专利名称：烟草节杆菌作为对虾饲料添加剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种烟草节杆菌，特别是涉及烟草节杆菌用作饲料添加剂以提高对虾免疫力和抗病力的应用。
背景技术：
近年来，对虾养殖业已进入大规模的工场化养殖阶段，但是，一直遭受着病害的困扰，主要是细菌病和病毒病。目前，抗生素作为防治药物虽然便捷有效，然而，耐药菌株的产生使抗生素的疗效越来越不理想，并且变异病原菌往往会引起更为严重的疾病。另外，抗生素在水产品中的残留也直接威胁着人类的健康与安全。接种疫苗是目前水产养殖上预防传染性疾病一个最为有效的办法，但疫苗针对性强、作用范围小。对于特异性免疫系统不够发达或缺乏的低等无脊椎动物(如虾、贝类等)作用有限。
发明内容
本发明的目的在于将烟草节杆菌作为饲用益生菌添加到对虾饲料中，通过提高非特异性免疫力来提高养殖对虾对传染性疾病的抵抗力，能弥补烟草节杆菌作为对虾饲料添加剂的应用。
本发明中所用的烟草节杆菌在对虾饲料中的添加量为108CFU/g饲料时，能够显著的减少对虾肠道中弧菌的数量，显著的提高对虾的非特异性免疫力。当添加量为108～1010CFU/g饲料时，显著的提高养殖对虾对副溶血弧菌的抵抗力，从而显著的降低对虾的死亡率。它具有比抗生素更安全而且比疫苗作用更广泛等优点。
附图1为饲喂含有不同水平烟草节杆菌饲料对虾的肠道弧菌数在不同时间点的测定结果示意图。
附图2为饲喂含有不同水平烟草节杆菌饲料对虾的血细胞数在不同时间点的测定结果示意图。
附图3为饲喂含有不同水平烟草节杆菌饲料对虾的血清酚氧化酶活性在不同时间点的测定结果示意图。
附图4为饲喂含有不同水平烟草节杆菌饲料对虾的血细胞吞噬活性在不同时间点的测定结果示意图。
附图5为饲喂不同水平烟草节杆菌饲料对虾的血细胞呼吸爆发活性在不同时间点的测定结果示意图。
附图6为饲喂不同水平烟草节杆菌饲料对虾的血清磷酸酶活性在不同时间点的测定结果示意图。
附图7为饲喂不同水平烟草节杆菌饲料的对虾在攻毒期间累计死亡率的示意图。
以上各图中均以P＞0.05为标准，对三个重复的平均数进行最小二乘法(LDS)多重比较，差异不显著的处理组数值标有相同的英文字母。
具体实施例方式
本实施例所用的烟草节杆菌由中国海洋大学水产动物营养研究室分离自中国对虾养殖水体，经中国科学院微生物研究所鉴定，确定为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)。所用的病原性弧菌副溶血弧菌是由黄海水产研究所海水增养殖病害与生态研究室提供，在攻毒试验中用作致病菌。试验用虾为体长5-6cm的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)，购自青岛对虾养殖场。所用的饲料原料购置青岛农贸市场。对虾血液抗凝剂参照Vargas-Albores(1993)的配方进行配制，测定血清酚氧化酶和呼吸爆发活性所用的次甲砷酸钠缓冲液(CAC)参照Hernández-López(1996)的配方配制，所用的化学药品购自Sigma公司。
饲料原料经粉碎通过80目筛，按基础饲料(表1)配方称取原料，并充分混合。在该基础饲料中分别添加4水平的烟草节杆菌(0，106，108，1010CFU/g饲料)做成基础饲料(Diet0)、试验饲料1(Diet1)、试验饲料2(Diet2)和试验饲料3(Diet3)共4种饲料。根据试验饵料所需的添加量，先用生理盐水将新鲜的烟草节杆菌细胞培养液稀释，然后和基础饲料按1∶3(重量比)的比例进行混合均匀。常温下挤压制粒，利用风扇在室内吹干后放置于洁净的塑料袋内，储存在4℃的冰箱内待用。每2周做一次新鲜饲料。
