专利名称：烟草节杆菌在养殖业中抑制对虾幼体病原性弧菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水产益生菌——烟草节杆菌，特别是涉及烟草节杆菌在养殖业中抑制对虾幼体病原性弧菌的应用。
背景技术：
弧菌病是对虾的主要病害之一，其中某些病原性弧菌如鳗弧菌、副溶血弧菌等是对虾的主要病原菌。弧菌病发病快，死亡率高，分布区域几乎是世界性的，对养殖对虾的侵害没有种属选择性和地理上的差异性，也无明显的季节流行性，在一年四季以及育苗、养成和亲虾越冬等各个阶段都有发生，严重地威胁着对虾养殖业的发展。化学药物和抗生素是目前防治弧菌病最为便捷有效的措施，但是由于滥用而导致的细菌耐药性及药物残留等问题已引起了广泛的关注与焦虑。
发明内容
本发明的目的在于将烟草节杆菌用于养殖业中抑制对虾幼体的病原性弧菌，以弥补现有技术的上述不足。
烟草节杆菌在养殖业中抑制对虾幼体病原性弧菌的应用本发明中所用的烟草节杆菌对副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌有拮抗作用，用于养殖水体中能够显著的减少水体中弧菌的数量，显著的提高中国对虾幼体抵抗病原性弧菌的能力，从而提高对虾的成活率，其效果和氯霉素相当。和氯霉素相比，还具有显著的降低水体中氨态氮浓度的作用。
附图1为烟草节杆菌在用副溶血弧菌1、鳗弧菌2和沙蚕弧菌3涂布的海洋细菌琼脂培养基(2216E)上生长的示意图。
附图2为养殖水体中施用烟草节杆菌、病原性弧菌或氯霉素对养殖对虾幼体成活率的影响示意图。
附图3为养殖水体中施用烟草节杆菌、病原性弧菌或氯霉素后水体中弧菌数在7天内变化示意图。
附图4为养殖水体中试用烟草节杆菌、病原性弧菌或氯霉素后水体中[NH4+-N]在7天内变化示意图。
附图2，3，4中均以P＞0.05为标准，对三个重复的平均数进行最小二乘法(LDS)多重比较，差异不显著的处理组数值标有相同的英文字母，其中VBC表示弧菌总数，VB-μ表示弧菌衰减率，SG表示表观增长率，D1表示第1天，7表示第7天。
具体实施例方式
本实施例所用的烟草节杆菌由中国海洋大学水产动物营养研究室分离自中国对虾养殖水体，经中国科学院微生物研究所鉴定，确定为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)。所用的病原性弧菌副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌是由黄海水产研究所海水增养殖病害与生态研究室提供，在体外拮抗试验中用作指示菌，在攻毒试验中用作致病菌。所用的氯霉素原粉购自Sigma公司。攻毒试验用虾为3日龄的中国明对虾幼体(Penaeus chinensis)，购自青岛对虾养殖场。参照Smith和Davey(1993)的平板点种和划线方法进行体外拮抗试验。
进行拮抗试验时，将副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌分别在海洋细菌液体培养基(2216E)中培养16-18h后，各吸取0.1ml新鲜的培养液(107CFU/ml)，分别在2216E固体琼脂培养基上均匀涂布。27℃下培养15min，用接种环刮取烟草节杆菌苔，在上述各平板上进行重复点种或划线。在27℃下培养24h后，观察烟草节杆菌苔周围是否出现抑菌圈。有抑菌圈出现，说明烟草节杆菌对副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌有拮抗作用，抑菌圈直径的大小反映了拮抗作用的强度。
进行攻毒试验时，将3日龄的中国明对虾幼体驯化7天后，随机分成18组，每250尾为1组放养于同一封闭水族箱(50×40×40cm3)内，连续充气。养殖水体中分别添加2水平烟草节杆菌(0；106CFU/ml)或者2水平的氯霉素(0；2mg/l)，分别用2水平的致病菌(0，106CFU/species/ml)进行水浴攻毒，共计6个处理组(见表1)，每个处理随机安排3个水族箱。对照组养殖水体中不添加任何细菌或氯霉素，A、C、V、AV和CV分别表示烟草节杆菌试验组(试验水体中烟草节杆菌浓度为106CFU/ml)、氯霉素试验组(试验水体中氯霉素浓度为2mg/l)、病原性弧菌试验组(试验水体中每种弧菌的浓度为106CFU/ml)、烟草节杆菌和病原性弧菌试验组(试验水体中烟草节杆菌浓度为106CFU/ml；每种弧菌的浓度为106CFU/ml)、氯霉索和病原性弧菌试验组(试验水体中氯霉素浓度为2mg/l，每种病原性弧菌浓度为106CFU/ml)。
