专利名称：2-酮基-d-葡萄糖酸半连续发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及以葡萄糖或淀粉水解糖为原料发酵生产2-酮基-D-葡萄糖 酸的半连续发酵工艺。
背景技术：
2-酮基-D-葡萄糖酸是生产D-异抗坏血酸及其盐类的前体。根据公知 的间接发酵技术(如US 3， 381, 027 )可以将该化合物转化为D-异抗坏血酸 及其盐类(如D-异抗坏血酸钠)。
2_酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有酶法(如US 4, 351，902 )、化 学合成法(如US 6, 018, 034 )和发酵法(如US 3,255,093 )等3种。由于 生产成本方面的原因，目前在工业生产中均釆用细菌发酵的方法。
公知的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵技术采用的是分批发酵或补料分批发
酵模式，其基本特征是分批次的。每完成一批次发酵后，需要对发酵罐进 行清理和重新接种才能进行下一批次发酵。在发酵转化率上，现有的2-酮 基-D-葡萄糖酸发酵技术已经达到一定的水平；在发酵产率和产品质量上， 现有的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵技术仍存在着一定欠缺，表现在发酵产率 较低， 一般只能达到4. Og/L/h左右，且产品质量不够稳定。因此，开发产 物质量稳定、高产率的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产工艺是本发明的目的。
发明内容
本发明披露的是一种通过半连续发酵从葡萄糖或淀粉水解糖高产率发 酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸及其盐类的方法。半连续发酵也称重复补料分
批发酵，其典型特征是使用发酵液的一部分作为下一批次发酵的种子。本
发明可以克服现有技术的不足，能够提高发酵产率，保证发酵产物质量的 稳定，具有工艺操作简便、设备利用率高、能源消耗低、易于实现生产的 自动化等优点。
本发明采取如下方法
(1) 在发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸能力的
微生物。适用于本发明的微生物较多，它们分属于假单胞菌属
(Aww/咖o/7M)、欧文氏菌属(Ar『i/7/a)、沙雷氏菌属(5ferrs〃s)、葡萄 糖酸杆菌属(^7〃c朋o&cz^r)、节杆菌属(^YAroA2^e/")、产碱菌属
U/c3/Z^/7")和醋酸杆菌属(Jce"&"er)等。本发明主要釆用了荧 光假单胞菌(户5"e〃^ yz ar7as /Vz/c^resce/^)和球状节杆菌(J/^力ro&"er
(2) 向发酵容器中补给含有葡萄糖的培养基至发酵容器体积的60%至 85%(补料过程中发酵的最大瞬时稀释率控制在大约0. Olh-'至大约0. 3h-\ 培养基中葡萄糖的浓度在大约100g/L至大约250g/L)。
(3) 补料结束，从发酵容器中放出大约50%至大约的发酵液以回 收2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐(此时发酵液中的葡萄糖浓度应低于2g/L)。
(4) 以发酵容器中剩余的发酵液为种子，进行重复补料分批发酵。 培养基中的碳源主要为葡萄糖，氮源主要为玉米浆。培养基中的葡萄
糖浓度可以在大约100g/L至大约250g/L之间，优选的葡萄糖浓度为18% 左右；培养基的含氮量在大约0. 3g/L至大约2.0g/L之间，优选的含氮量 在1.0g/L左右。补料过程中，发酵的最大瞬时稀释率控制在大约0. Olh—
至大约0. 3 h—'。
本发酵方法可以在pH为大约4. 0至大约9. 0之间进行，适宜的发酵
pH为5.0左右。发酵pH的控制过程中，可以采用轻质碳酸钙、碳酸钠或 氢氧化钠等作为中和剂。
本发酵方法可以在大约28。c至大约4rc的温度下进行，适宜的发酵温
度为33。C左右。
本发酵方法需要在有氧条件下进行，发酵过程中的通气量大约为 0. 2v/v/ni (每分钟每体积单位发酵液中的空气体积)至2. Ov/v/m，适宜的 通气量为0. 7v/v/m左右。
虽然本发明的发酵几乎可以在常压下进行，但最好选择在 0. 02MPa-0. 05MPa的压力下进行发酵。
具体实施例方式
实施例1
种子培养采用5L的自控发酵罐。将荧光假单胞菌K1005的菌悬液接入 2. OL含有2. 0%的葡萄糖、1. 0%的玉米浆、0. 2%的尿素、0. 2%的KH2PO" 0. 05% 的MgS04 . 7H20、 0. 25%的轻质CaC03 (灭菌前pH 7. 0 )的种子培养基中，控 制搅拌转速400rpm、罐温33°C 、罐压0. 030MPa、通气量0. 5v/v/m培养20h。 半连续发酵釆用50L的自控发酵罐。发酵培养基的组成为16. 2%的淀 粉水解糖、1. 5%的玉米浆和4. 5。/。的轻质CaC03 (灭菌前pH6. 7)。将前述培 养好的种液接入20L的发酵培养基中，控制搅拌转速400rpra、罐温3rC、 罐压0. 03謹Pa、通气量0. 7v/v/m培养24h,然后以2. OL/h的补料速率流 加另外的20L发酵培养基。流加结束后，.快速放掉20L左右的发酵液，重 复以上的流加操作。如此重复5次，共耗时76h左右，生产2-酮基-D-葡 萄糖酸18805. 4g,发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为161. 7g/L,发酵 液中残留的葡萄糖平均为0.007%。根据上述结果计算，平均发酵转化率 (mol/mo1)为89. 75%,平均发酵产率约为4. 95g/L/h。 实施例2
