专利名称：结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体c3相互作用及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及以结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用为基础的药物筛选模型及其用途，尤其是在结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用调控分子筛选方面的用途。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是人类重要的致病菌。据世界卫生组织估计，每年有两百万人死于结核病；每三个人中就有一个人被感染；从2000年到2020年间，将会有近十亿人新感染结核病(http://www.theglobalfund.org/en/about/tuberculosis/default.asp)。特别是近年来，随着多重耐药菌株的出现及增多和艾滋病的流行，结核病的发病率也呈急剧上升趋势。结核分枝杆菌作为一种病原菌，成功之处主要在于能在寄主体内进入休眠状态，并保持持久的活性。当寄主的免疫系统因为某些原因(如衰老，感染HIV)免疫力下降时，这些休眠期的病原菌将会被重新激活并引发明显的临床症状。
人体的补体系统由许多蛋白组成。正常状态下，补体系统的这些成分处于一种代谢平衡的状态。一定的条件下补体被激活，合成增强。补体成分经3条途径活化，而3条不同的途径均经C3成分进入溶膜途径。C3主要在人体肝脏中合成。C3结合分子在如Legionellapneumophila，Trypanosoma cruzi和Leishmania mexicana等几种胞内致病菌的表面都被鉴定，Stacey L.Mueller-Ortiz等的研究显示结核菌的细胞膜表面的heparin-bindinghemagglutinin(HbhA)与人的C3结合，且推测在M.tuberculosis和M.avium的表面不止有一个分子能和C3结合介导细菌吸附到单核细胞，而HbhA属于该分子之一。同时J.Scott Ferguson等的研究显示在人的血清中，C3通过起始经典途径或替代途径结合MTB。Geir Hetland认为MTB并不被补体裂解，而是使用补体系统作为一种进入宿主白细胞的方式。一旦进入胞内的吞噬体，结核菌就有可能逃离免疫系统的检测而存在许多年。
结核分枝杆菌在营养缺乏时进入休眠状态，在一定的条件下复苏进入感染状态。乙醛酸循环是细菌和真菌利用二碳化合物的重要途径，也是结核菌得以持续的关键之一。异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)是乙醛酸循环中的关键酶，研究该酶有助于开发新型药物的。部分胞内致病菌的表面蛋白能够与补体成分3(complement component 3，C3)相互作用。C3作为补体系统3条途径的交汇点，是进入溶膜途径的必经之路。研究结核菌的ICL和人补体系统C3的相互作用对了解其致病机理和开发新的药物提供了新途径。
蛋白质间的相互作用的特异性适合于药物筛选。例如均质二聚体(SH2)磷酸酪氨酸蛋白，分子大小与五聚物相同的肽即可解离两个亚基的作用。这样小的分子完全可以进行有机设计。蛋白与蛋白之间的亲和力高，解离速度也快，正好可以进行竞争性结合。通过体内实验、细胞分析、对化合物有选择性生长优势的细胞分析，如以酵母细胞生长依赖性为检测手段的药物筛选；以化合物对蛋白质相互作用的解离为选择性优势的反向双杂交系统。
例如对于不能合成嘧啶的营养缺陷型酵母突变体，可根据它对脲基琥珀酸的抗性将其从野生菌中挑选出来。反向筛选已经用于与蛋白相互作用无关的药物筛选。例如利用内源性G蛋白(Ste18p)对野生型酵母菌的毒性作用筛选，抑制小G蛋白如Ras法尼基化的化合物，根据对酵母菌的挽救作用，鉴定出手霉素(m anum ycin)是法尼基化的强抑制剂，它抑制K12Ras转化的纤维肉瘤的生长，也说明它有可能成为抗肿瘤药物。又如流感A病毒M2蛋白可改变H+2A TP酶建立的电化学梯度，抑制野生型酵母细胞的生长，利用此特性筛选出了抗病毒药物B I1743。
酵母双杂交系统是可用于分析大量的蛋白质间的相互作用的最有效的遗传学方法。经过双杂交系统鉴定的蛋白质相互作用还要经过生物系统测试。传统的方法包括内源性蛋白的免疫共沉淀、免疫定位、分级沉淀和一些生理技术。最直接的是解离此作用对生理作用的影响。如果一个新检测的蛋白之间的相互作用对于生物功能是重要的，解离这一关系则必然导致功能性损害。理论上讲，蛋白质相互作用可通过一配偶体的顺式突变(相当于等位基因缺陷)或由类似解离肽的小分子的作用而抑制。由于鉴定相互作用缺陷等位基因或其专一性解离分子的技术困难，至今这一遗传策略还未能广泛应用于蛋白质间相互作用的确定。相互作用缺陷的等位基因可发生难以预料的突变，使在没有明显影响蛋白质的情况下，使蛋白的相互作用瓦解。
