焦磷酸盐，isopentyl pyrophosphate)转化成类萌萝卜素的生物合成途径（Van Dien等，Appl. Environ. Microbiol. 69:7563-7566 (2003))，通过miaA基因产物将一些tRNA的腺嘌呤异戊基化以 产生反玉米素（Koenig等，J.Bacteriol. 184:1832-1842(2002))，用于来自色氨酸的吲 噪-3-乙酸的途径（Omer等，Plant Growth Regul. 43:93-96 (2004))，酶如丙酮酸脱羧酶和 醇脱氛酶以产生乙醇（Deng 和 Coleman，Appl. Environ. Microbiol. 65:523-528 (1999))，经 由来自丙酮丁醇梭菌的酶，如Bcd、EtfAB和AdhE2的表达从巴豆酰基-CoA产生丁醇（Shen 等，Appl. Environ. Microbiol. 77:2905-2915(2011))或经由 CoA 依赖的琥珀酸半醛脱氢酶 或2-酮戊二酸脱羧基酶（2-oxoglutarate decarboxylase)，随后的4-轻丁酸脱氢酶、4-轻 基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶和醇脱氢酶，来自琥珀酰基-CoA或α -酮戊 二酸的 1，4-丁二醇（Yim 等，Nat. Chem. Biol. 7:445-452(2011))。蛋白生产可以通过甲基 营养菌的强的表达系统完成，如依赖于扭脱甲基杆菌AMl的甲醇脱氢酶启动子（P_F)，如 pCM80、pCM110、pCM160 的那些（Marx 和 Lidstrom, Microbiology 147-2065-2075(2001))， 或诱导物调节的版本（变体，形式，version)，如pHCl 12 (Chou和Marx, Cell Reports 1:1-8(2012)) 〇
[0051] 实施例1
[0052] 用于C1代谢的RuMP途径
[0053] 用于C1R谢的核酮糖单磷酸途径存在于几种甲基营养生物，如专性甲基营养 生物鞭毛甲基杆菌（Methylobacillus flagellatus)KT和甲烧氧化菌荚膜甲基球菌 (methanotroph Methylococcus capsulatus)Bath 中。使用 RuMP 途径在甲醇上生长的甲 基营养生物以与在使用丝氨酸循环的甲基营养生物中同化的中间产物甲酸（formate)相 比的甲醛的氧化水平上同化碳。甲醛通过对于该途径独特的酶（称为己酮糖-6-磷酸合酶 (HPS))与核酮糖单磷酸缩合以产生己酮糖6-磷酸。己酮糖6-磷酸通过对于该途径独特的 另一种酶（称为己酮糖6-磷酸异构酶（PHI))异构化为果糖6-磷酸。取决于表1中列出 的生物体，利用包括在磷酸戊糖途径中的一些酶或包括在脱氧酮糖酸（Entner-DoudorofT) 途径中的一些酶可以同化果糖6-磷酸。如果通过磷酸戊糖途径同化果糖6-磷酸，那么两 分子的果糖6-磷酸就转变两分子的果糖二磷酸（fructose bisphosphate)，其中的每个分 裂以产生总共4分子的磷酸丙糖（丙糖磷酸，triose phosphate)。这4分子的磷酸丙糖中 的1个通过转化成丙酮酸同化为生物量，这导致产生1个NADPH和1个ATP。3分子的磷酸 丙糖利用一个或多个果糖6-磷酸分子通过与转羟乙醛酶、转二羟丙酮基酶/景天庚酮糖磷 酸酶和最后戊糖磷酸异构酶的一系列的反应重构以再生如表1列出的3分子的核酮糖单磷 酸。如果果糖6-磷酸通过去氧酮糖酸途径的酶同化，那么通过一系列的反应将1分子的果 糖6-磷酸断裂成丙酮酸和磷酸丙糖。磷酸丙糖连同两个其他分子的果糖6-磷酸通过与转 羟乙醛酶、转二羟丙酮基酶/景天庚酮糖磷酸酶以及最后戊糖磷酸异构酶的一系列的反应 重构以再生如表1中列出的3分子的核酮糖单磷酸。利用果糖二磷酸醛缩酶（也包括在磷 酸戊糖途径中的酶）和转二羟丙酮基酶作为断裂和重构中涉及的关键酶的用于C1化合物 的同化的RuMP途径是非常有效的。应该理解的是，虽然一些细菌可以仅需要HPS和PHI，但 是其他细菌可以包括另外的酶或它们的表达的定向的改变。对于产生的1分子的丙酮酸， 也产生了 1分子的NADPH和1分子的ATP。相反，丝氨酸循环导致每产生1分子的丙酮酸， 净消耗1分子的NADPH和1分子的ATP。