表1.不同处理组水体中烟草节杆菌、病原性弧菌和氯霉素的含量。
成分 处理组水体对照组A C V AV CV烟草节杆菌(106CFU/ml) - + - -+ -氯霉素(2mg/l) - - + -- +病原性弧菌(106CFU/species/ - - - ++ +ml)+，-分别表示添加和不添加相应的成分；虾苗饲喂商业饲料(购自青岛思福得饲料公司)，每天投喂3次，日投饵量约为对虾体重的6％，保证各个水族箱饲料的日投饵量相同。每天及时清除残饵和粪便，同时添加相同体积的海水，保持各个水族箱内水体体积和日换水量相同。第7天换3/4体积的养殖水体，换水后向水体中再次添加同量的细菌或氯霉素。正式试验期为14天。养殖水体的盐度和温度分别控制在29‰-31‰和22℃-24℃之间。
试验开始后，第1天和第7天采集水样，分析养殖水体中的细菌总数、弧菌数、氨态氮(NH3-N)和亚硝态氮(NO2-N)含量。水样被灭菌的生理盐水倍比稀释后，在海洋细菌固体培养基(2216E)平板和弧菌培养基(TCBS)培养基平板上进行涂布，27℃下培养24h-48h，根据平板上细菌菌落生成数(CFU)来分别表示水体中细菌总数和弧菌数。水体中NH3-N和NO2-N含量根据UNESCO(1983)的方法进行测定。试验结束后统计试验动物的累计死亡率。
水体中细菌数和氮含量的变化分别用公式(1)和(2)进行计算μ＝(Ln Nt-Ln No)/t(1)SG＝(Ct-Co)/t (2)其中t试验时间，天；μ细菌衰减率；Nt试验第t天水体中细菌数，CFU/ml；No试验开始时水体中细菌数，CFU/ml；SG水体中氮的表观生长率；Ct试验第t天水体中氮的浓度，mg/l；Co试验开始时水体中氮的浓度，mg/l；体外拮抗试验结果见图1，攻毒试验的结果分别列于图2、图3和图4。用SPSS(版本11.0)软件包对所有实验数据进行ANOVA分析，不同处理之间的显著差异性(P＜0.05)用最小二乘法(LSD)进行多重比较。
从图1中可以看出，烟草节杆菌能在用副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌涂布的2216E平板上生长，在菌苔的周围出现明显的抑菌圈，抑菌圈的直径分别为3.29cm，4.00cm和3.67cm。表明烟草节杆菌对副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌有拮抗作用。
从图2可以看出，病原性弧菌对养殖对虾有致病作用，养殖水体中施加病原性弧菌能显著的降低对虾的成活率；而水体中添加烟草节杆菌或氯霉素能显著的提高对虾的成活率，并且烟草节杆菌和氯霉素的作用效果相当。
从图3可以看出，烟草节杆菌或氯霉素对病原性弧菌具有抑制作用，养殖水体中施加烟草节杆菌或氯霉素能显著的加速水体中病原性弧菌的衰减速率，氯霉素的作用效果稍强于烟草节杆菌。
从图4可以看出，养殖水体中施加病原性弧菌或氯霉素能显著的加剧养殖水体中氨态氮的产生速率；养殖水体中添加烟草节杆菌后氨态氮的产生速率显著的降低。
权利要求
1.烟草节杆菌在养殖业中抑制对虾幼体病原性弧菌的应用。
全文摘要
烟草节杆菌在养殖业中抑制对虾幼体病原性弧菌的应用。本发明中所用的烟草节杆菌对副溶血弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌有拮抗作用，用于养殖水体中能够显著的减少水体中弧菌的数量，显著的提高中国对虾幼体抵抗病原性弧菌的能力，从而提高对虾的成活率，其效果和氯霉素相当。和氯霉素相比，还具有显著的降低水体中氨态氮浓度的作用。
文档编号A23K1/18GK1593186SQ200410024438
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月7日 优先权日2004年7月7日
发明者谭北平, 李继秋, 麦康森, 艾庆辉, 张文兵, 徐玮, 马洪明, 刘付志国 申请人:中国海洋大学