 g/L，磷酸二氢钾 0.5-1. 5 g/L，硫酸镁 0. 1-0. 3 g/L，琼脂粉 17 g/L, pH6.7-7. 2。
6.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是步骤(3)中茄瓶培养基组成为山梨糖3-8 g/L，酵母膏 2-6 g/L，硫酸镁 1-3 g/L，琼脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 20
7.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是步骤(4)中种子培养基的组成为山梨糖 8-20 g/L，葡萄糖 1-5 g/L，玉米浆 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2 ;步骤(5)中扩大培养基组成为山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素0. 05-0. 2g/L, pH 6. 7-7. 2。
8.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是步骤(6)中发酵培养基组成为山梨糖20-30 g/L，玉米浆 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 3。
9.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是步骤(6)中发酵时间为32-35h。
10.一种维生素C的制备方法，采用二步发酵法制备维生素C，其特征是采用权利要求2-9中任一项所述的维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸的发酵方法将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。
全文摘要
本发明公开了一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)TL-1045，还提供了该菌株在维生素C发酵生产中的应用。本发明提供的氧化葡糖酸杆菌TL-1045能够耐受高浓度的2-酮基-L-古龙酸，解除了维生素C发酵生产第二步中产物对菌体的反馈抑制，2-酮基-L-古龙酸的产量可达到125g/L以上，使得维生素C生产效率显著提高，有效降低了维生素C的生产成本。
文档编号C12R1/01GK102757928SQ20121028143
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者付吉明, 刘敏, 庄祎, 张全景, 王乔隆, 郑秀宁 申请人:山东天力药业有限公司