确定蛋白质之间相互作用后，还要进一步研究其结构和功能的关系，确定蛋白质间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸，特定结构尤为重要。反向酵母双杂交系统是鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，其关键是报道基因的表达产物对细胞生长有抑制作用。这样当DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用时，表达出有毒性的报道蛋白，细胞不能生长。Uidal等建立的酵母细胞株中，其URA 3的表达由含CAL 4结合位点的启动子严密控制，此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中需GSL 4的DNA结合结构域和转录激活结构域的融合蛋白相互作用，使URA表达，其产物为合成尿嘧啶所必需，因此细胞能够存活。但此产物同时能催化5-氟乳清酸转化为5-氟尿嘧啶，所以在含5-氟乳清酸的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。根据这一原理，可以筛选出阻断蛋白质相互作用的突变体。反向酵母双杂交系统还可作为研究体内功能的遗传学方法。临床上可以筛选阻断蛋白质相互作用的小肽类药物，这也是当前及今后研究的热点之一。
反向酵母双杂交分析不需要价格昂贵的高度纯化的靶分子，对许多蛋白质可以在相对短的时间内进行分析。此外，使用的分析环境接近于生理条件，细胞的生存和死亡可以作为筛选的参数，不需要进行体外的初筛。更重要的是此分析是完全标准化的，还可以分析只有特殊情况下才可能出现的蛋白之间的相互作用。DB2X:AD2Y相互作用可以产生细胞毒性，在培养基中的具有解离蛋白的相互作用的非毒性的化合物进入细胞，使细胞得以生存。还可以用PCR的方法分析特定的作用。这一分析可与现代的高通量筛选相匹配设计，可以通过计算机和自动化工具进行样品采集。在合成的化合物库和天然产物库中筛选分析出活性分子，筛选出的化合物本身的毒性一般较弱，因为生长优势是活性测定的基础。酵母系统的不足在于药物的渗透问题。然而，经特殊的基因修饰，使酵母对很多化合物有较好的渗透性，包括亲水性化合物甚至带电离子。如广泛应用的erg6突变，它影响麦角甾醇的合成和膜功能，增加细胞对一些化合物的敏感性，如环己酰亚胺、布雷菲尔德菌素A、萘啶酮酸、氨茴霉素和放线菌素及N aL i。然而，一些erg6突变体结构复杂，有多效表型，导致低的质粒转化效率、色氨酸低速转运等，因此也提供了选择空间。如编码药物排出泵基因PDR5缺失的菌落是多药敏感性表型，FK 506拯救DB 2R IC:AD2FKBP12表达细胞可因为pdr5Δ背景而增加。其他的突变体如snq2和yo rL也增加了细胞对药物的敏感性。以细胞为基础的分析要求化合物有比较高的浓度，将细胞限制在很小的纳米粒脂囊内，可能积累较高的化合物浓度，用于反向双杂交筛选。筛选大的文库、等位基因或分子可应用抑制蛋白的相互作用所提供的遗传选择性，如反向双杂交系统。将双杂交系统反过来，以毒性标志(如U RA 3)为报告基因(反向筛选)，DB2X和AD2Y的相互作用使毒性标志基因表达，对野生型酵母菌产生毒性或致死性作用。在此情况下，解离DB2X:AD2Y作用有助于酵母菌的生长，可用于鉴定相互作用缺陷的等位基因和解离肽或小分子。U RA 3的表达产物为酵母细胞合成尿嘧啶所必需，同时可催化5-氟2乳清酸(5-FOA)转化为一毒性产物，因而在含有5-FOA的介质中DB2X:AD2Y表达的酵母菌不能生长，发生了蛋白质相互作用解离的菌株才可以因为表现出抗性而生存。使用反向双杂交系统除可用于选择相互作用缺陷型的等位基因，还可以用于鉴定抑制蛋白质相互作用的小分子。
发明内容
本发明的目的在于提供，1.一种以结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用为基础的药物筛选模型；2.基于结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的关键功能域的药物筛选模型。
