新型atp:柠檬酸裂解酶基因的制作方法

专利名称：新型atp:柠檬酸裂解酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型ATP 柠檬酸裂解酶基因。
背景技术：
脂肪酸是构成磷脂、甘油三酯等脂质的重要成分。含有2个以上不饱和键的脂肪 酸总称为多不饱和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高-Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、 二十二碳六烯酸等，具有种种生理活性(非专利文献1)。虽然期待此多不饱和脂肪酸在各 个领域的应用，但其中也包含在动物体内不能合成的多不饱和脂肪酸。因此，开发出了培养 各种微生物以获得多不饱和脂肪酸的方法。还进行了用植物生产多不饱和脂肪酸的尝试。 在这种情况下，已知多不饱和脂肪酸例如作为甘油三酯等脂质的组成成分，在微生物的菌 体内或植物种子中积累。此种在动物、植物及微生物中的新型脂肪酸合成如下进行，乙酰CoA由乙酰CoA羧 化酶(ACC)催化生成丙二酰CoA，丙二酰CoA和乙酰CoA由脂肪酸合成酶催化合成脂肪酸。 已知这些反应在动物、微生物等中的细胞质中进行，在植物中的叶绿体中进行。作为这些在细胞质中新合成的脂肪酸、胆固醇的原料的乙酰CoA通过ATP:柠檬酸 裂解酶(E. C. 2. 3. 3. 8，以下有时也记为ACL)的作用由柠檬酸供给。ACL是催化以下反应的酶。式 1柠檬酸+ATP+CoA§乙酰CoA+草酰乙酸+ADP+Pi该酶在真核生物中的动物、植物、霉菌等中广泛分布，其在细胞内定位于细胞质 (非专利文献2)。至今为止已用一些生物报道了 ACL基因。例如，在动物中，已克隆了 作为来自智人(Homo sapiens)及褐家鼠(Rattusnorvegi cus)的基因的ACL基因(非 专利文献3、非专利文献4)。在植物中，已克隆了作为来自拟南芥(模式种哥伦比亚) (Arabidopsis (ecotypeColumbia))的基因的 ACLA_l、-2、_3 和 ACLB_1、_2 (非专利文献 5)。 在丝状菌中，已克隆了作为来自大孢粪壳霉菌(Sordaria macrospora)的基因的ACLA和 ACLB基因(非专利文献6)。已报到了作为脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)(以下有时也记为 “高山被孢霉(M. alpina)”)，在细胞质组分中有ATP 柠檬酸裂解酶活性(非专利文献7)。至今为止，使用这些已知ACL基因已进行了如下尝试，使来自大孢粪壳霉菌 (Sordaria macrospora)的ACL基因与脂肪酸合成酶(FAS)同时在酵母中高表达，从而提高 宿主的总脂肪酸量(专利文献1)；或使来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的ACL基因在植 物内高表达，从而增加宿主的总脂肪酸量(非专利文献8)。专利文献1美国专利公报第2006/0051847非专利文献ILipids.，39，ppl 147 (2004)非专利文献2Adv Appl Microbiol.，51，ppl—51 (2002)
4
非专利文献3Eur J Bio Chem.，204，pp491_499 (1992)非专利文献4J Bio chem.，265，ppl430-1435 (1990)非专利文献5Plant Physiology.，130，pp740_756 (2002)非专利文献6Curr. genet.，37，ppl89_93 (2000)非专利文献7Microbiology.，146，pp2325_2331 (2000)非专利文献8Plant Physiology.，122，ppl231_1238 (2000)

发明内容
但是，从至今为止已报道的ACL基因即使导入宿主细胞使其表达，也未能确认出 其单独的效果，及能使其表达的宿主具有局限性等的观点来看，该基因还不完善。因此，希 望鉴定出与目前为止不同的可增加宿主中的总脂肪酸量或脂质量的新型基因。本发明的目的在于提供如下蛋白质及核酸，其可通过在宿主细胞中表达或导入宿 主细胞，而使脂肪酸、脂质的含量增加。本发明者为解决上述课题进行了锐意研究。首先，进行脂质生产菌高山被孢霉 (Mortierella alpina)的EST分析，从中提取与已知ACL基因的同一性高的序列。而且为 了获得编码ACL的开放阅读框(0RF)全长，通过cDNA文库的筛选或PCR克隆了基因。使其 在不存在ACL基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达后，通过测定ACL活性， 来确认所述基因的ACL活性。而且，通过导入到作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)等的宿主 细胞中并使其高表达，从而尝试使总脂肪酸量大量产生的发明者，成功地克隆了与以往量 的ACL表达的宿主相比可增加总脂肪酸量的、与新型ACL有关的基因，从而完成了本发明。 即本发明如下。(1)核酸，其包含以下(a) (e)中任一项所述的碱基序列(a)碱基序列，其编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列中1个或多个氨 基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有ATP:柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(b)碱基序列，其与由序列号9或序列号10所组成的碱基序列的互补碱基序列组 成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有ATP:柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(c)碱基序列，其由与序列号9或序列号10所组成的碱基序列有70%以上同一性 的碱基序列组成，且编码具有ATP 柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(d)碱基序列，其编码与序列号11或序列号12所组成的氨基酸序列有70%以上 同一性的氨基酸序列，且编码具有ATP:柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(e)碱基序列，其与由编码序列号11或12所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱 基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有ATP:柠檬酸裂解酶活 性的蛋白质。(2)根据(1)中所述的核酸，其包含以下(a) (c)中任一项的碱基序列(a)碱基序列，其编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列中1 10个氨 基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有ATP:柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(b)碱基序列，其与由序列号9或序列号10所组成的碱基序列的互补碱基序列组 成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有ATP 柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。
(c)碱基序列，其编码与序列号11或序列号12所组成的氨基酸序列有90%以上 同一性的氨基酸序列，且编码具有ATP:柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(3)核酸，其包含以下(a) (c)中任一项所述的碱基序列或其片段(a)碱基序列，其如序列号9或序列号10所示。(b)碱基序列，其编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(c)碱基序列，其如序列号5或序列号6所示。(4)蛋白质，其如以下(a)或(b)中任一项所述(a)蛋白质，其由序列号11或序列号12中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附 加的氨基酸序列组成，且具有ATP 柠檬酸裂解酶活性。(b)蛋白质，其由与序列号11或序列号12所组成的氨基酸序列有70%以上同一 性的氨基酸序列组成，且具有ATP 柠檬酸裂解酶活性。(5)蛋白质，其由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列组成。(6)重组载体，其含有(1) (3)中任一项所述的核酸。(7)转化体，其中导入了(1) (3)中任一项所述的核酸。(8)转化体，其通过(6)中所述的重组载体转化。(9)根据⑶中所述的转化体，其中，通过导入(6)中所述的载体，提高了脂肪酸的 生产能力。(10)根据(7) (9)中任一项所述的转化体，其特征在于，转化体为脂质生产菌。(11)根据(10)中所述的转化体，其特征在于，脂质生产菌为高山被孢霉 (Mortierella alpina)。(12)肪酸或脂质的制造方法，其特征在于，从培养(7) (11)中任一项所述的转 化体而得到的培养物中提取所述脂肪酸或脂质。(13)脂肪酸或脂质，其使用(12)中所述的制造方法获得。(14)食品，其中含有(13)中所述的脂肪酸或脂质。本发明的ACL因可使脂肪酸、脂质的生产能力得到提高，所以可提高微生物、植物 中的多不饱和脂肪酸的生产率，故而优选。因由此可提供比以往廉价且有用的脂质，所以， 作为可适用于食品、化妆料、医药品、肥皂等的成分而有用。