[0054] 也可以使用核酮糖单磷酸途径用于C1化合物的异化。由HPS和PHI产生的果糖 6-磷酸通过磷酸己糖异构酶异构化为葡萄糖一磷酸。葡萄糖一磷酸氧化为6-磷酸葡糖酸， 伴随NADP+还原为NADPH。由此形成的6-磷酸葡糖酸通过如表1中列出的称为磷酸葡糖酸 脱氢酶的酶氧化为核酮糖单磷酸，并且释放CO2以及将另一分子的NADP +还原为NADPH。
[0055] 当RuMP途径每异化1分子的甲醛产生2分子的NADPH时，H4MPT途径每异化1分 子的甲醛产生1分子的NADPH和~1分子的NADH。单纯从异化的能量学方面考虑，没有一 个具有更高的每单元碳的能量输出。然而，用于(^化合物的异化的RuMP途径涉及更少的 酶并且不要求复合辅助因子（complex cofactor)，像由用于C1化合物的H4MPT异化途径使 用的H4MPT。
[0056] 实施例1I
[0057] 用于(^代谢的RuMP途径：菌株1
[0058] 菌株1-用RuMP途径来代替用于C1异化的天然的H4MPT(四氢甲烷碟呤）途径。 丝氨酸循环将保持完整。然而，如图2所示，由于在RuMP途径的C1异化期间将不产生甲酸， 因此丝氨酸循环将变得多余，并且RuMP途径将开始C1同化。
[0059] 如上面描述的，RuMP途径和H4MPT途径在每分子甲醇完全氧化至CO 2的净能量输 出方面几乎是等同的。然而，考虑到这样的事实，即与H4MPT途径相比使用RuMP途径存在C1异化中涉及的更少的酶，以及结合在H4MPT途径中产生复合辅助因子的成本，我们认为RuMP 途径可以更有效地进行C1化合物的异化。然而，通过引入异化的RuMP途径的C ^七合物的 异化不能结合至用于同化的天然的丝氨酸循环。这是因为在通过RuMP途径的甲醇的异化 期间没有产生给料至丝氨酸循环的关键的代谢中间产物-甲酸。因此，尽管在菌株1中是 完整的，但丝氨酸循环在(^化合物的同化中将起到非常小的作用，并且至生物量的流量也 将主要通过RuMP途径运送。通过剔除涉及辅助因子（四氢甲烷碟呤）的生物合成中的基 因，并且用编码来自荚膜甲基球菌（M. capsulatus)Bath的己酮糖6-磷酸合酶（HPS)以及 己酮糖6-磷酸异构酶（PHI)的基因将其替换，消除用于C1异化的天然的H4MPT途径来构建 菌株1。应该注意的是，由于在该途径中的所有其他基因已经存在于宿主菌株中，因此在甲 基杆菌属基因组中仅需要两种基因（编码HPS和PHI的那些）以允许RuMP途径异化(^化 合物。
[0060] 用如图5所示的结构制造菌株。如下产生结构。被敲除的四氢甲烷碟呤的生 物合成途径中的特定基因是mptG(参考关于扭脱甲基杆菌PAl染色体的Mext_1828)， 其是核糖咲喃基氨基苯5' -磷酸（RFAP)合酶（Chistoserdova等，J. Bacteri 〇1. 187:2508-2512(2005))。编码mptG的ORF为1023个碱基长并且在染色体上的碱基 2049113和2050135之间的正链上发现。通过在5'端含有用于限制酶XbaI的识别序列的 正向引物（ATCTAGACTTCCTCACCGTCGCTTCTTCG)以及在5'端含有用于限制酶NdeI的识别 序列的反向引物（TCATATGCGTTGAGATCGAGGAAGCCGA)扩增用于结构（2048710-2049237)的 mptG的上游侧（upstream flank)。通过在5'端含有用于限制酶ApaI的识别序列的正向 引物（ACTCGAGGCATCACCGCGATCCAGAAGC)以及在5'端含有用于限制酶SacI的识别序列的 反向引物（TGAGCTCACGTCGAACGGGCTCATGT)扩增用于结构（2049864-2050304)的 mptG 的下 游侧（downstream flank) 〇
[0061] 在研究扭脱甲基杆菌PAl的基因组序列时，显然的是仅需要引入扭脱甲基杆菌 PAl代谢网络中的异化RuMP循环中的基因是HPS和PHI。这些基因由甲基荚膜球菌Bath 引入。在甲基荚膜球菌Bath中存在编码HPS的3种基因（在甲基荚膜球菌Bath的主染色 体上的MCA2738、MCA3043和MCA3049)，以及编码PHI的3种基因（在甲基荚膜球菌Bath 的主染色体上的MCA2738、MCA3044和MCA3050)。之前的工作（Ward等，PLoS Biology 2:e303(2004))表明大部分的碳通量通过MCA3049和MCA3050进入RUMP循环。因此，引入 这两个基因代替扭脱甲基杆菌PAl中的mptG基因以构建菌株1。