本发明的技术方案如下采用本领域技术人员熟知的技术，从结核菌基因组扩增异柠檬酸裂合酶基因，扩增人补体C3基因，分别构建酵母等双杂交所需载体，在酵母等适宜的宿主表达，建立双杂交模型。以构建的模型，筛选调控双杂交信号的分子。由于酵母菌的可多变性，有可能建立一系列的功能分析用于反向筛选。如只要报告基因的启动子存在C3的结合位点，C3的功能可在酵母细胞中再建，应用一毒性标识，就可能设计出对C3特异的反向筛选系统。
实现上述目的的基本技术路线为总体技术方案是克隆包括提取结核菌基因组，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将基因组DNA克隆到合适的大肠杆菌宿主细胞。确定异柠檬酸裂合酶与补体C3之间存在相互作用。建立基于异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的反向双杂交模型。应用该模型筛选抑制异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的分子。
1.基因模板提取将待克隆菌株在LB培养基或YE培养基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝杆菌能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取菌体DNA。
2.工程菌包括反向双杂交工程菌的构建按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，将基因组DNA克隆到适当的载体，转化适当的宿主菌，通过一定的选择标记，收集获得的工程菌。
3.功能基因的筛选按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。分别根据已知的结核菌入侵人体和动物模型可能遭遇的不利环境，进行人工模拟，从基因组表达文库筛选相应的转化子，并进一步验证。
4.利用含有功能相互作用的反向双杂交重组菌，进行功能基因抑制剂或激活剂的筛选。
5.反向双杂交主要采用文献Gray PN，Busser KJ，Chappell TG.A novel approach forgenerating full-length，high coverage allele libraries for the analysis of protein interactions Mol CellProteomics，2006采用的方法。
发明效果利用本技术方案涉及的方法，得到了确定异柠檬酸裂合酶与补体C3之间存在相互作用。建立基于异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的反向双杂交模型。应用该模型筛选抑制异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的分子。
具体实施例方式
1材料与方法1.1重组质粒的构建及其鉴定从重庆市肺科医院购买的H37Rv中克隆ICL。以克隆的ICL为模板，PCR产物纯化，将其与改造后加SfiI酶切位点的质粒pDBLeu(从invitrogen公司购买)连接，构建重组质粒icl-pDBLeu作为BD载体。转化Top10，PCR和酶切鉴定后测序鉴定。
1.2正常人肝cDNA文库筛选1.2.1icl转化酵母细胞及自激活检测在YEPD培养基中过夜培养酵母菌Mav203，转接种子液使其OD600达到0.1，30℃，250rpm摇床培养5-6hr，至OD600＝0.4。5000rpm离心5min收菌，分别用无菌水和LiAc/TE/H2O(1∶1∶8)各洗涤1次后，将酵母细胞悬浮于适量的LiAc/TE中，再加入200ug的icl-pDBLeu和适量的LiAc/TE/PEG3350(1∶1∶8)混匀；30℃水浴30min；42℃热激15min；再次30℃水浴20min后收集菌体，悬浮于适量的无菌水中后涂布于SC(synthetic complete)-Leu平板，30℃培养3天后，挑取转化子做lacZ检测。同样的操作将icl-pDBLeu和pPC86即AD空载(加SfiI酶切位点改造)共同转化Mav203，并做lacZ检测。
1.2.2人肝cDNA文库的筛选及其转化效率的检测从invitrogen购买的人肝cDNA文库用于筛选与icl相互作用的蛋白。筛库的方法如1.2.1，挑取Mav203-icl-pDBLeu的菌落接种于SC-Leu中，过夜培养后转接至YEPD中，5-6hr后当其OD600达到0.4时收菌。无菌水和LiAc/TE分别洗涤后，将细胞悬浮于2.75ml的LiAc/TE中，加入250μl ssDNA(5mg/ml)和12.5μg cDNA文库质粒及15ml的PEG3350/LiAc/TE，混匀；30℃水浴30min，42℃热激15min，30℃水浴20min，收菌并悬浮于4ml的无菌水中，涂布于SD-Trp-Leu-His+25mM 3AT平板，30℃培养3天后影印清除，4天后挑取阳性克隆到25mM 3AT。另取40μl菌液倍比稀释1∶10，1∶100，1∶1000，各取100μl涂布于SD-Leu-Trp平板，30℃培养3天后，对转化子进行记数，计算转化效率。