图。
图1-1图1表示本发明的MaACLl的cDNA序列和推定氨基酸序列。 图1-2图1表示本发明的MaACLl的cDNA序列和推定氨基酸序列。 图2-1图2表示本发明的MaACL2的cDNA序列和推定氨基酸序列。 图2-2图2表示本发明的MaACL2的cDNA序列和推定氨基酸序列。 图3-1图3表示MaACLl和MaACL2的CDS部分的DNA序列的比较图。 图3-2图3表示MaACLl和MaACL2的CDS部分的DNA序列的比较图。 图4图4表示MaACLl和MaACL2的推定氨基酸序列的比较图。 图5-1图5表示MaACLlp及MaACL2p的推定氨基酸序列与已知氨基酸序列的比较
图5-2图5表示MaACLlp及MaACL2p的推定氨基酸序列与已知氨基酸序列的比较图。图6图6表示MaACLl的Mg2+浓度依赖性的图。图7图7表示培养过程中的MaACLl转化体(MaACLl_l，-2)和未转化体 (Ctrl-U-2)的菌体内油脂含有率的经时比较图。
具体实施例方式本发明涉及来自被孢霉属的新型ATP 柠檬酸裂解酶基因，其特征在于，由ATP、柠 檬酸及CoA生成乙酰CoA、草酰乙酸、ADP及Pi。如真核生物，在细胞内由细胞器分隔开的情况下，本发明所涉及的乙酰CoA通过 丙酮酸脱氢酶、0 -氧化，主要在线粒体内生成。但是，乙酰CoA不能透过线粒体膜，而是作 为柠檬酸供给到细胞质内。由该柠檬酸通过ACL的作用供给细胞质的乙酰CoA，成为在细胞 质内新合成的脂肪酸和胆固醇等的原料。本发明的编码ATP -Mmmmmmmm本发明的ATP 柠檬酸裂解酶(ACL)中含有MaACLl及MaACL2。编码MaACLl及 MaACL2的核酸的cDNA、⑶S、0RF及氨基酸序列的对应关系在以下表1中整理记载。表 1 即作为与本发明的MaACLl相关的序列，例举了作为MaACLl的氨基酸序列的序列 号11、作为表示MaACLl的0RF区的序列的序列号9、而且还有作为表示其⑶S区的序列的序 列号7、及作为其cDNA的碱基序列的序列号5。其中，序列号7相当于序列号5的第178 3717位的碱基序列，序列号9相当于序列号5的第178 3714位的碱基序列及序列号7的 第1 3537位的碱基序列。同样，作为与MaACL2相关的序列，可例举作为MaACL2的氨基酸序列的序列号12、 作为表示MaACL2的0RF区的序列的序列号10、而且还有作为表示其CDS区的序列的序列号 8、及作为其cDNA的碱基序列的序列号6。在此，序列号8相当于序列号6的第21 3545位的碱基序列，序列号10相当于序列号6的第21 3542位的碱基序列及序列号8的第 1 3522位的碱基序列。本发明的核酸是指除了单链及双链的DNA以外，还含有其RNA互补体，可为来自天 然的核酸，也可为人工制备的核酸。DNA中，例如可例举基因组DNA、与所述基因组DNA对应 的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及这些的组合、DNA和RNA的杂交体，但不限 定于此。作为本发明的核酸的优选方式，可例举(a)由序列号9或序列号10所示的碱基序 列，(b)编码由序列号11或12所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，(c)由序列号 5或6所示的碱基序列等。由序列号9或序列号10所示的碱基序列及编码由序列号11或12所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的碱基序列、及由序列号5或6所示的碱基序列如表1中记载。为得到上述碱基序列，从具有ATP 柠檬酸裂解酶活性(以下，有时也记为ACL活 性)的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，也可搜索到编码与已知的具有ACL活性 的蛋白质同一性高的蛋白质的碱基序列。作为具有ACL活性的生物，优选脂质生产菌，作为 脂质生产菌可例举高山被孢霉(M. alpina)，但不限于此。进行EST分析时，首先构建cDNA文库。对于cDNA文库的构建方法 可参照《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold Spring HarborPress(2001))o另外，也可使用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的 cDNA文库的构建方法，例如可例举如下方法。即将作为脂质生产菌高山被孢霉(M. alpina) 的适当的菌株接种于适当的培养基中，进行适当时间的预培养。作为适合该预培养的培养 条件，例如作为培养基组成可例举1. 8%葡萄糖、酵母浸膏、pH6. 0、培养时间为3天、培 养温度为28°C的条件。而后，将预培养物在适当的条件下供给主培养。作为适合主培养的培 养基组成，例如可例举1. 8%葡萄糖、1 %大豆粉、0. 1 %橄榄油、0. 01% Adekanol (增稠剂)、 0. 3% KH2P04、0. 1% Na2S04、0. 05% CaCl2 2H20、0. 05% MgCl2 6H20、pH6. 0。作为适合主培 养的培养条件，例如可例举300rpm、lVVm、26°C下8天通气搅拌培养的条件。培养期间也可 添加适当量的葡萄糖。在主培养中适时取培养物，从中回收菌体，制备总RNA。在总RNA的 制备中，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。从所得到的总RNA中，使用市售的试剂盒， 可纯化poly (A)+RNA。而且，使用市售的试剂盒可构建cDNA文库。其后，将所构建的cDNA 文库的任意的克隆碱基序列使用设计为可确定载体上插入部分的碱基序列的引物来确定， 可得到 EST。例如，用 ZAP-cDNA Gigapacklll Gold Cloning Kit (STRATAGENE)构建 cDNA 文库时，可进行定向克隆。本发明的MaACLl及MaACL2的CDS间的碱基序列的同一性为79. 1 %。且MaACLl 和MaACL2之间的氨基酸序列同一性为87. 1 %。此外，将本发明的MaACLl的氨基酸序列 及MaACL2的氨基酸序列分别进行BLASTP分析的结果，与E-value最低的来自Ustilago maydis 521 的推定蛋白质(图 5) (UM01005. 1，GB accession No. EAK82015, gi_46096782) 的同一性MaACLl 为 61. 6%,MaACL2 为 61. 9%。本发明还包含与包含如下碱基序列的核酸具有同等功能的核酸，该碱基序列为上 述序列号9及10所示的碱基序列(有时也记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号 11及12所示的氨基酸序列(有时也记为“本发明的氨基酸序列”)组成的蛋白质的碱基序列。“具有同等功能”是指本发明的碱基序列编码的蛋白质及本发明的氨基酸序列所组成 蛋白质具有ACL活性、或具有ACL活性且与本发明的碱基序列编码的蛋白质及本发明的氨 基酸序列所组成蛋白质有同等酶活性的特性。酶活性的特性中，根据酶反应条件中的温度、 PH、盐浓度或底物浓度等变化的活性的变化、Km值、底物特异性等所有的特性均包含于其 中。本发明的ACL是催化由ATP、柠檬酸及CoA生成乙酰CoA、草酰乙酸、ADP及Pi的 反应的酶，其“ACL活性”可使用公知的方法测定。例如，可参照以下文献Plant Physiol.， 2002，130,740-56。例如，本发明的“ACL活性”也可如下测定。由使本发明的MaACLl或MaACL2表达 的酵母(不具有内源性的ACL基因)通过Plant Physiol.，2002，130，740-56中记载的方 法等制备细胞质组分。而后可通过在反应液10mM Tris-HCl(pH8. 4)、20mM MgCl2、lmM DTT、 lOmM ATP、10mM柠檬酸、0. 2mM CoA,6单位苹果酸脱氢酶、0. ImM NADH中添加上述细胞质组 分，28°C下反应适当的时间，用吸光度计测定々34(1处的变化(NADH量的减少)来对“ACL活 性”进行定量。本说明书中，“具有ACL活性”是指只要在上述检测中可确认NADH量的减少，无特 别限定，但优选具有1. Onmol mirT1 mg—1以上的活性。此外，还可确认出本发明的MaACLl (序列号11)的ACL活性具有Mg2+浓度依赖性。 具体地说，Mg2+浓度为5 10mM时活性极大，随着Mg2+浓度上升，ACL活性减少(图6)。而 且也可发现，MaACLl在ATP 柠檬酸Mg2+的比大约为1 1 1时显示最大活性。作为与本发明的核酸具有同等功能的核酸，可例举包含以下(a) (e)中任一项 所述的碱基序列的核酸。而且，在以下所举出的碱基序列的记载中，“本发明的上述活性”是 指上述的“具有ACL活性及/或与本发明的碱基序列编码的蛋白质及本发明的氨基酸序列 所组成蛋白质有同等酶活性的特性”。(a)碱基序列，其编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列中1个或多个氨 基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有本发明的活性的蛋白质本发明的核酸中所含有的碱基序列包含如下碱基序列，其编码由序列号11或序 列号12所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成， 且具有本发明的上述活性的蛋白质。具体地说，为编码由以下的氨基酸序列组成且具有本发明的上述活性的蛋白质的 碱基序列(i)序列号11或12所示的氨基酸序列中的1个或多个(优选1个或多个(例如 1 350个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、1 50个、1 30 个、1 25个、1 20个、1 15个、1 10个，进一步优选1 5个))氨基酸发生缺失的
