一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用。该海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis?sp.)QZ042于2013年8月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC?No.8101。 申请人:通过实验发现，本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis?sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物对大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌和副溶血弧菌药物等细菌具有较好的抗细菌活性，对散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉和茎溃疡病菌等真菌具有明显的抑菌作用，为研究与开发新的抗细菌、抗真菌药物提供了筛选药物。
【专利说明】一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及海洋微生物菌种，具体涉及一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用。
【背景技术】
[0002]病原细菌和真菌可引起动植物的多种病害，其不仅影响农作物产量和经济动物生长生产，造成极大的经济损失；而且影响人体健康，威胁人类生命安全。为了抑制和消灭病原细菌和真菌，人们一直致力于从不同环境中寻找新的有效的抗菌药物，以缓解越来越严重的耐药性菌株的出现。
[0003]在抗真菌药物的研究上，1939年来自青霉菌(Penillicilium griseofulvum)菌体的灰黄霉素(Griseofulvin)成为发现的第一个抗真菌抗生素，1955年第一个抗真菌药物两性霉素问世，以后又陆续开发了氟胞嘧啶和唑类等抗真菌药物。但是目前抗真菌药物仍然存在种类缺乏、选择性小、毒副作用大和耐药性强的缺点，因此研究和开发新型、高效、低毒、广谱的抗真菌药物十分必要。
[0004]在抗细菌药物的研究上，从第一个抗菌药物青霉素的出现，到后来的四环素、氯霉素、卡那霉素、利福平等抗生素，都在人类对抗病原细菌上发挥了较重要作用，但随着抗生素的烂用。越来越多的多耐药性病原菌开始出现，这是人类面临的又一挑战，挖掘新的抗菌药物和新的抗菌机制，是人类解决这一问题的有效方法之一。
[0005]在当今陆地生物资源越来越枯竭的背景下，从海洋微生物中寻找新型的药物是一条非常有前景的途径。其中2010年I月到2013年2月，就从海洋细菌、真菌、放线菌中发现895个新的具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗污损的天然活性物质(赵成英，朱统汉，朱伟明，2010-2013之海洋微生物新天然产物，有机化学，2012，32，1-41)。海洋微生物产品开发上最为成功的例子是1945年从海洋污泥中分离到顶头孢霉菌，从中发现了头孢菌素，以后发展成系列的头孢类抗菌素。而且有证据表明，原来被认为是来源于海绵等海洋生物的重要活性物质，如海豚毒素、海葵毒素、麻壳鱼毒素等，实际上也是由微生物产生，这些都使利用海洋微生物开发新型药物成为了焦点。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用。
[0007]本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042,该菌株已于2013年8月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国北京中科院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No:8101o [0008]本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042是从海洋腐木中分离、纯化得到。其分离纯化方法为:取海洋腐木样品，用无菌玻棒捣碎后加入一定量的无菌生理盐水，再加入玻璃珠在摇床上震荡20~30min(通常在20~30°C条件下进行)，静置分层后取上层液做10倍梯度稀释，取原倍液、10倍和100倍稀释液图布PDA固体平板，26~30°C恒温培养，等菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。
[0009]本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的特征为产孢子,在海水PDA培养基上生长良好，菌落初期为棕色，后期颜色逐渐变浅，呈轮纹状向外生长，菌落边缘轮廓清晰，菌落生长较慢，薄而平坦，紧贴培养基，不易挑取，有较多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊；分生孢子为球型，表面带有明显的小突起，球体直径大小约为18~22um ;孢子囊为球型，球体直径大小约为54~60um。
[0010]根据常规方法提取该菌株的DNA，利用真菌的ITS区的通用引物ITSl:5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 扩增其 ITS 区，所得ITS测序序列如下所示:[0011 ] CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAGATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGCAGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGATTTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCGCCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTTTTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACTTGATCTAAATCAGGAGTTCo
[0012]根据常规方法提取该菌株的DNA，利用通用引物5’ -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和NS4:5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’扩增真菌 18s rRNA 基因，所得 18s rRNA 测序序列如下所示:
[0013]ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCCGGCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGCTGGCTATTTAGCAGAGTAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTGGCTTTCGCTGAAATGCCGAATGGGTCAATATAAAATATAACACCATCCGATCCTTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGACAAATGCTTTCGCAGAAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACTAATGTCCCCAACTATCCCTATTCATCATTACTTTGGCTTTAGAAACCAACGAAATAAGGCCAAAGTCCTATTTCATTATTCCATGCTAATATGTTCAGGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCCAATTTTTTCAAAGTAAAAGTTCTGGTTCACCAGCCGCCACCGAAATGACGACTGGCTAACCCAGAAGGTGGAGCCCCGCCCGTTGAGGTACCGATCAATGAAGACCGAACCCCACAGGCGAAGGCCAAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGTAAAGGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCG
TTACCCGTTAAAAGCATGGTAGGCCACTAACCTACCATCGAAACTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGCATCATCGCC
GGCACAAGGCCATGCGATTCGATTAATTATTATGAATCACCATACAAGCGGTTGCCCGCGTTGGCTTTTTATCTAAT
AAGTGCACCTCTTCCAGAAGTCGAGGTTATGTACGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAA
GTGAATATCAAATAAATTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTTGTTo
[0014]综合上述形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，可以确定该菌株为Umbelopsis属真菌，分子生物学鉴定结果表明其亲缘关系与Umbelopsis isabellina最近,但是通过形态鉴定可以发现其分生孢子和产孢器形态结构和大小都与Umbelopsis isabellina有差异，可能为Umbelopsis isabellina的一个新的变种，我们将该菌株暂定为Umbelopsissp.QZ042。
[0015]本发明的第二个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物，该提取物是以上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得。其中，所述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比优选为70~80:15~20:4~8，进一步优选为75~80:15~18:5~8 ;所述的液体发酵是将海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042菌株接种到H)液体培养基中，于25~32°C条件下摇床培养5~7天或静置培养15~30天，以获得发酵培养物；在摇床培养时，转速优选为130~150r/min。
[0016]本发明的第三个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物的制备方法，包括以下步骤:
[0017]I)种子培养:挑取海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养5~7天，温度控制在26~30°C ;
[0018]2)发酵培养:将斜面培养好的真菌接种于H)液体培养基上，于25~32°C条件下摇床培养5~7天或静置培养15~30天，得到发酵培养物；
[0019]3)过滤:将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液；
[0020]4)提取:取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得到海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物。
[0021]上述方法的步骤2)中，摇床培养时，转速优选为130~150r/min ;步骤4)中，所述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比优选为70~80:15~20:4~8，浸提的温度优选为O~8°C，浸提的时间优选为3~4天。
[0022] 申请人:通过实验发现，本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在50 μ g/ml时，对大肠杆菌(E.Coli)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella peneumoniae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemoIyticus)等细菌的抑制圈直径 d 分别为 12.3mm、14.7mm、17.2mm、
13.4mm和22.5mm，表明海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物对细菌具有抗细菌活性，可以用来制备抗细菌药物。
[0023]因此，本发明的第四个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌药物中的应用。[0024]本发明的第五个目的则在于提供一种抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌的药物，该药物包含上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物作为活性成分。
[0025] 申请人:通过实验发现，本发明所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在100 μ g/ml时，对散囊菌(Eurotium rubrum)、链格孢霉(Alternaria sp.)、毛双抱霉(Lasiodiplodia pseudotheobromae)、莖溃瘍病菌(Diaporthe phaseolorum)等真菌具有明显的抑菌作用，表明海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.)QZ042培养物的菌丝体提取物对真菌具有抗真菌活性，可以用来制备抗真菌药物。
[0026]因此，本发明的第六个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌药物中的应用。
[0027]本发明的第七个目的则在于提供一种抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌的药物，该药物包含上述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042培养物的菌丝体提取物作为活性成分。
[0028]本申请中，所述的H)液体培养基的组成为:马铃薯200g、葡萄糖20g、50%人工海水1000mL ;所述的PDA固体培 养基的组成为:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、50%人工海水 1000mL。
[0029]与现有技术相比，本发明提供了一种新的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌株， 申请人:发现该菌株培养物的菌丝体提取物具有广谱的抗细菌、抗真菌活性，其活性物质和抑菌机制可能不同于已有的抗菌药物，存在新药研发的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]本发明所涉及的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042,已于2013年8月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国北京中科院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No:8101。
[0031]图1为本发明所述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042菌株在培养基上的形态，其中，A表不PDA培养基上的菌落照片，B表不在光学显微镜下的孢子照片(放大倍数10X10)，C表示电镜下的厚垣孢子，D表示电镜下的孢子囊，E表示电镜下的分生孢子梗和菌丝；
