用于鲍鱼水产养殖的益生菌的生产的制作方法
【专利说明】用于鲍鱼水产养殖的益生菌的生产
【背景技术】
[0001] 本发明涉及利用新型生物加工技术来生产用于鲍鱼水产养殖的益生微生物的工 艺和培养基。
[0002] 目前并不存在生产鲍鱼益生菌的生物工艺。本发明促进了如下的鲍鱼益生菌的 生物生产：从细菌益生菌Vibrio midae、或酵母益生菌汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)或者它们的组合的小体积低温培养物生产益生菌产物。本发明描述了培养基、 接种程序、发酵工艺、生物质收集以及将生物质配制成可掺入到鲍鱼饲料中的液体产品和/ 或干燥产品。
[0003] 鲍鱼（鲍科（Haliotidae))是全球性地分布于沿海的温带和热带水域的海洋古腹 足类（vestigastropod)软体动物（Degnan等，2006)。鲍科由约56个种组成，全部种均属 于鲍属（Haliotis)。鲍鱼是世界上最有价值的海产品品种之一（Reddy-Lopata等，2006)， 在其已开发利用多年的远东地区具有相当大的需求量（Francis等，2007)。通常对鲍鱼的 需求远超过其供应，由于非法采集和偷猎，给天然鲍鱼的存量造成巨大压力。某些大型鲍鱼 的肉被许多人认为是理想的食品，并被认为是世界上最昂贵的蛋白产品之一。这种高价值 促进了密集型鲍鱼水产养殖的发展和优化（Park等，2007)。然而，鲍鱼水产养殖受到诸如 水质差、此类海洋软体动物固有的缓慢的生长速度和疾病等因素的挑战。
[0004] 鲍鱼水产养殖的成功依赖于适当的营养和疾病的消除（Naidoo等，2006)。该问题 的传统解决方案是在鲍鱼的水产养殖中使用抗微生物药物，然而该方式会导致抗生素耐药 性细菌的发展（Schwarz等，2001)，对环境和鲍鱼养殖造成负面影响，同时造成消费者的抵 制。Macey和Coyne (2006)提出补充有益生菌的饲料改善了鲍鱼的免疫系统和生长。
[0005] 鲍鱼具有极其缓慢的生长速度，需要花费近四年来达到市场可接受的尺寸。因此， 迫切需要研究加快鲍鱼的生长速度并提高其疾病耐受性的方法。
[0006] 对于鲍鱼养殖业面临的挑战，可选的方式是使用益生微生物。由于对环境友好型 水产养殖需求的增加，该技术变得普及。益生菌是活的微生物，在以适当量给予时赋予宿主 以保健效应。它们显示出控制疾病、改善消化以及提高养殖品种的免疫力和整体生长。
[0007] Macey和Coyne (2006)从作为鲍鱼的南非鲍（Haliotis midae)的胃肠道中分离 出Vibrio midae和汉逊德巴利酵母，并对益生菌活性、特别是提高鲍鱼生长速度的能力进 行了评价。Macey和Coyne (2005)进行的研究显示，对鲍鱼饲料补充这些益生微生物产生改 善的生长速度。益生微生物能够分解存在于天然海藻（鲍鱼食料）中的复杂多糖和蛋白并 且能够增高消化效率，由此改善鲍鱼的生长速度（Coyne等，2004)。这些微生物提高了鲍鱼 肠内的一些活性，如噬菌作用活性、蛋白酶活性和淀粉酶活性。
[0008]目前的技术描述了天然存在的细菌和酵母在水产养殖中作为益生菌的用途。在这 方面，现有技术公开了来自弧菌科（vibrionaceae)的细菌在对奸（Ruangpan等，1998)和褐 奸（Austin等，1995)的水产养殖中作为益生菌的用途。Nair等，1985 ;Carraturo等，2006 和Castro等，2006报道了从海洋环境中分离的其它弧菌种也显示出益生菌效果。
[0009]南非专利 2004/06777 以及 Macey 和 Coyne (2005, 2006)进行的工作描述了 Vibrio midae和汉逊德巴利酵母在鲍鱼的水产养殖中作为益生菌的用途。该工作的主要部分中，在 22°C下于海洋肉汤（MB)中培养Vibrio midae，在22°C下于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉 汤（YPD)培养基中培养汉逊德巴利酵母。Macey和Coyne进行的工作并未研究最佳培养条 件、细胞培养物浓度，并未测量培养物的光密度和/或测量生物质的生产。对Macey和Coyne 使用的工艺和生产培养基与本发明的工艺和生产培养基进行的比较性评价表明，与现有技 术中关于Vibrio midae和汉逊德巴利酵母的描述相比，本发明人能够将Vibrio midae和 汉逊德巴利酵母的细胞产率显著提高多个数量级（参见实施例3)。