氨基酸序列，(ii)序列号11或12所示的氨基酸序列中的1个或多个(优选1个或多个(例如 1 350个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、1 50个、1 30 个、1 25个、1 20个、1 15个、1 10个，进一步优选1 5个))氨基酸被其他氨基 酸取代的氨基酸序列，(iii)序列号11或12所示的氨基酸序列中附加1个或多个(优选1个或多个(例如1 350个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、1 10个，进一步优选1 5个))其他氨基酸的氨
基酸序列，或(iv)组合了上述⑴ (iii)的氨基酸序列。上述中，取代优选为保守性取代。保守性取代是指将特定的氨基酸残基用具有类 似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原有序列的结构有关的特征，可为 任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原有序列中存在的螺旋结构，或不破坏赋予原有序 列特征的其他种类的二级结构，可为任何取代。保守性取代一般可用生物学体系合成、化学肽合成导入，但优选通过化学肽合成 来进行。此时，取代基中可含有非天然的氨基酸残基，也可含有肽模仿物、氨基酸序列中未 被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。以下，将氨基酸残基按可取代的残基进行分类举例，但可取代的氨基酸残基不限 于以下记载的残基A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨 酸、0-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸及环己基丙氨酸B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸C组天冬酰胺及谷氨酰胺D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4- 二氨基丁酸及2，3_ 二氨基丙酸E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸F组丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸G组苯丙氨酸及酪氨酸为非保守性取代时，上述种类中的某一种成分可与其他种类的成分互换，此时， 为保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数) (Kyte 等，J. Mol.Biol.，157 105-131 (1982))。此外，为非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩写以IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature、或例如 Immunology—A Synthesis (第 2 版，E. S. Golub 及 D. R. GrenHSjf ,Sinauer Associates, Sunderland,Massachusetts (1991)) 中i己i的*令页 域惯用的缩写为依据。此外，氨基酸有光学异构体时，在无特别说明的情况下，均表示L体。D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、a，a - 二取代氨基酸等的非天然氨基酸、 N-烷基氨基酸、乳酸及其他非惯用氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。且本说明书中使用的蛋白质的标记法，根据标准用法及本领域中常用的标记法， 左方向为氨基末端方向，右方向为羧基末端方向。同样，在一般情况下不特别提及时，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷 酸序列的左方向为5’方向。只要是本领域技术人员，使用本领域中公知的技术，即可设计、制备本说明书中所 述的蛋白质的适当的突变体。例如，通过将对本发明蛋白质的生物学活性并不太重要的区 域作为靶区，可鉴定出不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而使其结构改变的蛋白质分子 中适当的区域。且也可鉴定出在类似的蛋白质间保守的分子的残基及区域。并且，在认为对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏其生物学活性且不给予蛋白 质的多肽结构以不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。例如，本发明的MaACLl及MaACL2与来自担子菌玉蜀黍黑粉菌(U. maydis)
的类似ACL的推定蛋白质(gi_46096782)有约62 %的氨基酸序列同一性，与来
自小鼠(gi_29293809)、人(gi_38569421)、黑腹果蝇(gi28372804)、线虫
(gi_17551266)等动物的ACL或类似ACL的推定蛋白质序列也有一定的同一性(图5)。
作为可发生突变的氨基酸残基的例子，可将图5所示的7个序列的全部中除了保守残基以 外的残基判断为可发生突变的氨基酸残基，或可将该7个序列中至少为4、5或6的序列中 除了保守残基以外的残基判断为可发生突变的氨基酸残基。或在图5中用下划线、虚线的下划线、及双下划线表示的3个下划线部为ATP 柠 檬酸裂解酶/琥珀酰_CoA裂解酶中特别重要的位点(从N末端开始按顺序为PR0SITE的 PS01216，PS00399，PS01217)。即本发明的突变体中，只要上述位点为保守，则可为任何突变 体。因此，作为可发生突变的氨基酸残基的其他例子，可将除了图5中所示的3个用下划线 表示的氨基酸残基以外的残基判断为发生突变的氨基酸残基。且本发明的MaACLl及MaACL2的相互之间具有87. 1 %的氨基酸同一性(图4)。作 为可发生突变的氨基酸残基的其他例子，可将在MaACLl及MaACL2之间的非保守残基判断 为可发生突变的氨基酸残基。只要是本领域技术人员，均可鉴定对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要、与 该蛋白质的肽类似的肽的残基，比较此2种肽的氨基酸残基，既可预测出与本发明蛋白质 类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基， 可进行所谓的结构_功能研究。并且，通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似 的氨基酸取代，可选出保持了本发明蛋白质的生物学活性的突变体。此外，只要是本领域 技术人员，即可对本蛋白质突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。进而从所得到的分 析结果来看，也可预测与蛋白质的三维结构有关的氨基酸残基的比对。预测为蛋白质表面 上存在的氨基酸残基有参与和其它分子的重要的相互作用的可能性，只要是本领域技术人 员，即可基于上述分析结果，制备出不使预测为在此种蛋白质表面上存在的氨基酸残基发 生改变的突变体。并且只要是本领域技术人员，即可制备构成本发明蛋白质的各个氨基酸 残基中，只有一个氨基酸残基发生取代的突变体。通过公知的检测方法筛选此种突变体，即 可收集各个突变体的信息。由此，通过对某种特定的氨基酸残基发生取代的突变体的生物 学活性与本发明蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现此种生物学活性时、或产生抑制 本蛋白质生物学活性的不适当活性时进行比较，即可评价构成本发明蛋白质的种种氨基酸 残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，可根据此种从日常实验中收集的信息，单独 或与其他突变组合，从而容易地分析作为本发明蛋白质的突变体的不期望的氨基酸取代。如上所述，由序列号11或12所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺 失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，可通过《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed. )) (Cold Spring Harbor Press (2001)) > ((CurrentProtocolsin Molecular Biology)) (John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988)Method. Enzymol. 