种子培养同实施例1。
发酵培养基的组成为18. W的淀粉水解糖、1.5%的玉米浆和5. 0%的 轻质CaC03 (灭菌前pH 6.7)。将种液接入20L的发酵培养基中，控制搅拌 转速4Q0rpm、罐温33。C、罐压0. 030MPa、通气量1. Ov/v/m培养30h,然 后以2. OL/h的补料速率流加另外的20L发酵培养基。流加结東后，快速放 掉2dL左右的发酵液，重复以上的流加操作。如此重复5次，共耗时82h 左右，生产2-酮基-D-葡萄糖酸21052. 6g，发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸 的浓沒为178.4g/L，发酵液中残留的葡萄糖平均为0.041%。根据上述结果 计算，平均发酵转化率(mol/mol)为90.43%,平均发酵产率约为5. 13g/L/h。
实施例3
种子培养同实施例1。
发酵培养基的组成同实施例2。将种液接入20L的发酵培养基中，控 制搅拌转速400rpm、罐温34°C 、罐压0. 020MPa、通气量1. Ov/v/m培养30h, 然后以2. 2L/h的补料速率流加另外的20L发酵培养基。流加结東后，快速 放掉20L左右的发酵液，重复以上的流加操作。如此重复5次，共耗时78h 左右，生产2-酮基-D-葡萄糖酸20944. 9g,发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸 的浓度为175.8g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为0.103%。根据上述结果 计算，平均发酵转化率(raol/mol)为89. 97%，平均发酵产率约为5. 37g/L/h。
实施例4
种子培养同实施例l,菌种为球状节杆菌K1022。
发酵培养基的组成为18.0%的淀粉水解糖和1.7%的玉米浆(灭菌前 pH4. 5,灭菌后用氢氧化钠调节至6. 4)。将种液接入20L的发酵培养基中， 控制搅拌转速400rpm、罐温35。C、罐压0. G20MPa、通气量1, Ov/v/m培养 30h(培养过程中用氢氧化钠控制发酵液pH值为5. 3左右)，然后以2. 2L/h 的补料速率流加另外的20L发酵培养基。流加结束后，快速放掉20L左右 的发酵液，重复以上的流加操作。如此重复5次，共耗时78h左右，生产 2-酮基-D-葡萄糖酸20775. 2g,发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为
173. 7g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为0. 085%。根据上述结果计算，平 均发酵转化率(mol/mol )为89. 24%,平均发酵产率约为5. 32g/L/h。 ^施例5
种子培养同实施例4。
发酵培养基的组成同实施例2。将种液接入12L的发酵培养基中，控 制搅拌转速400rpm、罐温35。C、罐压0. 020MPa、通气量1. Ov/v/m培养30h， 然后以2. OL/h的补料速率流加另外的28L发酵培养基。流加结東后，快速 放掉28L左右的发酵液，重复以上的流加操作。如此重复5次，共耗时102h 左右，生产2-酮基-D-葡萄糖酸25984. 5g,发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸 的浓度为171.5g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为0.111%。根据上述结果 计算，平均发酵转化率(mol/mol )为88. 12%,平均发酵产率约为5. 10g/L/h。
实施例6
种子培养同实施例1。
起始发酵培养基的组成为9. 0%的淀粉水解糖、1. 0%的玉米浆和2. 5% 的轻质CaC03 (灭菌前pH 6.7)。补料培养基的组成为18. 0%的淀粉水解 糖、1.0%的玉米浆和5. 0y。的轻质CaC()3 (灭菌前pH 6. 7)。将种液接入12L 的起始发酵培养基中，控制搅拌转速400rpm、罐温35'C、罐压0. 020MPa、 通气量1. Ov/v/m培养24h,然后以2. OL/h的速率流加28L的补料培养基。 流加结束后，快速放掉28L左右的发酵液，重复以上的流加搡作。如此重 复5次，共耗时96h左右，生产2-酮基-D-葡萄糖酸25491.8g,发酵液中 2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为168.8g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为 0.009%。根据上述结果计算，平均发酵转化率(mol/mol)为90.00%,平 均发酵产率约为5. 31g/L/h。
