专利名称：一种高浓度发酵生产2-酮基-d-葡萄糖酸的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于食品添加剂的盐类合成前体2-酮基-D-葡萄糖酸的制备领域，特别涉及一种高浓度 发酵制备2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐的工艺。
背景技术：
2-酮基-D-葡萄糖酸是目前工业化大规模生产的有机酸之一，是食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠及D-异抗坏血酸合成的前体。2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有酶法、化学合成法和发酵法等3种。由于生产成本等方面因素，目前在工业生产中多采用细菌发酵的间接发酵技术。目前在工业生产中，2-酮基-D-葡萄糖酸均采用发酵法生产，以D-葡萄糖为原料进行。方法存在以下缺点由于底物及产物在达到一定浓度时的反馈抑制作用，阻碍了生产菌将葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸生化反应的顺利进行，致使发酵周期长、生产效率低；另外发酵过程中需添加大量CaCO3等作为pH缓冲剂，发酵母液杂质含量大，粘度高，提取纯化困难，同时产生大量废渣，严重污染环境。因此对传统2-酮基-D-葡萄糖酸发酵工艺的改进已经成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服传统方法发酵周期长、产物浓度低、发酵母液杂质含量大，提取纯化困难，同时产生大量废渣，污染环境等问题，提供一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺。为了解决上述技术问题采用以下技术方案一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物，以葡萄糖作为发酵培养基中的碳源进行发酵培养，灭菌前的pH 5. 5-7. 0 ;发酵培养基由以下质量体积百分比的物质组成葡萄糖10%_32%，玉米浆0. I %-1%，氢氧化钙1%_5%，泡敌
0.02-0. 08%，溶剂为水。所述的葡萄糖质量体积百分比为25%。所述的葡萄糖其中40%作为底料、60%作为补料；作为补料的葡萄糖一次性加入或者连续流加方式加入；发酵培养的温度为28-42°C ;发酵培养的压为0. 02、. 12Mpa ;发酵培养的通气量为0. 2-2. Ov/v/m ;当发酵液中氢氧化钙耗尽后，流加液氨或2(T30%氨水中和发酵过程中产生的2-酮基-D-葡萄糖酸，维持发酵过程的pH为4. 5-8. 0 ;葡萄糖浓度低于
0.1%时停止发酵，对发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐进行回收。优选维持发酵过程的pH为6.0，发酵培养的温度为34°C，发酵培养的压为
0.06Mpa，发酵培养的通气量为0. 8v/v/m，
采用连续流加方式加入葡萄糖发酵工艺时，发酵液中葡萄糖浓度下降至6-2%时，开始流加葡萄糖。优选维持发酵液中葡萄糖浓度在3%。
所述的具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物为荧光假单胞杆菌或球状节杆菌。本发明中所指的质量体积百分比都是指每100毫升溶液中所含溶质的克数。本工艺中，发酵培养基中的碳源为葡萄糖，氮源为玉米浆及流加的液氨或氨水。发酵培养基中，所用的玉米浆中干物质质量百分含量为40%左右，若使用其他浓度的玉米浆，可进行相应计算后确定其培养基的组成。泡敌的量只要控制培养基中的泡沫量适宜即可。适用于本发明的微生物很多，分别属于假单胞菌属欧文氏菌属(Mrwinia)、沙雷氏菌属iSerratia)、葡萄糖杆菌属iGlueconobacter)、醋杆菌属、产碱菌属等。本发明主要使用了突光假单胞杆菌iPseudomonas fluorescens)>|if(Arthrobacter globiformis、。本发明相对现有技术有如下优点发酵初始采用氢氧化钙调节pH成本更低，发酵中后期利用液氨或氨水更精确地调控发酵液PH值，使之维持在微生物最适生长及产酸环 境中，同时补充氮源，提高菌体产酸能力及产酸浓度，提高发酵转化率和产量，缩短发酵周期，发酵液品质高，杂质少，便于提取和纯化，同时减少硫酸钙废渣的排放，形成的副产物为硫酸铵，可作为肥料使用。
具体实施例方式以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此 实施例I
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，种子培养采用5L自控发酵罐，种子培养基配方为，以下均为质量体积百分比葡萄糖2%，玉米浆0.1%，KH2PO3 0.2%，尿素0. 2%，MgSO4 7H20 0. 05%,泡敌0. 05% ;灭菌前pH 6. 8。将荧光假单胞杆菌K1005菌悬液接入约3L上述种子培养基中，控制搅拌转速400r/m，罐温33. 5°C，罐压0. 04MPa，通气量0. 5V/V/m，培养 20h。发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下葡萄糖15%(其中40%作为底料，60%作为补料)，玉米浆0. 1%，氢氧化钙2%，泡敌0. 05%,溶剂为水；灭菌前pH5. 5。