85 2763-6 等中所述的定点诱变法制备。发生了 此种氨基酸的缺失、取代或附加等突变的突变体的制备，例如可通过Kunkel法、Gappedduplex法等公知手法，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒、例如QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 公司 制、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen 公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、Mutan-Super ExpressKm 等TAKARA BIO 公司制)等进行。且作为在蛋白质的氨基酸序列中，既保持了其活性同时又引入1个或多个氨基酸 的缺失、取代或附加的方法，除上述定点诱变以外，可例举为用诱变剂处理基因的方法；及 使基因选择性断裂，将所选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。本发明的核酸中所包含的碱基序列，优选为编码由序列号11或12所示的氨基酸 序列中1 10个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有ACL活性的蛋 白质的碱基序列。本发明蛋白质中的氨基酸突变或修饰的数量、或突变或修饰的位点，只要保持ACL 活性、或与本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质保持同 等的酶活性的特性，无限制。(b)碱基序列，其与由序列号9或序列号10所组成的碱基序列的互补碱基序列组 成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中所含有的碱基序列，包含与由序列号9或序列号10所组成的碱基 序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白 质的碱基序列。序列号9或序列号10及本发明的上述活性如上所述。上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法制备适当的探针，使用此探针通过 菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库 等中获得。对于杂交法的详细步骤,可参照《Molecular Cloning, A LaboratoryManual 3rd ed. )) (Cold Spring Harbor Press (2001)，特别是 Section 6-7)、〈〈Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons (1987-1997)，特别是 Section6. 3-6. 4)、 〈〈DNA Cloning 1 :Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed. )) (Oxford University (1995)，杂交条件特别可参照 Section2. 10)。杂交条件的强度，主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件决定。在本说明 书中“严谨条件”包括中度或高度严谨条件。具体来说，作为中度严谨条件，例如杂交条件可例举1XSSC 6XSSC、42°C 55°C的条件，更优选1 X SSC 3 X SSC、45°C 50°C的条件，最优选2 X SSC、50°C的条件。杂 交溶液中例如含有约50%甲酰胺时，采用比上述温度低5至15°C的温度。作为洗涤条件， 可例举0. 5XSSC 6XSSC、40°C 60°C。在杂交及洗涤时，通常可加入0. 05% 0. 2%、 优选约0. 1% SDS0作为高度严谨(高严谨)的条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐 浓度下的杂交及/或洗涤。例如杂交条件可例举0. 1XSSC 2XSSC、55°C 65°C的条件， 更优选0. 1XSSC 1父55(、601 651的条件，最优选0.2\55(、631的条件。作为洗涤 条件，可例举 0. 2XSSC 2XSSC、50°C 68°C，更优选 0. 2XSSC、60 65°C。特别是作为用于本发明的杂交条件，例如可例举在5XSSC、1 % SDS、50mMTris-HCl(pH 7. 5)及50%甲酰胺中42°C的条件下进行预杂交后，添加探针，在42°C保 温过夜形成杂交体，然后在0. 2XSSC、0. SDS中65°C下进行3次20分钟的洗涤的条件， 但并不限于此条件。此外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体地说，可例举 为使用 DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics 公司)、ECL directlabeling & detection system (Amersham公司制)进行的杂交等。作为本发明中包含的碱基序列，优选与由序列号9或序列号10所组成的碱基序列 的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有ACL活性的蛋白质 的碱基序列。(c)碱基序列，其由与序列号9或序列号10所组成的碱基序列有70%以上同一性 的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中所含有的碱基序列，包含由与序列号9或序列号10所组成的碱基 序列有70%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序 列。可优选与序列号9或10所示的核酸序列有至少75%以上、进一步优选80%、更进 一步优选85% (例如90%、95%、进一步为98%或99%)同一性的碱基序列的核酸，且为编 码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。如上所述，MaACLl(序列号9)及MaACL2(序 列号10)的同一性为79. 1%。本发明的核酸中包含与序列号9或10所示的核酸序列有至 少80%以上同一性、与两者类似的核酸。2个核酸序列的同一性％可通过视觉检查、数学计算来确定，但优选使用计算机 程序通过比较2组核酸的序列信息来确定。作为序列比较计算机程序，例如可例举可以 在美国国立医学图书馆的网站:http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html 上利用的 BLASTN 程序(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 403-10) :2. 2. 7 版或 WU-BLAST2. 0算法等。关于WU-BLAST2. 0的标准默认参数的设定，可使用以下网站http:// blast, wustl. edu中所记载的内容。(d)碱基序列，其编码与由序列号11或序列号12组成的氨基酸序列有70%以上 同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。本发明的核酸中所含有的碱基序列中，包含编码与由序列号11或序列号12组成 的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的 碱基序列。本发明的核酸编码的蛋白质只要与具有本发明的上述活性的蛋白质有同等功 能，也可以是与MaACLl或MaACL2的氨基酸序列有同一性的蛋白质。具体地说，可例举与序列号11或序列号12所示的氨基酸序列有75%以上、优选 85%以上、更优选88% (例如90%、95%、98%、进一步为99%)以上的同一性的氨基酸序 列等。如上所述，MaACLl (序列号11)和MaACL2(序列号12)之间的氨基酸序列的同一性 为87. 1%。本发明的核酸编码的蛋白质包含与序列号11或12所示的氨基酸序列有至少 88%以上同一性，与两者类似的蛋白质。本发明的核酸中所含有的碱基序列，优选为编码与由序列号11或序列号12组成 的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的 碱基序列。进一步优选为编码与由序列号11或序列号12组成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。2个氨基酸序列的同一性的百分率可通过视觉检查、数学计算确定。此外，也可使 用计算机程序来确定同一性百分率。此种计算机程序例如可例举为BLAST、FASTA(Altschul 等、J. Mol. Biol.，215 403-410 (1990))、及 ClustalW 等。特别是 BLAST 程序的同一性搜索 的各种条件(参数)已在 Altschul 等(Nucl. Acids. Res. ,25, p. 3389-3402，1997)中做了 记载，所以，可从美国生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站上公开获得 (BLAST 指南、Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda,MD20894 ；Altschul 等)。