专利名称：一种细菌漆酶基因及其表达与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说一种细菌漆酶及其表达，以及该细菌漆酶蛋 白在工业上的应用。
背景技术：
漆酶(Laccase，EC 1. 10. 3. 2)是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非 酚类化合物氧化，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制 浆和漂白、食品风味改良、饲料营养改善、人工合成染料脱色、纺织纤维软化细化、新型药物 开发、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值，近年来成为国际酶 工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。漆酶广泛存在于高等真菌(特别是担子菌)中。近年来，部分真菌漆酶已经应用 于工业生产，如DeniLite 、Zylite等。然而，真菌漆酶受羟基离子的影响较大，在碱性条 件下活性迅速降低，严重影响了其在工业中的应用。随着全基因组测序技术的迅速发展， 人们发现，漆酶在细菌中同样广泛存在。细菌漆酶可以克服真菌漆酶的缺点，其在碱性条 件下具有良好的催化活性并具有较高的稳定性。目前，已经在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物中发现漆酶，但被系统研究 的细菌漆酶基因不超过20个，需要进一步开发与研究，且目前还没有细菌漆酶在工业方面 应用的报道。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种细菌漆酶及其表达该 细菌漆酶基因的工程菌株。本发明的细菌漆酶，其原始来源于中国南海海洋海水未培养微生物，其基因编码， 具有如下核苷酸序列之一(1)序列表中的 SEQ ID No 1 ；(2)序列表中的SEQ ID No :1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同 功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的多核苷酸序列。本发明的细菌漆酶，具有下列氨基酸序列之一(1)序列表中的 SEQ ID No 2 ；(2)序列表中的SEQ ID No :2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相 同功能蛋白质的氨基酸序列。含有上述细菌漆酶基因的重组表达载体、宿主菌也是本发明的保护范围。含有上述细菌漆酶基因的重组表达载体的构建方法，以包含细菌漆酶基因的 BAC(Bacterial Artificial Chromosome)载体 DNA 为模板，以 Pl 和 P2 为引物进行 PCR 扩 增，得到PCR扩增产物，并与pMDlS-T质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因 (lacl5)的pMD18-T重组质粒，用Nde I和Xho I双酶切所得的pMD18_T重组质粒和表达质 粒载体，然后用T4连接酶将酶切后的lacl5与表达质粒载体连接，得到连接产物；连接产物 转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明lacl5基因的工程菌株；其中所述引物为Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘上述构建方法中所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pET28等。上述构建方法中所述宿主菌是指E. coli BL21(DE3)、E. coli DH5a、E. coli JM109 或 Ε. coli Rosetta 等。下面以表达质粒载体pET22b(+)、E. coli BL21(DE3)为例，具体介绍含有本发明细 菌漆酶基因的重组表达菌株的构建方法，具体包括以下步骤(1)以包含细菌漆酶基因的BAC载体DNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物；所述引物为Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘
P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pMDIS-T质粒连接，得连接产物；将连接产物 转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取 质粒，获得含有细菌漆酶基因(lacl5)的pMD18-T重组质粒；(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18_T重组质粒和pET22质粒， 然后用T4连接酶将酶切后的lacl5与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明lacl5基因的工程菌株 BL21(DE3)。与现有的细菌漆酶相比，本发明具有的优点为(1)本发明细菌漆酶基因来自于 海洋未培养微生物；2)本发明细菌漆酶在PH6-8范围内具有好的稳定性，45°C半衰期为73 分钟；(3)本发明细菌漆酶对偶氮染料的脱色作用强，可用于工业染料的脱色。保藏说明本发明的菌株Escherichia Coli BL21 (DE3)/pET22b (+) _lacl5 已送 往中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection, CCTCC)保藏， 保藏中心地址中国湖北省武汉市武昌珞珈山；保藏编号CCTCC NO :M2010160，保藏日期 2010年6月25日。