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、氢氧化钙分别于120°C灭菌30min，并于38°C混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中形成发酵液。作为补料的葡萄糖配成IOL溶液，120°C灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。发酵8小时，氢氧化钙耗尽，开始流加20%氨水，控制发酵pH4. 5。发酵10小时，流加加入作为补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速350r/m，罐温28°C，罐压0. 02MPa,通气量0. 4v/v/m,培养34h，生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度达14. 8%，发酵转化率(mol/mol，以葡萄糖酸根计)达92. 8%。实施例2
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，种子培养同实施例I。发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下葡萄糖24% (其中40%作为底料，60%作为补料)，玉米浆0. 5%，氢氧化钙2%，泡敌0. 05%,溶剂为自来水；灭菌前pH6. 5。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、氢氧化钙分别于120°C灭菌30min，并于38°C混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中形成发酵液。作为补料的葡萄糖配成IlL溶液，120°C灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。发酵9. 5小时，氢氧化钙耗尽，开始流加25%氨水，控制发酵PH6. O。发酵12小时，流加加入补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速380r/m，罐温34°C，罐压0. 04MPa,通气量0. 8v/v/m,培养39h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度达23. 5%发酵转化率(mol/mol，以葡萄糖酸根计)达93. 2%。实施例3
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，种子培养同实施例1，菌种为球状节杆菌K1022。发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下葡萄糖32%(其中40%作为底料，60%作为补料)，玉米浆1%，氢氧化钙3%，泡敌0. 06%,溶剂为水；灭菌前pH7. O。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、氢氧化钙分别于120°C灭菌30min，并于38°C混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中。作为补料的葡萄糖配成12L溶液，120°C灭菌30min，冷却后 采用流加方式加入。发酵10小时，氢氧化钙耗尽，开始流加30%氨水，控制发酵pH8. O。发酵13小时，流加加入补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速400r/m，罐温38°C，罐压0. 06MPa,通气量I. 2v/v/m,培养43h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度达31. 3%，发酵转化率(mol/mol，以葡萄糖酸根计)达92. 9%。对照例I
一种发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的普通工艺，种子培养采用5L自控发酵罐，种子培养基配方为葡萄糖2%，玉米浆1%，KH2PO3 0. 2%，尿素0. 2%，MgSO4 7H20 0. 05%，泡敌
0.05%;灭菌前pH6.8。将荧光假单胞杆菌K1005菌悬液接入约3L上述种子培养基中，控制搅拌转速400r/m，罐温33. 5°C，罐压0. 04MPa,通气量0. 5 V/V/m,培养20h。发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下葡萄糖18%(其中40%作为底料，60%作为补料)，玉米浆I. 5%，轻质碳酸钙6%，泡敌0. 05% ;灭菌前pH6. 5。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、碳酸钙分别于120°C灭菌30min，并于40°C混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中。作为补料的葡萄糖配成IOL溶液，120°C灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。待发酵液葡萄糖浓度下降至3%，开始流加补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速400r/m，罐温34°C，罐压0. 04MPa,通气量