且可使用遗传 信息处理软件 GENETYX Ver. 7 (GENETYX) .DINASIS Pro (日立软件)、Vector NTI (Infomax) 等的程序来确定。使多个氨基酸序列并列的特定的比对图也可显示序列中特定的短的区域的匹配， 所以，即使使用的序列的全长序列间无显著相关时，也可在此种区域中检测出特定的序列 同一性非常高的区域。且BLAST算法可使用BL0SUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数可 使用如下所示的内容(A)包括用于将具有低组成复杂度的查询序列的片段[由Wootton 及 Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)确定；也希望参照 Wootton 及 Federhen, 1996《序列数据库中组成偏向性区域的分析》(Analysis ofcompositionally biased regions in sequence databases)MethodsEnzymol. 266 :544_71]、或由失iijH期j"生白勺 内部重复组成的片段[由 Claverie 及 States (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程 序确定)]屏蔽的过滤，及(B)根据用于报告对数据库序列的一致性的统计学上的显著性阈 值、或根据E-SCOre(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅偶然发现为一致的期望概 率；源于某种一致的统计学的显著差异比E-score阈值大时，不报告此一致。(e)碱基序列，其与由编码序列号11或12所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱 基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋 白质。本发明的核酸中所含有的碱基序列，包含与由编码序列号11或12所示的氨基酸 序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具 有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。由序列号11或12所示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交条件如上所述。且本发明的核酸中还包含如下核酸，其包含由序列号9或序列号10所组成的碱基 序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或附加的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述 活性的蛋白质的碱基序列。具体地说，也可使用包含如下碱基序列，且编码具有本发明的上 述活性的蛋白质的碱基序列的核酸(i)序列号9或10所示的碱基序列中1个或多个(优选1个或多个(例如1 1050个、1 750个、1 700个、1 650个、1 600个、1 550个、1 500个、1 450 个、1 400个、1 350个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、 1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、1 10个，进一步优选1 5个))
的碱基发生缺失的碱基序列，(ii)序列号9或10所示的碱基序列中1个或多个(优选1个或多个(例如1 1050个、1 750个、1 700个、1 650个、1 600个、1 550个、1 500个、1 450 个、1 400个、1 350个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、1 10个，进一步优选1 5个))
的碱基被其他碱基取代的碱基序列，(iii)序列号9或10所示的碱基序列中附加1个或多个(优选1个或多个(例 如1 1050个、1 750个、1 700个、1 650个、1 600个、1 550个、1 500个、 1 450个、1 400个、1 350个、1 300个、1 250个、1 200个、1 150个、1 100个、1 50个、1 30个、1 25个、1 20个、1 15个、1 10个，进一步优选1
5个))其他碱基的碱基序列，或(iv)组合了上述⑴ (iii)的碱基序列。作为本发明的核酸的优选方式，也包括含有以下(a) (c)中任一项所述的碱基 序列的片段的核酸(a)序列号9或序列号10所示的碱基序列，(b)编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，(c)序列号5或序列号6所示的碱基序列。对于(a)序列号9或序列号10所示的碱基序列、(b)编码由序列号11或12所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号5或6所示的碱基序列，如表1中所记 载。上述序列的片段包含上述碱基序列中含有的0RF、CDS、具有生物学活性的区域、作为如 下记载的引物使用的区域、可作为探针的区域，可来自天然，也可由人工制作。本发明的ATP 柠檬酸裂解酶蛋白质本发明的蛋白质，包含由序列号11或12所示的氨基酸序列组成的蛋白质及与所 述蛋白质具有同等功能的蛋白质，可来自天然，也可人工制备。对于由序列号11或12所示 的氨基酸序列组成的蛋白质，如上所述。“具有同等功能的蛋白质”，指如上述“编码本发明 的ATP 柠檬酸裂解酶的核酸”的项目中说明的具有“本发明的上述活性”的蛋白质。在本发明中，作为与由序列号11或12表示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等 功能的蛋白质，可例举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质(a)蛋白质，其由序列号11或12中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的 氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性，(b)蛋白质，其是由与序列号11或12组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨 基酸序列组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性。上述内容中，对于序列号11或12中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨 基酸序列、或与由序列号11或12组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列，如上 述“编码本发明的ATP 柠檬酸裂解酶的核酸”的项目中的说明。且上述“具有本发明的上 述活性的蛋白质”，还包括由包含序列号9或10的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、 或序列号11或12所示的氨基酸序列中通过1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等的 多种修饰而产生突变的蛋白质、或氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合 的蛋白质，且是具有ACL活性的蛋白质。另外，本发明的蛋白质也可人工制备，此时可通过Fmoc法(9_芴甲氧羰基法)、 tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。也可利用Advanced ChemTech公司制、珀 金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia 公司制、ProteinTechnology Instruments 公 司制、Synthecell-Vega公司制、PerS印tive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。ACL的核酸的克降本发明的ACL的核酸，例如可通过使用适合的探针从cDNA文库中筛选来进行克 隆。且可使用适合的引物通过PCR反应扩增，通过与适合的载体连接来进行克隆。并且也 可亚克隆到其他载体中。例如也可使用 pBlue_Script SK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp (TM Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2. 1-T0P0 (Invitrogene)等市售的质粒载体。且用 PCR反应扩增时，引物也可使用上述序列号5或6等所示的碱基序列的任何部分。且使上 述引物及碱基序列聚合酶等与由高山被孢霉(Malpina)菌体制备的cDNA作用而进行PCR 反应。上述方法根据《Molecular Cloning,A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold Spring HarborPress(2001))等，只要是本领域技术人员均可容易地进行，作为本发明的PCR反应 条件，例如可例举为以下条件变性温度90 95 °C退火温度40 60°C延伸温度60 75 °C循环数10次以上所得到的PCR产物的纯化可使用公知的方法。