[0010] 汉逊德巴利酵母通常用作工业酵母。之前对该酵母进行的研究一般并未关注将其 作为全细胞生物催化剂的用途，而是关注该酵母在代谢产物（如甘油和木糖）生产中用途 (Adler 和 Gustafsson，1980 ;Parajo 等，1997)。
[0011] 然而，现有技术将汉逊德巴利酵母描述为水生物种（例如，鲈鱼（Tovar等，2002) 和虹鳟鱼（Andlid等，1995))的微生物群中的一员。在这些研究中，同样在酵母提取物-蛋 白胨-葡萄糖肉汤（YPD)中培养汉逊德巴利酵母，并且这些研究均未对最佳培养条件、细胞 培养浓度、光密度或生物质生产进行研究。
[0012] 本申请文件描述了用于培养Vibrio midae和汉逊德巴利酵母的新型高产率生物 工艺以及Vibrio midae和汉逊德巴利酵母在水产养殖中的用途。该领域中此前的工作并 没有提供用于鲍鱼益生菌的大规模生产的工艺。
【发明内容】
[0013] 本发明提供了用于生产益生菌饲料组合物的新型工艺，其中，所述益生菌饲料组 合物包含Vibrio midae的活的培养物和/或汉逊德巴利酵母细胞的活的培养物和/或所 述活的培养物的组合。
[0014] 根据本发明的第一方面，提供了用于培养益生菌的生长培养基，所述益生菌用于 生产鲍鱼的益生菌组合物和益生菌饲料。
[0015] 在本发明的一个实施方式中，生长培养基是细菌生长培养基，所述细菌生长培养 基包含：柠檬酸、Η3Ρ04、约 Og/Ι-约 4g/l (NH4) 2S04、Ca (NO3) 2、MnSO4 · 7H20、FeSO4 · 7H20、KCl、 约 20g/l_ 约 40g/l NaCUMgCl2 ·6Η20、约 42g/l_ 约 255g/l 玉米衆、约 lg/l_ 约 40g/l 转化 的高级糖蜜（inverted high test molasses)、以及约0.5ml/l_约5ml/l消泡剂；该生长培 养基的pH为约5-约8。优选的是，细菌生长培养基包含约lg/Ι柠檬酸、约2.5ml/l Η3Ρ04、 约0.48/10&(勵3)2、约0.04(^/1]\11150 4.7!120、约 0.0328/1?6504.7!120、约18/11((：1、约 30g/l NaCl、约2. 3g/l MgCl2 · 6H20、约54. 4g/l玉米浆、约24g/l转化的高级糖蜜、以及约 lml/Ι消泡剂；其中，该生长培养基的pH维持在约6. 5。与海洋肉汤（MB)培养基相比，该细 菌生长培养基支持显著更高的Vibrio midae的细胞产率（g/1/h)。
[0016] 在本发明的另一实施方式中，生长培养基是酵母生长培养基，所述酵母生长培养 基包含：柠檬酸、Η3Ρ04、约 18g/l-约 30g/l (NH4)2S04、MgS04 WH2SO4XaCl2 ·2Η20、约 Og/Ι-约 40g/l NaCl、KH2PO4、约8g/l-约212g/l玉米浆、约lg/1-约40g/l转化的高级糖蜜、以及 约0. 5ml/l-约5ml/l消泡剂；该生长培养基的pH为约4-约7。优选的是，酵母生长培养 基包含约 2. 5g/l 柠檬酸、约 16. 3ml/l Η3Ρ04、约 30g/l (NH4)2S04、约 8. 2g/l MgSO4 · 7H2S04、 约 0· 8g/l CaCl2 ·2Η20、约 0· lg/1 NaCl、约 11. 3g/l KH2P04、约 204g/l 玉米浆、约 10g/l 葡 萄糖、以及约lml/1消泡剂；其中，该生长培养基的pH维持在约5. 6。与酵母提取物-蛋白 胨-葡萄糖（YPD)培养基相比，该酵母生长培养基支持显著更高的汉逊德巴利酵母的细胞 产率（g/1/h)。