图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱；图1中1为分子量标准；2为PCR扩增产物。图2为本发明表达载体pET22b(+)/lacl5质粒的鉴定电泳图谱图2中1为分子量标准；2为pET22b (+)/lacl5质粒；3为经过Nde I/Xho I双酶 切的 pET22b(+)/lacl5 ；4 为经过 Ndel/Xho I 双酶切的 pET22b (+) ；5 为重组 pET22b (+) / lacl5质粒PCR扩增产物。图3为以丁香醛连氮为底物时测定的Lacl5催化的最适pH和pH稳定性。图3中〇为最适pH，·为pH稳定性。
图4为以丁香醛连氮为底物时测定的Lacl5催化的最适稳定和温度稳定性。图4中〇为最适pH，·为pH稳定性。
具体实施例方式下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。(一 )、含有本发明细菌漆酶基因的表达菌株的构建1、含有本发明细菌漆酶基因的阳性克隆的筛选及全长基因的获得从中国南海海洋表层海水100L (24° 21' 17N，118° 08' 59E)，分离微生物并提 取基因组，分离和提取方法同申请号为CN200810024342. 1，按照试剂盒(购自Epicentre公 司)提供的说明构建宏基因组文库。(Chu XM, He HZ,Guo CQ, Sun BL, 2008. Identification of two novel esterases from a marine metagenomic library derived from South China Sea. Appli. Microbiol. Biotechnol. 80，615-625.)得到的单克隆放置于 384 孔板并 于-70°C保存。将每个384孔板中的菌株混合接种在同一 LB液体培养基中培养，抽提混合质粒作 为模板(萨姆布鲁克等著，黄培堂等译.2002，科学出版社，349-350.)，以 CulS :ACMWCKGTTCAYTGGCACGG ；Cu2A GGCTGTGGTACCAGAAKGT 为引物，扩增本发 明细菌漆酶基因Cul和Cu2之间的DNA序列。PCR扩增程序如下第一阶段变性94°C，3min ； 第二阶段变性94°C，30sec，退火50°C，30sec,延伸72°C，80sec,共进行35个循环；第三阶 段延伸72°C，IOmin。得到的PCR产物用3%琼脂糖电泳检测，在140bp左右出现条带的初步 认为是阳性克隆。利用上述方法将阳性克隆定位到单克隆。抽提上述得到阳性单克隆的质 粒作为模板，以 CulS :ACMWCKGTTCAYTGGCACGG,Cu4A TGNTCNAGNAffGTGRCARTG 为引物，扩增 Cul和Cu4之间的DNA序列。PCR扩增程序如下第一阶段变性94°C，3min ；第二阶段变性 940C，30sec,退火48°C，30sec,延伸72°C，150sec,共进行30个循环；第三阶段延伸72°C， IOmin0得到的PCR产物用1 %琼脂糖电泳检测，将得到的IlOObp左右的片段送到上海生工 生物工程公司测序，获得编码序列。选取Nde I(TaKaRa)对阳性克隆质粒进行单酶切，建立如下酶切体系10ul 10XHbuffer，4ug阳性克隆质粒，20U内切酶，补水至100ul。反应体系于37°C温育4h。常 规的酚氯仿(25 24，v/v)抽提和75%乙醇沉淀，60ul无菌水溶解DNA片段，-20°C保存在5ml EP管中建立如下自身环化连接体系IOul IOXligation buffer，5ul (约 0. 2ug)上述单酶切回收产物，Iul T4DNA连接酶(TaKaRa)，补水至IOOul。反应体系在16°C 保温16h。常规的酚氯仿(25 24, ν/ν)抽提和75%乙醇沉淀，60ul无菌水溶解自身环 化连接DNA片段，_20°C保存备用。以上述自身环化连接产物为模板，以得到的IlOObp左右的DNA序列为基础，设计 反向 PCR 引物 D15IS :5’ -TACACTTGTGGATGCGGGTG,D15IA :5，-AGACCCTTCGCAACTTGTTCCCAT-3，，扩增已知 IlOObp 左右的 DNA 序列的 侧翼序列。PCR程序如下第一阶段变性94°C，5min ；第二阶段变性94°C，Imin,退火54°C， 30sec，延伸72°C，5min，共进行30个循环；第三阶段延伸72IOmin0得到的PCR产物用
琼脂糖电泳检测，将得到的3. Skb左右的片段送到上海生工生物工程公司测序，获得侧翼编码序列，结合前期得到的IlOObp长度片段，获得本发明细菌漆酶全长基因编码序列。 2、细菌漆酶基因的扩增设计一对寡核苷酸引物Pl和P2，其序列为Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘在引物的5'分别引入Nde I和Xho I酶切位点，以步骤1抽提的BAC DNA为模 板，扩增细菌漆酶基因。PCR反应程序如下第一阶段变性94°C，5min ；第二阶段变性94°C， lmin,退火520C，30sec,延伸72°C，2min,共进行30个循环；第三阶段延伸72°C，IOmin0得 到的PCR产物用琼脂糖电泳检测，结果见图1。得到的细菌漆酶的核苷酸序列如SEQ IDNo 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。3、表达载体的构建将步骤2中得到PCR扩增产物，与pMD18-T质粒连接(TaKaRa)，建立如下酶切体 系25ng pMD18-T 载体，50ngPCR 扩增产物，5ul ligation mix,补水至 10ul，16°C连接 lh。 连接产物热激转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，得到的转化子测序验证是否突变；挑选序 列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因(lacl5)的pMD18-T重组质粒；用Nde I 和XhoI双酶切所得的pMDIS-T重组质粒和pET22b(+)载体，然后用T4连接酶将酶切后的 lacl5与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系25ng pET22b (+)载体，50ng lacl5酶切片 段，3ullOXligation buffer, Iul T4DNA 连接酶(TaKaRa)，补水至 30ul，16°C 连接 8h，得到 连接产物；连接产物转化宿主菌，得到的转化子测序验证是否突变，挑选序列正确的转化子 得到含有本发明lacl5基因的工程菌株E. coli BL21 (DE3)/lacl5。