如上面描述的，MCA3049 编码己酮糖6-磷酸合酶（HPS)基因，其在染色体上从3236945位点至3237592位点的正链 上长648bp。MCA3050编码在染色体上从3237605位点至3238138位点的正链上长534bp的 己酮糖6-磷酸异构酶（PHI)基因。使用在5'端具有用于限制酶NdeI的识别序列的正向 引物（TCATATGACCGGTGTCGCCAGGTACA)和在5'端具有用于限制酶ApaI的识别序列的反向 引物（TGGGCCCACGGACAACATGCCACGC)以扩增甲基荚膜球菌Bath染色体上从3236701位点 至3238196位点之间的区域，所述染色体包含用于MCA3049和MCA 3050的启动子、RBS (核 糖体结合位点）以及整个0RF。
[0062] 如在（Marx, BMC Research Notes 1:1 (2008))中描述的，以下面描述的顺序，在等 位交换载体（PCM433)的骨架上构建最终的结构。用限制酶NdeI和XbaI消化载体pCM433， 对于插入物，mptG上游侧也同样处理。使用由NEB(新英格兰生物实验室（New England Biolabs))制造的热敏磷酸酶将消化的载体的5'端去磷酸化。使用由Zymo Research Inc. 制造的凝胶提取试剂盒凝胶提取消化的载体和插入物。使用由NEB (新英格兰生物实验室） 制造的快速连接酶试剂盒（Quick Ligase Kit)连接3:1摩尔比率的插入物和载体。将1 μ 1 的连接混合物转化在由NEB (新英格兰生物实验室）制造的50 μ 1的10 β化学感受态细胞 中。将转化的细胞平铺在LB+四环素（12. 5 μ g/ml)+l. 2%琼指平板上并通过PCR筛选插 入物。筛选的插入物为阳性的菌落在LB+四环素（12.5 μ g/ml)中生长。在pCM433中具有 mptG上游侧的获得质粒命名为pDN117。使用由Qiagen制造的标准Miniprep试剂盒进行 质粒提取。对于下一轮，使用PDN117的dam/dcm版本作为载体以及包含mptG下游侧的 pCRII-Blunt-Topo载体的dam/dcm版本作为插入物。重复上面描述的相同方案。将获得 的质粒命名为PDN128。对于最后一轮，使用pDN128的dam /dcm版本作为载体以及具有包 含MCA3049和MCA30500RF、启动子和RBS的荚膜甲基球菌Bath的区域的pCRII-Blunt-Topo 载体的dam /dcm版本作为插入物，并且重复上面描述的相同方案。将获得的质粒命名 为pDN131。通过桑格测序（Sanger Sequencing)验证产生的所有质粒，并且用10% DMSO 在-80°C冰箱中将包含每个质粒的大肠杆菌菌株进行冷冻保存。
[0063] 使用3元杂交方案，将最终产生的结构（pDN131)引入至Δ cel扭脱甲基杆菌PAl 菌株中。含有PDN131的大肠杆菌菌株在IOml LB+四环素（12. 5 μ g/ml)中生长，包含具 有宽的宿主范围的质粒RK2的接合转移基因的称为pRK2073的辅助质粒的菌株在IOml的 LB+链霉素（50. 0 μ g/ml)中生长，以及扭脱甲基杆菌PAl在具有3. 5mM琥珀酸作为碳源的 IOml Hypho基本培养基中生长。大肠杆菌菌株在早期静止期收获，以及扭脱甲基杆菌PAl 在指数期中期收获（〇D_~0. 3)。在无任何抗生素的Iml新鲜LB培养基中再悬浮离心的 大肠杆菌细胞。在Iml Hypho基本培养基中再悬浮离心的扭脱甲基杆菌PAl。将50 μ 1在 LB中再悬浮的pRK2073加入至具有pDN131的再悬浮的大肠杆菌菌株，并且在37°C振荡培 养箱中温育（incubated) 1小时。将10 μ 1的该培养物滴涂在营养琼脂平板上并且允许风 干。将50 μ 1的扭脱甲基杆菌PAl培养物滴涂在营养琼脂平板上的大肠杆菌培养物的顶部 并且允许风干。将平板在30°C温育过夜以及在4°C下1天。在100 μ 1新鲜的hypho中悬 浮生长菌落，并且平铺在hypho+3. 5mM琥珀酸+1. 2%琼脂+四环素（10 μ g/ml)基本培养基 平板上。将来自第一个四环素平板的菌落在另一 hypho+3. 5mM琥珀酸+1. 2%琼脂+四环 素（10 μ g/ml)基本培养基板上划线以确保四环素抗性。抗四环素菌落是将等位交换载体 整合在染色体中的那些。然后，这些菌落在没有任何抗生素的hypho+3. 5mM琥珀酸中生长 过夜。将过夜生长物平铺在hypho+琥珀酸+1.2%琼脂+5%蔗糖基本培养基平板上。由于 鹿糖是反选