一种海洋弧菌褐藻胶裂合酶的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种海洋弧菌褐藻胶裂合酶的纯化方法。具体地， 本发明涉及一种从海洋弧菌QY101发酵液中纯化褐藻胶裂合酶的方法。
【背景技术】
[0002] 褐藻胶是由β-D-甘露糖酸酸（β-D-mannuronate acid, M)及其C5差向异构体 α-L-古罗糖酸酸（a- L- guluronate acid，G)通过1，4糖苷键聚合而成的一种酸性多 糖，主要存在于褐藻的细胞壁和细胞间质中。褐藻胶一般由三种片段组成：由β-D-甘露糖 醛酸构成的均聚物（polyM);由α-L-古罗糖醛酸构成的均聚物（ployG);由β-D-甘露糖 醛酸与a-L-古罗糖醛酸组成的MG随机交替片段（polyMG)。近年来，褐藻胶寡糖的生物 活性不断被发现，如抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗心血管疾病、促进植物根生长等，具有广 阔的应用前景。褐藻胶裂合酶能以β消除方式降解褐藻胶，在新产生的非还原性末端生成 C4, 5双键，该结构在230-240 nm有强烈的吸收峰。利用褐藻胶裂合酶制备褐藻胶寡糖因反 应条件温和可控、对环境友好等特点已逐渐引起人们的关注。现已从细菌、无脊椎动物中分 离到数十种褐藻胶裂合酶，但因为酶产量低、分离纯化困难，导致难以大规模应用，大大限 制了褐藻胶寡糖的应用与开发。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种从海洋弧菌QY101发酵液中纯化褐藻胶裂合酶的方法。
[0004] 本发明的褐藻胶裂合酶纯化方法时通过如下技术方案实现的：将海洋弧菌QY101 的发酵液3000-12000 r/min离心5-30 min，弃去沉淀；上清液用截留分子量为50-100 kDa 的超滤膜进行超滤，去除大分子蛋白，然后把滤出液利用截留分子量为1-10 kDa的超滤膜 浓缩2-10倍；超滤液上样于离子交换层析柱（DEAE Sepharose High Performance),按照 NaCl浓度进行梯度洗脱，检测收集物中的褐藻胶裂合酶活性。
[0005] 本发明所用的弧菌QY101发酵液可利用中国发明专利申请03112325. 2、 201210068851.0提供的方法制备。发酵液体积为0.1-1000 L。
[0006] 本发明的纯化方法可以得到纯度达到75%的褐藻胶裂合酶，回收率达到45%以上， 具有工艺简单、容易控制、纯化效果好、回收率高、成本低的优点。
【附图说明】
[0007] 图1 :纯化后的褐藻胶裂合酶的SDS-PAGE图谱。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1弧菌QY101发酵液上清的制备 将弧菌QY101发酵所得的发酵液3000-12000 r/min离心5-30 min，弃去沉淀，保留上 清液。
[0009] 实施例2超滤 上清液用截留分子量为50-100 kDa的超滤膜进行超滤，去除大分子蛋白，收集滤出液。 然后把滤出液利用截留分子量为1-10 kDa的超滤膜浓缩2-10倍，收集被超滤膜截留的液 体。浓缩液加入等体积的50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6. 5-7. 5)，再次用截留分子量为 1-10 kDa的超滤膜浓缩2-10倍，收集被超滤膜截留的液体。
[0010] 实施例3离子交换层析 以平衡缓冲液（50 mmol/L 憐酸盐，pH 6. 5-7. 5)平衡 DEAE Sepharose High Performance柱2-10个柱体积，将上步所得浓缩液上样至层析柱。用平衡缓冲液冲洗层析 柱，将未结合的蛋白去除。用洗脱缓冲液（0.4 M NaCl，50 mM的磷酸盐，pH6. 5-7. 5)洗 脱，收集洗脱液。
[0011] 经过离心、超滤、离子交换层析收集的酶液，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果表明纯 化后的样品纯度达到75%，回收率达到45. 7%。
[0012] 表1褐藻胶裂合酶纯化总结1
1按1 L发酵液计算。
【主权项】
1. 一种从海洋弧菌发酵液中纯化褐藻胶裂合酶的方法，其特征在于，该方法包括： (1) 将弧菌QY101发酵所得的发酵液离心，弃去沉淀，保留上清液； (2) 上清液用截留分子量为50-100 kDa的超滤膜进行超滤，去除大分子蛋白，收集滤出 液；然后把滤出液利用截留分子量为1-10 kDa的超滤膜浓缩2-10倍，收集被超滤膜截留的 液体；浓缩液加入等体积的50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6. 5-7. 5)，再次用截留分子量为 1-10 kDa的超滤膜浓缩2-10倍，收集被超滤膜截留的液体； (3) 以平衡缓冲液（50 mmol/L 憐酸盐，pH 6. 5-7. 5)平衡 DEAE Sepharose High Performance柱2-10个柱体积，将上步所得浓缩液上样至层析柱；用平衡缓冲液冲洗层析 柱，将未结合的蛋白去除；用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心转速为3000-12000 r/min，离心 温度为0-30 °C，离心时间为5-30 min。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的平衡缓冲液为50 mmol/L磷酸盐（pH 6. 5-7. 5)，所述的洗脱缓冲液为含有0. 4 M NaCl的50 mM的磷酸盐（pH6. 5-7. 5)。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的弧菌发酵液体积从0. 1升到1000升。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所得到的褐藻胶裂合酶纯度达到75%，回收 率达到45%以上。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种海洋弧菌褐藻胶裂合酶的纯化方法。本发明将弧菌QY101发酵液进行离心获得上清液；上清液经超滤、离子交换层析，得到纯度75%的褐藻胶裂合酶，回收率达到45%以上。本发明的纯化方法适用于中试和产业化生产褐藻胶裂合酶，有工艺简单、容易控制、纯化效果好、回收率高、成本低的优点。
【IPC分类】C12N9/88, C12R1/63
【公开号】CN105624135
【申请号】CN201410584557
【发明人】于文功, 韩峰, 路新枝
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月28日