例如使用GENECLEAN(Funakoshi)、 QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP_IT(GE Healthcare Bio-Sciences)等 试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时， 可进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶切出，通过GENECLEAMFimakoshi)、 QIAquick Gel extraction Kits (QIAGEN)、Freeze&Squeeze 法等纯化。克隆后的核酸的碱基序列可使用碱基序列测序仪来确定。ACL表达用载体构建及转化体的制备本发明还提供含有编码本发明的MaACLl及MaACL2的核酸的重组载体。本发明还 进一步提供由上述重组载体转化的转化体。此种重组载体及转化体可如下获得。即将具有编码本发明的ACL的核酸的质粒用 限制性内切酶酶切。且也可通过T4聚合酶处理将末端平滑化。将酶切后的DNA片段通过 琼脂糖凝胶电泳纯化。通过将此DNA片段使用公知的方法整合进表达用载体，可得到ACL 表达用载体。将此表达载体导入宿主制备转化体，用于目的蛋白质的表达。此时，表达载体及宿主只要可表达目的蛋白质，无特别限定，例如宿主可例举 真菌、细菌、植物、动物或它们的细胞等。作为真菌，可例举为脂质生产菌高山被孢霉 (M. alpina)等的丝状菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母等。且作为细菌， 可例举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。且作为植 物可例举菜籽、大豆、棉花、红花、亚麻等的油料作物。作为脂质生产菌，例如可使用MYC0TAX0N, VolXLIV, No. 2，pp. 257-265(1992)中 记载的菌株，具体地说，可例举为属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如长孢被 孢霉(Mortierella elongata) IF08570、微小被孢霉(Mortierella exigua) IF08571、 Mortierella hygrophila IF0594U 冑 Lij ■ ffi # (Mortierella alpina) IF08568> ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219. 35、CBS224. 37、CBS250. 53、CBS343. 66、CBS527. 72、CBS528. 72、CBS529. 72、CBS608. 70、CBS754. 68 等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物，或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS194. 28、IF06336、 IF07824、IF07873、IF07874、IF08286、IF08308、IF07884、Mortierella nanaIF08190、拉曼 被孢霉(Mortierella ramanniana) IF05426、IF08186、CBS112. 08、CBS212. 72、IF07825、 IF08184、IF08185、IF08287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236. 82 等的属于 Micromucor亚属(subgenusMicromucor)的微生物等。尤其优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。以真菌类为宿主使用时，本发明的核酸优选在宿主中可自主复制、或者是可插入 该菌染色体上的结构。与此同时，优选是含有启动子、终止子的构成。使用高山被孢霉 (M. alpina)为宿主时，作为表达载体，例如可例举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只 要可在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonM. 1基因启动子、GAPDH(3-磷 酸甘油醛脱氢酶)基因启动子、TEF翻译延伸因子(Translation elongation factor)基 因启动子等的来自高山被孢霉(M. alpina)的启动子。作为向高山被孢霉(M. alpina)等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可例举为 电穿孔法、原生质球法、基因枪轰击法及向核内的DNA直接显微注射法等。使用营养缺陷型 的宿主株时，通过选择在缺少其营养素的选择培养基上生长繁殖的菌株，可获得转化株。此 外，使用抗药性标记基因进行转化时，在包含其药剂的选择培养基上培养，可得到具有抗药 性的细胞菌落。以酵母为宿主使用时，作为表达载体，例如可例举pYE22m等。且也可使用 pYES(Invitrogen), pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。另外，作为适用于本发 明的宿主，可例举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeEH13_15 株)(trpl, MAT a )等，但 不限于此。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gall启动子、gallO启动子等来自酵母 等的启动子。向酵母内导入重组载体的方法，例如可例举醋酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡 聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸 (单数或多数)的包裹、及向核内直接显微注射DNA等。以大肠杆菌等的细菌为宿主使用时，作为表达载体，例如可例举Pharmacia公司 的pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、冊启动子 等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿 孔法、氯化钙法。本发明的脂肪酸或脂质的制造方法本发明提供由上述转化体制造脂肪酸或脂质的方法。即由培养上述转化体而获 得的培养物制造脂肪酸或脂质的方法。具体可用以下方法制造。但是，对于本制造方法来 说，并不限于该方法，也可采用通常公知的其他方法进行。用于培养使ACL表达的生物的培养基只要是具有适当的pH及渗透压，含有各宿主 增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任何 培养液。例如，转化高山被孢霉(M. alpina)以使ACL表达时，可使用以下所记的组成的培 养基等，但不限定于此。
0179](1)1.8%葡萄糖、1%大豆粉、0.1%橄榄油、0.01%4(^1 11101(增稠剂)、0.3%KH2P04、0. 1% Na2S04、0. 05% CaCl2 2H20、0. 05% MgCl2 6H20、pH6. 0)(2)GY培养基(2.0%葡萄糖、1.0%酵母浸膏)培养条件只要是适合宿主增殖、且适于生成的酶保持稳定的条件，可以为任意的 条件，具体可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方 法可以为同一条件下的培养(一级培养)，也可以为使用2个以上不同的培养条件即二级培 养或三级培养，进行大量培养时，优选培养效率良好的二级培养等。以下，作为本发明的脂肪酸的具体制造方法，以使用高山被孢霉(M. alpina)作为 宿主进行培养为例进行说明。即将导入了本发明的MaACLl或MaACL2的转化株接种于GY 培养基上，28°C下开始振荡培养。而且，在培养过程中的第3天，将20%葡萄糖溶液以培养 液的20分之1的量添加，进行共计8天以上的振荡培养。本发明的脂肪酸或脂质可用以下方法提取。但是，关于本制造方法并不限于该方 法，也可使用通常的公知的其他方法。具体地说，可根据本发明从转化的菌体中如下提取。 有关生物(例如脂质生产菌或酵母)的转化株，培养终止后，根据离心分离法、过滤等的通 常方法得到培养菌体。充分水洗菌体，优选干燥。干燥可通过冷冻干燥、风干等进行。将干 燥菌体根据需要通过珠磨机、超声波等破碎后，优选在氮气流下通过有机溶剂提取処理。作 为有机溶剂可使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，或也可使用甲醇及石油 醚的交替提取或氯仿_甲醇-水的单相系溶剂的提取，均可获得良好的结果。通过在减压 下从提取物中蒸馏除去有机溶剂，可得到含有脂肪酸的脂质。而且，从含有上述脂肪酸的脂质中分离脂肪酸，可在混合脂肪酸或混合脂肪酸酯 的状态下，通过进行通常方法(例如、尿素附加法、冷却分离法、柱色谱法等)的浓缩分离来 进行。根据本发明的脂质或脂肪酸的制造方法，通过使菌体的脂肪酸含有率增加，从而 可高效地生产脂肪酸。作为本发明的脂肪酸的制造方法的一例，实际作为宿主使用高山被孢霉 (M. alpina)，制备导入了本发明的MaACLl或MaACL2的转化株，实际提取脂肪酸时，与未转 化ACL的对照株相比，菌体的脂肪酸含有率提高了约1. 