饲养试验开始前将对虾驯养10天后，随机分成12组，每组75尾放养于流水式的水族箱(300-1)内，连续充气。每种饲料随机安排3个水族箱。试验期间养殖水体的盐度和温度分别控制在29‰--31‰和25-29℃之间。
饲养试验开始后的第7天、21天和第49天采样，第50天封闭流水养殖系统，用副溶血弧菌(107CFU/ml)水浴攻毒，并于攻毒后第16天采样，统计对虾的存活率。每次采样从每个桶中随机取6尾对虾，用1ml无菌注射器自对虾的腹血窦中取血，按1∶2(按体积)的比例和对虾血液抗凝剂充分混合，置于离心管中。取部分血淋巴用于血细胞计数、细胞吞噬百分数和呼吸爆发活性的测定，取部分血淋巴液在4℃下以300×g离心30min，取血淋巴上清液用于酚氧化酶活性和磷酸酶活性的测定。采集血淋巴液后的对虾用于对虾肠道弧菌计数。
表1.基础饲料配方(g/100g饲料)原料配比鱼粉43.6面粉22.5豆粕9.5花生粕 14乌贼粉膏3鱿鱼内脏粉 2
大豆卵磷脂 2优质海鱼油 1黄豆油 1复合维生素 0.2维生素C 0.03复合矿物质 0.5KH2PO40.37氯化胆碱(50％) 0.25抗氧化剂0.05合计100注复合维生素和复合矿物质由青岛玛斯特生物技术有限公司提供。
计数肠道弧菌数时，先无菌操作将对虾解剖，取肠道分别置于无菌匀浆器，加1ml无菌的生理盐水匀浆，取匀浆液进行10倍系列稀释，再取0.1ml涂布弧菌培养基(TCBS)，28℃培养2天后统计菌落数，统计对虾肠道中弧菌数。
血细胞计数是利用血球计数板在光学显微镜400倍下直接计数，计算出每毫升血淋巴中的血细胞数目。
酚氧化酶活性测定参照Hernández-López(1996)的方法，取50μl血清样品和50μl L-Dopa(3mg/ml CAC)加入96孔微孔板。于室温下混合均匀，25℃下水浴10min，每隔1min用酶标仪(TECAN SAFIRE)读取O.D.492值。采用以牛血清蛋白为标准蛋白的方法测定血清蛋白的浓度(Bradford，1976)。以试验条件下每mg血清蛋白氧化底物时，每min O.D.492值增加0.001即定义为一个酶活力单位。
血细胞吞噬活性测定参照Park和Jeong(1996)方法进行。用磷酸缓冲液(0.02M；pH7.5)配制浓度约为107细胞/ml的酵母悬液。每个样品取0.1ml的血淋巴液和0.1ml酵母悬液混合，置于96孔微孔平板内，充分混匀。然后置于水浴锅中，25℃下培育30min。平均每10min摇匀一次。培育完毕后，每个样品取3份各50μl反应混合液均匀的涂布于洁净的载玻片上。待晾干后，滴加无水甲醇固定3min，用对虾血液抗凝剂冲洗，晾干。再用姬姆萨染液染色5min。在光学显微镜下观察，计数发生吞噬的血细胞。细胞吞噬％采用以下公式计算细胞吞噬百分数＝视野内吞噬酵母的血细胞数/视野内血细胞总数×100％。
呼吸爆发活性测定参照Song和Hsieh(1994)的方法。其原理为用四唑氮蓝(NBT)的减少量来测定过氧化物离子的产量。在96孔微孔平板中进行反应，每孔中滴加50μl 0.2％多聚赖氨酸水溶液(0.2g多聚赖氨酸溶解于100ml水溶液)后，每个样品取100μl血细胞加入微孔平板孔中。待血细胞沉淀后，用CAC反复冲洗后，在4℃下以300×g离心10min，去除上清液，加入100μl冰冷的CAC溶液。然后加入100μl 0.3％NBT(0.3g NBT溶解于100mlCAC溶液)，37℃下染色30min后，用无水甲醇终止染色反应。每个孔用70％甲醇水溶液(甲醇和水体积比为7∶3)冲洗三次，风干后，加入60μl 2M KOH水溶液和70μl DMSO，充分溶解后，利用酶标仪(TECANSAFIRE)读取O.D.630值。以该试验条件下，用100μl血淋巴液中的血细胞产生的过氧化物离子量来衡量呼吸爆发活性。