对照例1
种子培养同实施例1。
起始发酵培养基的组成为9. 0%的淀粉水解糖、1. 0%的玉米浆和2. 5% 的轻质CaC03 (灭菌前pH 6.7)。补料培养基的组成为18. 0%的淀粉水解
糖、1.0%的玉米浆和5. (T/。的轻质CaC03 (灭菌前pH 6.7)。将种液接入12L 的起始发酵培养基中，控制搅拌转速400rpm、罐温35。C、罐压0. MOMPa、 通气量1. Ov/v/m培养12h，然后以2. OL/h的速率流加28L的补料培养基。 流加结束后，继续发酵至发酵液中的残糖为0.1%以下。该发酵周期为29h, 生产2-酮基-D-葡萄糖酸5905. 8g，发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为 154二g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为0.013%。根据上述结果计算，平 均发酵转化率(mol/mo1)为89.54%,平均发酵产率约为4. 07g/L/h。 对照例2
种子培养同实施例4。
起始发酵培养基的组成为11.65%的淀粉水解糖、2.45%的玉米浆和 8. 0%的轻质CaC03 (灭菌前pH 6. 7 )。补料培养基的组成为30. 0%的淀粉水 解糖。将种液接入25L的起始发酵培养基中，控制搅拌转速400rpm、罐温 35°C、罐压O. 020MPa、通气量1. Ov/v/m培养16h,然后以2. OL/h的速率 流加:l5L的补料培养基。流加结東后，继续发酵至发酵液中的残糖为0.1% 以下。该发酵周期为36h,生产2-酮基-D-葡萄糖酸7160. 6g，发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度为179.1g/L,发酵液中残留的葡萄糖平均为 0.003%。根据上述结果计算，平均发酵转化率(mol/mol)为89. B%，平 均发酵产率约为3. 98g/L/h。
权利要求
1.一种由葡萄糖或淀粉水解糖高产率发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸及其盐类的方法，其特征是所述的方法是通过半连续发酵即重复补料分批发酵工艺实现的，所述方法包括如下步骤在所述发酵工艺的发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸能力的微生物，向所述发酵工艺的发酵容器中补给含有葡萄糖的培养基至所述发酵工艺的发酵容器体积的60％至85％，在所述发酵工艺补料结束后，从所述发酵工艺的发酵容器中放出50％至95％的发酵液以回收2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐(此时发酵液中的葡萄糖浓度应低于2g/L)，以所述发酵工艺的发酵容器中剩余的发酵液为种子，进行重复补料分批发酵。
2. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是发酵培养液的一部分被用 作下一次发酵的种子培养液。
3. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是所述的发酵PH值控制在 4. 0至9. 0之间。
4. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是所述的发酵温度控制在28。c至4rc之间。
5. 如权利要求l所述的发酵工艺，其特征是补料过程中发酵的最大瞬 时稀释率控制在0. Olh-'至0. 3h、培养基中葡萄糖的浓度应控制在100g/L 至250g/L。
6. 如权利要求l所述的发酵工艺，其特征是从发酵容器排出用以回收 2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐的发酵液中的葡萄糖浓度应低于2g/L。
全文摘要
本发明涉及一种由葡萄糖或淀粉水解糖高产率发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸及其盐类的方法，该方法是通过半连续发酵即重复补料分批发酵工艺实现的。该方法包括以下步骤在发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸能力的微生物；向发酵容器中补给含有葡萄糖的培养基至所述发酵容器体积的60％至85％；补料结束后，从发酵容器中放出50％至95％的发酵液以回收2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐(此时发酵液中的葡萄糖浓度应低于2g/L)；以发酵容器中剩余的发酵液为种子，进行重复补料分批发酵。
文档编号C12P7/40GK101348806SQ20081010705
公开日2009年1月21日 申请日期2008年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者彬 余, 余泗莲, 刘敬泽, 强 周, 孙文敬, 李中兵, 杨晓军, 转 魏, 黄达明 申请人:江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司;江苏大学;河北化工医药职业技术学院