[0017] 根据本发明的第二方面，提供了用于生产益生菌组合物的工艺，其中，所述工艺包 括如下步骤：（i)通过将活的Vibrio midae细胞和/或活的汉逊德巴利酵母细胞的培养物 接种至接种物培养基，制备预发酵培养物；（ii)将预发酵培养物接种至反应器中含有的生 长培养基；（iii)在Vibrio midae细胞和/或汉逊德巴利酵母细胞的生长期期间，控制生长 培养基的PH、温度、气流量、氧饱和度以及背压；（iv)在对数生长中期和稳定生长期之间， 当细胞处于稳定形式且活细胞的浓度为2 X IO8个细胞/ml至I X 10 11个细胞/ml时，收集 Vibrio midae细胞；或者，在对数生长中期和对数生长晚期之间，当活细胞的浓度为4X IO7个细胞/ml至2X 101°个细胞/ml时，收集汉逊德巴利酵母细胞；以及（V)通过将收集的 Vibrio midae细胞和/或汉逊德巴利酵母细胞重悬于缓冲液中，生产液体产品。
[0018] 本申请文件中描述的分离的Vibrio midae于2013年7月1月保藏在Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)，保藏编号为LMG P-27727。同样，本 申请文件描述的分离的汉逊德巴利酵母培养物于2013年7月1日保藏，保藏编号为MUCL 54982〇
[0019] 所述工艺可进一步包括如下步骤：(vi)将液体产品与载体、稳定剂或填料进行混 合，以形成生物质糊状物；以及（vii)将生物质糊状物进行干燥，以生产干燥产品。
[0020] 本发明的工艺可为间歇工艺或间歇补料工艺。优选的是，对于Vibrio midae而言， 所述工艺为间歇工艺；对于汉逊德巴利酵母而言，所述工艺为间歇补料工艺。
[0021] 在本发明的优选实施方式中，进入用于间歇补料工艺或间歇工艺的反应器中的气 流量为〇. 5v/v/m-2. Οv/v/m。优选的是，进入反应器中的气流量为lv/v/m。
[0022] 在本发明进一步优选的实施方式中，发酵培养基中的溶解氧优选处于 20% -100%的饱和度。更优选的是，溶解氧维持在30%的饱和度。
[0023] 在本发明进一步优选的实施方式中，反应器中的背压优选为0_250kPa。更优选的 是，反应器中的背压为50kPa。
[0024] 优选将Vibrio midae细胞在20°C-34°C的温度下于培养基中进行培养。最优选 将Vibrio midae细胞在30°C的温度下进行培养。另一方面，优选将汉逊德巴利酵母细胞在 16°C _34°C的温度下于培养基中进行培养。最优选将汉逊德巴利酵母细胞在24°C的温度下 进行培养。
[0025] Vibrio midae的培养基的pH优选为5. 0-8. 0,最优选该pH为6. 5。汉逊德巴利酵 母的培养基的pH优选为4. 0-7. 0,最优选该pH为5. 6。
[0026] 应理解的是，本发明工艺中使用的生长培养基包含用于Vibrio midae和/或汉逊 德巴利酵母细胞生长的营养物。所述营养物选自于由无机盐、碳源、氮源、维生素、微量元 素、消泡剂和上述物质的混合物所组成的组。此外，应理解的是，接种物培养基包含用于本 发明工艺中使用的益生菌的生长的营养物，所述营养物选自于由如下物质所组成的组：无 机盐、碳源、氮源、维生素、微量元素和上述物质的混合物。
[0027] 在本发明的一个实施方式中，通过离心或过滤从生长培养基中收集益生微生物。 在优选的实施方式中，通过垂直管离心收集益生微生物。
[0028] 在本发明的优选实施方式中，将益生微生物Vibrio midae重悬于磷酸盐缓冲液 中，从而生成液体产品。类似地，将益生微生物汉逊德巴利酵母重悬于磷酸盐缓冲液中，从 而生成液体产品；优选磷酸盐缓冲液包含约4m/m% -20m/m%海藻糖、优选12. 5m/m%海藻 糖；该缓冲液的pH为约4-6,优选该pH为4. 5。
[0029] 在本发明进一步优选的实施方式中，将液体产品与载体进行组合以形成混合产 品，所述载体选自于由微晶纤维素、海藻糖、蔗糖和脱脂奶或它们的组合所组成的组。在另 一优选的实施方式中，将生物质糊状物挤出并干燥，从而形成干燥产品。
[0030] 通常在30°C _70°C的温度下对与载体组合的Vibrio midae液体产品进行挤出，然 而优选在45°C的温度下进行挤出。通常在30°C _50°C的温度下对与载体组合的汉逊德巴利 酵母液体产品进行挤出，然而优选在45°C的温度下进行挤出。