以硝基苯磷酸二钠(PNPP)为底物测定酸性磷酸酶活性，根据其一定酸碱条件下反应生成对硝基酚的含量来衡量磷酸酶活性(Kuda等，2002)。取50μl血清加入100μl 0.1Mmol NaAC-HAC(pH4.5)缓冲溶液中，其中含有20mM硝基苯磷酸二钠(PNPP)，于37℃反应30min，加入100μl 0.2M NaOH的水溶液终止反应。在520nm下测定对硝基酚的生成量。血清蛋白浓度的测定采用以牛血清蛋白为标准蛋白的方法(Bradford，1976)。酸性磷酸酶活力单位规定血清中每mg酶蛋白在37℃下与底物作用每min产生1mg对硝基酚为1个活力单位。
用SPSS(版本11.0)软件包对所有实验数据进行ANOVA分析，不同处理之间的显著差异性(P＜0.05)用最小二乘法(LSD)进行多重比较。
从图1中可以看出，长时间持续饲喂烟草节杆菌影响对虾肠道中的弧菌数，随着烟草节杆菌的添加量增加肠道中弧菌数呈下降趋势，用副溶血弧菌攻毒后，对虾肠道中弧菌数有上升趋势，并且随着烟草节杆菌饲喂量的增加肠道中弧菌数下降的趋势更加明显。
从图2可以看出，对虾的血细胞数随着饲料中烟草节杆菌添加量的增加而呈上升趋势，当烟草节杆菌添加量为108CFU/g时，对虾的血细胞数目最大。用副溶血攻毒后，各组对虾的血细胞数目下降，饲喂含有1010CFU/g烟草节杆菌的对虾血细胞数最大。
从图3可以看出，对虾的血清酚氧化酶活性随着饲料中烟草节杆菌添加量的增加而呈上升趋势，当烟草节杆菌添加量为108CFU/g时，对虾的血清酚氧化酶活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各组对虾血清酚氧化酶活性升高，且随着饲料中烟草节杆菌添加量的增加而上升。
从图4可以看出，对虾血细胞吞噬百分数随着饲料中烟草节杆菌添加量的增加而呈上升趋势，当添加量为108CFU/g时，对虾的血细胞吞噬活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各组对虾血细胞吞噬活性下降，但是，饲喂含有108CFU/g烟草节杆菌的对虾血细胞吞噬百分数最大从图5可以看出，对虾血细胞呼吸爆发活性随饲料中烟草节杆菌添加量的增加而呈上升趋势，当添加量为108CFU/g时，对虾的血细胞吞噬活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各组对虾血细胞呼吸爆发活下降，饲喂含有108CFU/g烟草节杆菌的对虾血细胞呼吸爆发活最大。
从图6可以看出，对虾的血清酸活性磷酸酶随着饲料中烟草节杆菌添加量的增加而呈上升趋势，当添加量为108CFU/g时，对虾的血清磷酸酶活性最大。用副溶血弧菌攻毒后，各组对虾血清磷酸酶活性上升，但是，饲喂108CFU/g烟草节杆菌的对虾血清磷酸酶活性最大。
由图7可知，饲料中添加烟草节杆菌能增强养殖对虾对副溶血弧菌的抵抗力，降低对虾的死亡率，其中饲喂含有108～1010CFU/g烟草节杆菌的对虾的死亡率显著的低于对照组。
权利要求
1.烟草节杆菌作为对虾饲料添加剂的应用。
全文摘要
烟草节杆菌作为对虾饲料添加剂的应用。本发明中所用的烟草节杆菌在对虾饲料中的添加量为10
文档编号A23K1/18GK1593187SQ200410024439
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月7日 优先权日2004年7月7日
发明者李继秋, 谭北平, 麦康森, 徐玮, 刘付志国, 艾庆辉, 张文兵, 马洪明 申请人:中国海洋大学