( 二)、含本发明细菌漆酶基因工程菌的表达与蛋白纯化将(一)中获得的基因的工程菌株E. coli BL21(DE3)/lacl5接种于含有氨苄青霉 素的200ml LB液体培养基中，放置于37°C、250rpm条件下培养至OD6qq = O. 6(UNIC0 UV2102 紫外可见分光光度计，以培养LB培养基为空白)；加入终浓度为1. OmM的IPTG进行诱导， 并于16°C、ISOrpm条件下继续培养20小时；4°C、8000g离心收集菌体，加入0. 1倍菌液体 积的Binding buffer, 350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗 酶液。粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度分别为60mM、70mM、80mM、 90mM、100mM，每个浓度洗脱3个柱体积。在咪唑浓度为90_100mM时，得到的蛋白经过检测 达到SDS-PAGE纯度。以丁香醛连氮为底物，纯化的细菌漆酶Lacl5的最适pH为7. 5，酶在pH5. 5-8. 0范 围内有较高的稳定性，能够维持原酶活力的60%以上。以ABTS为底物，细菌漆酶Lacl5的 最适PH为4. 5-5.0。Lacl5在15°C _55°C范围内均能显示催化活性，其最适温度为45°C， 45°C时酶的半衰期为73min。(三)、含本发明细菌漆酶蛋白脱色偶氮染料能力检测在pH7. 5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液中加入终浓度为0. 4g/L的偶氮类染料(活性深 蓝M-2GE、活性艳橙K-7R、活性红KM-8B、活性红KD-8B)，加入终浓度为100ug/L的介体丁香 酸甲酯、丁香醛或ABTS (2，2’-连氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]，并加入终浓度 为5U/L的经M-NTA柱层析纯化的细菌漆酶蛋白，40°C条件下反应1小时，测定不同染料在各自最大光吸收下的光吸收值(Al)，以失活的细菌漆酶蛋白为对照(AO)0脱色率通过下述 公式计算
躕色率％ = ^^ X 100%Lac 15对各种染料的脱色能力如下表所示(表1)表1不同介体存在条件下Lacl5对各种染料的脱色能力(％ )
权利要求
一种细菌漆酶的基因编码，其特征在于，具有如下核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID No1；(2)序列表中的SEQ ID No1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQ ID No2蛋白质序列的多核苷酸序列。
2.含有权利要求1基因编码的细菌漆酶，其特征在于，具有下列氨基酸序列之一(1)序列表中的SEQID No 2 ；(2)序列表中的SEQID No :2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功 能蛋白质的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述的细菌漆酶基因的重组表达载体。
4.含有权利要求1所述细菌漆酶基因的宿主菌。
5.含有权利要求1所述细菌漆酶基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括 如下步骤(1)以包含细菌漆酶基因的细菌人工染色体载体(BacterialArtificial Chromosome,BAC)DNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述引 物为Pl 5' -CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3‘P2 5' -CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3‘(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和PMD18-T质粒连接，得连接产物；将连接产物转 化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质 粒，获得含有细菌漆酶基因(lacl5)的pMD18-T重组质粒；(3)用NdeI和Xho I双酶切步骤⑵所得的pMD18-T重组质粒和pET22质粒，然 后用T4连接酶将酶切后的lacl5与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明lacl5基因的工程菌株 E.coliBL21(DE3)/lacl5。
6.含有权利要求1或2所述基因编码的细菌漆酶蛋白在偶氮染料脱色方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种细菌漆酶及其表达及其应用，其基因编码序列如SEQ ID No1所示，该细菌漆酶是具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列的多肽，本发明还公开了含有该细菌漆酶的表达菌株。本发明所述细菌漆酶来自海洋未培养微生物，在pH6-8范围内具有好的稳定性，45℃半衰期为73分钟，且对偶氮染料的脱色作用强，可用于工业染料的脱色。
文档编号C02F3/00GK101955952SQ201010248218
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者张学成, 彭惠, 房伟, 方泽民, 李同亮, 洪宇植, 肖亚中 申请人:安徽大学