1倍。本发明的脂肪酸或脂质本发明还提供在本发明的MaACLl或MaACL2表达的细胞中的脂肪酸及脂质。脂肪 酸可为游离脂肪酸，也可为甘油三酯、磷脂等。本说明书中，“脂肪酸”是指用通式R00H(R为烷基)表示的长链烃的链状或分 支状的单羧酸。例如可例举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14 0)、肉豆蔻烯 酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14 1)、棕榈酸(十六烷酸)(16 0)、棕榈油酸 (9-十六碳烯酸)(16 1)、硬脂酸(十八烷酸)(18 0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸) (18 1(9))、异油酸(11-十八碳烯酸)(18 1(11))、亚油酸(顺式，顺式_9，12十八碳二 烯酸)(18 2(9，12))、a-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18 3 (9，12，15))、Y -亚 麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18 3(6，9，12))、亚麻油酸(516&1^(1011化 acid) (6，9，12， 15-十八碳四烯酸)(18 4 (6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20 0)、8，11_ 二十碳二 烯酸(20 2(8，11))、Mead 酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20 3 (5，8，11))、二高 Y -亚 麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20 3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14_ 二十碳四烯酸)(20 4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(5，11，14，17-二十碳四烯酸)(20 4(5，11， 14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20 5 (5，8，11，14，17))、山嵛酸 (二十二烷酸)(22 0)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22 4 (7，10，13，16))、4，7，13，16， 19-二十二碳五烯酸(22 5 (4，7，13，16，19))、4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22 5(4， 7，10，13，16))、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22 6(4,7,10，13，16，19))、木质素酸 (二十四烷酸)(24 0)、神经酸(顺式-15-二十四碳单烯酸)(24 1)、蜡酸(二十六烷 酸)(26 0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义 的通用名称，括号内记载了系统名称以及表示碳原子数量和双键位置的数值。本说明书中，“脂质”是指含有脂肪酸和醇形成酯键的化合物(例如甘油酯)或其 类似物(例如胆固醇酯)等的单纯脂质、单纯脂质的一部分进一步与磷酸、氨基酸、糖等结 合形成的复合脂质、及上述脂质的水解物中不溶于水的衍生脂质。本发明的脂肪酸组合物只要是上述脂肪酸中的1种或1种以上的脂肪酸的组合， 可以是由任意数量、任意种类的脂肪酸形成的组合物。含有本发明的脂肪酸或脂质的食品等此外，本发明提供含有上述脂肪酸或脂质的食品。本发明的脂肪酸或脂质，根据通 常方法，例如可用于含有油脂的食品、工业原料(化妆料、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等 的原料)的制造等用途中。作为化妆料(组合物)或医药(组合物)的剂型，可例举溶液 状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态， 可例举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料 等中配合了本发明的脂肪酸或脂质的自然流食、半消化状态营养食品以及成分营养食品、 保健饮料、经肠营养剂等加工形态。进而，作为本发明的食品例，可例举营养补充食品、保健食品、功能性食品、幼儿用 食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，但不限于这些。在本说明书中，食品 是固体、流体及液体以及这些的混合物且可摄取食用的食物的总称。营养补充食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指用于保健的或对健 康有益的食品，包括营养补充食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充可发 挥机体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用途的食品含义相同。幼儿用食品是指供 给约6岁以下儿童的食品。老人用食品是指与未加处理的食品相比，处理成易消化及吸收 的食品。婴儿用配方乳是指供给约1岁以下儿童的配方乳。早产儿用配方乳是指供给早产 儿出生后到约6个月为止所用的配方乳。作为这些食品，可例举肉、鱼、果仁等天然食品(用油脂处理过的食品)冲华料 理、拉面、汤等制作时加入油脂的食品；天麸罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、炸面圈、油炸糖 点心等用油脂作热介质的食品；黄油、人造黄油、沙拉酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼 干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工时加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆 沙面包等加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于含油脂的 食品，例如可例举面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、 豆腐及其加工品等农产食品；清酒、药用酒、甜料酒、食用醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、 火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、 运动饮料、酒精饮料、茶等。
wmm^mnm acl的核酸或acl蛋白质的菌株的i平价 诜择方法本发明还提供使用编码本发明的ACL的核酸或ACL蛋白质来进行脂质生产菌的评 价、选择的方法。具体如下所示(1)评价方法作为本发明的一个实施方式，可例举使用编码本发明的ACL的核酸或ACL蛋白质， 进行脂质生产菌评价的方法。作为本发明的上述评价方法，首先可例举使用基于本发明的 碱基序列设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评 价的方法。此种评价方法的通常方法为公知，例如在国际专利申请指南W001/040514号、日 本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简要说明。首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等任何公知 的方法(例如参照 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring HarborLaboratory Press, pl30(1990))。基于本发明的碱基序列、优选基于序列号9或10设计引物或探针。上述引物或探 针可使用本发明碱基序列的任意部分，且其设计可使用公知方法进行。作为引物使用的多 核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15 25个碱基。此外，夹在两引物间的碱 基数通常以300 2000碱基为宜。使用上述制备的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在本发明碱基 序列的特异性序列。本发明碱基序列的特异性序列的检测可采用公知方法进行。例如，将 含有本发明碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的 互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有该序列的上游或下游序 列的一部分或全部的多核苷酸、或含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，例如通 过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可测定扩增产物的有无、扩增产物分子量的大小等。