1.3假阳性克隆的鉴定及排除将在25mM 3AT上培养2-3天后的阳性克隆进行lacZ检测，排除假阳性。将显色的阳性克隆接种到选择性培养基中30℃，250rpm培养过夜，收集菌体抽提酵母质粒。菌体用100μlSTET悬浮，加入0.2g玻璃株，涡旋震荡5min；再加入50μl STET，100℃水浴5min，冰浴2min，5000rpm，离心10min；取100μl上清，加入50μl 7.5M NH4Ac，-20℃1-2hr；12000rpm离心10min；取100μl上清加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置1-2hr；12000rpm，离心10min，弃上清；75％乙醇500μl洗涤；12000rpm，离心1min，弃上清；残留乙醇挥发，加20μl水溶解，-20℃储存。
将抽提的酵母质粒转化Top10，提取的质粒分别和BD空载及icl-pDBLeu共转Mav203，3天后挑取转化子进行lacZ检测。
1.4基因序列的测定和分析将共转验证的阳性克隆以改造后的AD为引物进行序列测定。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov对所得基因序列进行同源性比较。
1.5反向双杂交体体系的构建酵母菌株和分子操作，C3::URA3报告基因的构建；C3::URA3报告基因的整合；质粒构建等采用文献Gray PN，Busser KJ，Chappell TG.A novel approach for generating full-length，highcoverage allele libraries for the analysis of protein interactions Mol Cell Proteomics，2006采用的方法。
2结果2.1 ICL重组质粒的构建重组质粒icl-pDBLeu经PCR、酶切和测序鉴定。结果表明icl基因引入酶切位点和插入方向完全正确。
2.2人肝cDNA文库筛选2.2.1icl转化酵母细胞及自激活检测将icl-pDBLeu转化酵母细胞的转化子进行lacZ检测，Mav203-icl-pDBLeu及其重组质粒和AD共转的转化子经lacZ检测均不变蓝。说明不存在自激活效应，从invitrogen公司的购买的该酵母双杂交系统可以用于筛选与icl基因相互作用的蛋白。
2.2.2人肝cDNA文库的筛选及其转化效率的检测2次筛库的转化效率分别为8×10-5和4×10-5。
2.假阳性克隆的鉴定及排除在25mM 3AT平板上生长的阳性克隆经lacZ检测通过的共有154个克隆。将这154个阳性克隆抽提酵母质粒，共转验证后有4个阳性克隆通过。对其序列比较分析，结果显示为补体系统C3的片断。
权利要求
1.基于结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的药物筛选模型，其特征是以结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用为靶标，筛选调控该相互作用的分子。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的药物筛选模型，其特征是两个全长基因参与的相互作用。
3.权利要求1所述的结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用的药物筛选模型，其特征是两个基因的部分参与的相互作用，尤其是补体C3的备解素功能域参与的相互作用。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及以结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用为基础的药物筛选模型及其用途，尤其是在结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶与补体C3相互作用调控分子筛选方面的用途。
文档编号C12Q1/68GK1995379SQ20061009534
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者谢建平, 申严杰, 霍克克, 王洪海 申请人:西南大学