[0032]图2为本发明所述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042的ITS序列进化树；
[0033]图3为本发明所述海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的18s rRNA序列进化树。
【具体实施方式】
[0034]下面通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0035]实施例1:海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042的分离和鉴定
[0036]1.真菌的分离
[0037]用无菌三角瓶取海洋腐木样品，称取5g，采用无菌玻棒捣碎后加入50ml无菌生理盐水，加入玻璃珠在摇床上震荡20min，静置分层后取上层液做10倍梯度稀释，取原倍液、10倍和100倍稀释液图布PDA固体培养基，26~30°C恒温培养，等菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。
[0038]2.真菌的培养和形态学观察
[0039]培养特征观察:将菌种接种于PDA培养基上，26°C恒温培养获得菌落。记录初生菌丝颜色、菌落颜色变化、表面特征、有无色素产生。
[0040]制片及镜检:挑取各菌株产孢器及菌丝制成水封片，棉蓝溶液染色，进行镜下观察，记录菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构，并拍照记录。
[0041]结果:真菌在PDA培养基上生长良好，菌落初期为棕色，后期颜色逐渐变浅，呈轮纹状向外生长，菌落边缘轮廓清晰，菌落生长较慢，薄而平坦，紧贴培养基，不易挑取，有较多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊，真菌的菌落及孢子如图1所示(a表示PDA培养基上的菌落照片，b表示在光学显微镜下的孢子照片(放大倍数IOX 10)，c表示电镜下的厚垣孢子，d表示电镜下的孢子囊，e表示电镜下的分生孢子梗和菌丝)。孢囊孢子、孢子囊、菌丝的电镜图像见图1，从图1可以看出QZ042的分生孢子为球型，表面带有明显的小突起，球体直径大小约为18~22um ;孢子囊为球型,球体直径大小约为54~60um。
[0042]3.真菌总DNA的提取
[0043]将分离得到的内生真菌接种到H)液体培养基中，于26°C摇瓶培养4d。过滤收集菌丝体。菌丝体采用液氮冻融2次，灭菌玻璃棒研磨后用USA Omega Bio-Tek公司的“真菌基因组DNA小量提取试剂盒”提取真菌的基因组。
[0044]4.真菌的ITS分子鉴定
[0045]用通用引物ITSl:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ (SEQ ID NO:1)和 ITS4:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (SEQ ID NO:2)扩增真菌 rDNA 的间隔序列(含 ITSl 区、5.8S 区、ITS2 区)序列。PCR 反应条件为:94°C 变性 5min，然后 94°C，30 s—55°C，40 s—72°C, 1.0min进行35个循环扩增，最后72°C延伸lOmin。将PCR产物纯化后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司，用引物ITSl测序，所得ITS测序序列如下所示:
【权利要求】
1.一种海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042，其保藏编号为CGMCC No:8101。
2.—种海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物，其特征在于:以权利要求1所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得。
3.根据权利要求2所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.)QZ042培养物的菌丝体提取物，其特征在于:所述的液体发酵是将权利要求1所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.)QZ042菌株接种到H)液体培养基中，于25~32°C条件下摇床培养5~7天或静置培养15~30天，以获得发酵培养物。
4.根据权利要求2所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.)QZ042培养物的菌丝体提取物，其特征在于:所述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为70~80:15~20:4 ~8。
5.权利要求2所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.) QZ042培养物的菌丝体提取物的制备方法，包括以下步骤: 1)种子培养:挑取海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.)QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养5~7天，温度控制在26~30°C ; 2)发酵培养:将斜面培养好的真菌接种于H)液体培养基上，于25~32°C条件下摇床培养5~7天或静置培养15~30天，得到发酵培养物； 3)过滤:将发酵培养物过滤,分离出菌丝体和发酵液； 4)提取:取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得到海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物。
6.根据权利要求5所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.) QZ042培养物的菌丝体提取物的制备方法，其特征在于:步骤4)中，所述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为70~80:15~20:4~8。
7.权利要求2所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.) QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗大肠杆囷、腊状牙抱杆囷、烟早节杆囷、克雷伯氏杆囷或副溶血弧囷药物中的应用。
8.一种抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌的药物，其特征在于:该药物包含权利要求2所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042培养物的菌丝体提取物作为活性成分。
9.权利要求2所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsissp.) QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌药物中的应用。
10.一种抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌的药物，其特征在于:该药物包含权利要求2所述的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis sp.) QZ042培养物的菌丝体提取物作为活性成分。
【文档编号】A01P1/00GK103952322SQ201410203253
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】龚斌, 义翠花, 张艳秋, 方怀义, 庞庭才, 张虹, 董庆亮, 黄鹄 申请人:钦州学院