1.Ov/v/m，培养48h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度为16. 8%，，发酵转化率(mol/mol，以葡萄糖酸根计)为88. 38%。对照例2
一种发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的普通工艺，种子培养同对照例1，菌种为球状节杆菌 K1022。发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下葡萄糖18%(其中40%作为底料，60%作为补料)，玉米浆I. 5%，轻质碳酸钙6%，泡敌0. 05% ;灭菌前pH6. O。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、碳酸钙分别于120°C灭菌30min，并于40°C混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中。作为补料的葡萄糖配成10L溶液，120°C灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。待发酵液葡萄糖浓度下降至3%，开始流加补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速400r/m，罐温34°C，罐压0. 04MPa,通气量
I.Ov/v/m，培养50h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度为17. 2%，发酵转化率(mol/mol，以葡萄糖酸根计)为89. 2%。对照例1、2采用现有工艺，利用轻质碳酸钙一次性加入培养基中调节PH，控制PH不精确，不利于生产菌产酸，所以转化率较低。实施例1、2、3采用本发明的工艺，即培养基中采用部分氢氧化钙先期调节PH，等用完后再流加氨水，起到精确调节PH、增加氮源从而更利于生产菌的生长及产酸的作用，转化率相对高些。权利要求
1.一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物，以葡萄糖作为发酵培养基中的碳源进行发酵培养，灭菌前的PH 5. 5-7. O ;发酵培养基由以下质量体积百分比的物质组成葡萄糖10%-32%，玉米浆0. I %-1%，氢氧化钙1%_5%，泡敌0. 02-0. 08%，溶剂为水。
2.根据权利要求I所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于葡萄糖质量体积百分比为25%。
3.根据权利要求I所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于所述的葡萄糖其中40%作为底料、60%作为补料；作为补料的葡萄糖一次性加入或者连续流加方式加入；发酵培养的温度为28-42°C ;发酵培养的压为0. 02、. 12Mpa ;发酵培养的通气量为0. 2-2. Ov/v/m ;当发酵液中氢氧化钙耗尽后，流加液氨或2(T30%氨水中和发酵过程中产生的2-酮基-D-葡萄糖酸，维持发酵过程的pH为4. 5-8. 0 ;葡萄糖浓度低于0. 1%时停止发酵，对发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐进行回收。
4.根据权利要求3所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在 于维持发酵过程的pH为6. 0,发酵培养的温度为34°C,发酵培养的压为0. 06Mpa,发酵培养的通气量为0. 8v/v/m, 根据权利要求3所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于采用连续流加方式加入葡萄糖发酵工艺时，发酵液中葡萄糖浓度下降至6-2%时，开始流加葡萄糖。
5.根据权利要求5所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于维持发酵液中葡萄糖浓度在3%。
6.根据权利要求I所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于所述的具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物为荧光假单胞杆菌或球状节杆菌。
全文摘要
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物，以葡萄糖作为发酵培养基中的碳源进行发酵培养，灭菌前的pH5.5-7.0；发酵培养基由以下质量体积百分比的物质组成葡萄糖10%-32%，玉米浆0.1%-1%，氢氧化钙1%-5%，泡敌0.02-0.08%，溶剂为水。发酵初始采用氢氧化钙调节pH成本更低，发酵中后期利用液氨或氨水更精确地调控发酵液pH值，使之维持在微生物最适生长及产酸环境中，同时补充氮源，提高菌体产酸能力及产酸浓度，提高发酵转化率和产量，缩短发酵周期，发酵液品质高，杂质少，便于提取和纯化，同时减少硫酸钙废渣的排放，形成的副产物为硫酸铵，可作为肥料使用。
文档编号C12P7/58GK102747113SQ201210266550
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者刘银霞, 史小莉, 宋向军, 崔凤霞, 张建国, 张生克, 朱腾跃, 王敬臣, 王新华, 秦天仓, 肖媛, 闫世梁, 黄惠英 申请人:郑州拓洋生物工程有限公司