适合本发明方法的PCR法的反应条件无特别限定，例如可例举以下条件，变性温度90 95 °C退火温度40 60°C延伸温度60 75 °C循环数10次以上等条件。将得到的反应生成物DNA片段通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分 离，可测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是含有相当于本发明 碱基序列的特异性区域的核酸分子的大小，可预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。 而且通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，还可进一步更正确地预测或评价本 发明的上述活性。另外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号9或10等本发明的 碱基序列编码的ACL的表达量，可评价被测菌株的本发明的上述活性。且ACL的表达量， 可通过在适当条件下培养被测菌株，对ACL的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质 的定量，可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR 进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。此外，作为上述活性的评价方法，也可例举测 定本发明ACL产生的脂肪酸组合物的组成的方法。脂肪酸组合物的组成的测定方法如上所述。⑵选择方法作为本发明的其他实施方式，可例举使用编码本发明的ACL的核酸或ACL蛋白质 进行脂质生产菌选择的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列 号9或10等本发明的碱基序列编码的ACL的表达量，选择目的表达量的菌株，可选择出具 有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各 菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可选择出所期望的菌株。具体地 说，例如可在适当的条件下培养标准菌株和被测菌株，测定各菌株的表达量，通过选择与标 准菌株相比被测菌株为高表达或低表达的被测菌株，来选择具有期望活性的菌株。对于所 期望的活性，如上所述，可例举测定ACL的表达量及ACL产生的总脂肪酸量的方法。且作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或 低的菌株，也可选择出具有期望活性的被测菌株。对于所期望的活性，如上所述，可例举测 定ACL的表达量及ACL产生的总脂肪酸量的方法。作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发 明的核酸表达受到抑制的菌株、进行了诱变处理的菌株、自发突变的菌株等，但并不限于 此。且本发明的ACL活性例如可通过本说明书中的“编码本发明的ATP 柠檬酸裂解酶的核 酸”项目中记载的方法进行测定。诱变处理例如可例举紫外线照射、放射线照射等的物理方 法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等(如参照大嶋 泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、P67-75、学会出版中心等)(大嶋泰 治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版力 >々一)。但不限 于此。此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可例举上述脂质生产菌或酵 母等，但并不限于此。具体地说，标准菌株、被测菌株可将属于不同属、种的任意菌株组合使 用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。实施例以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。实施例1(1) EST 分析将高山被孢霉(M. alpina) 1S_4株接种到100ml的培养基(1. 8%葡萄糖、酵母 浸膏、PH6.0)冲，在28°C下预培养3天。在10L培养槽(Able Co.，东京)中加入5L培养 基(1. 8%葡萄糖、大豆粉、0. 橄榄油、0. 01% Adekanol (增稠剂)、0. 3%KH2P04,0. 1% Na2S04、0. 05 % CaCl2 2H20、0. 05 % MgCl2 6H20、pH6. 0)，接种全部预培养物，在 300rpm、 lvvm、26°C的条件下通气搅拌培养8天。在培养的第1、2及3天分别添加相当于2%、2%及 1. 5%的葡萄糖。在培养的第1、2、3、6及8天的各阶段回收菌体，用盐酸胍/氯化铯法制备 总 RNA。使用 01igotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio)，从总 RNA 中纯 化 poly(A)+RNA。使用 ZAP-cDNA Gigapacklll Gold Cloning Kit (STRATAGENE)构建各阶 段的cDNA文库，进行从cDNA的5，端开始的一步法测序分析(8000克隆X5步)。将得到 的序列进行聚类，其结果，得到约5000的序列。(2)ATP 柠檬酸裂解酶基因同源基因的搜索
将通过EST分析得到的碱基序列相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列使用同源 性搜索程序BLASTX进行搜索，提取出ATP 柠檬酸裂解酶基因的同源基因。其结果，发现了 序列号1、序列号2、序列号3、序列号4的4个ACL同源基因序列。序列号1和3有同源性，与 来自粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)的类似ATP 柠檬酸裂解酶亚基1的推定蛋白质的相 同区域匹配，且序列号2和4也具有同源性，与来自大孢粪壳霉菌(Sordaria macrospora) 的类似ATP 柠檬酸裂解酶亚基1的推定蛋白质的相同区域匹配。即可认为本菌株有至少2 个以上的ATP 柠檬酸裂解酶同源基因。将构成各序列的克隆数与得到该克隆数的文库的 关系表示于表2。表2 实施例2(l)ACL同源基因的克降因序列号1 4的任一个中均不存在认为是编码ACL的⑶S，所以，为克隆编码这 些基因全长的cDNA，根据各个序列，如下制备引物。根据序列号2设计引物引物 422-1 :GATACCGTCGTCAACTTTGCCTC(序列号 18)引物 422-2 CATCTTGCAGTTGGGGTCCCGCT (序列号 19)根据序列号4设计引物引物 424-1 GTTGACACCGTGGTGAACTTTGCC (序列号 20)引物 424-2 :GCATCTTGCACCCGGATCCTTCTC (序列号 21)使用这些引物，以包含构成各个序列号2及4的EST的cDNA文库为模板， 使用ExTaq (TaKaRa Bio)进行PCR反应。将所得到的DNA片段使用T0P0_TAcloning Kit(INVITR0GEN CORPORATION)进行TA-克隆，确定各个插入部分的碱基序列。其结果，确认出包含序列号2的第3位 第443位、序列号4的第6位 第449位 的碱基序列的DNA片段被分别克隆，这些质粒分别为pCR-422-P及pCR-424-P。
而后，以这些质粒为各自的模板，使用上述引物进行PCR反应。反应中虽然使用了 ExTaq (TaKaRa Bio)，但用PCR标记用混合物(Roche Diagnostics公司)代替附带的dNTP 混合物，将扩增的DNA用地高辛(DIG)标记，制备用于筛选cDNA文库的探针。使用该探针， 筛选EST分析中得到构成各个序列的EST的cDNA文库。杂交条件如下。缓冲液5xSSC、l%SDS、50mM Tris-HCl (pH7. 5)、50% 甲酰胺；温度42°C(—夜)；洗涤条件0.2x SSC、0. 1 % SDS 溶液中(65°C )、20 分钟 X 3 次;检测，使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行。从经过筛选得 到的噬菌体克隆中，通过体内切割切出质粒，确定插入部分的碱基序列。将用各个探针的筛 选中得到的插入部分最长的质粒分别作为pB-ACLl及pB-ACL2。将pB-ACLl、pB_ACL2的插 入部分的碱基序列分别用序列号5、序列号6及图1、图2表示。序列号5中包含由3540bp 组成的⑶S(序列号7)，此外，序列号6中还包含由3525bp组成的⑶S(序列号8)。即认为 得到了编码ATP:柠檬酸裂解酶同源基因全长的各个cDNA。将这些基因分别命名为MaACLl、 MaACL2。将由这些基因编码的蛋白质(MaACLlp及MaACL2p)的推定氨基酸序列分别表示于 序列号11及序列号12。(2)序列分析MaACLl基因和MaACL2基因具有同源性，用⑶S比较时，同一性为79. (图3)。 此外，比较推定氨基酸序列时，同一性为87. (图4)。另一方面，相对于NCBI的蛋白质 序列数据库(nr)进行Blast搜索时，同一性最高的是来自担子菌玉蜀黍黑粉菌(U. maydis) 的类似ACL的推定蛋白质(gi46096782)，氨基酸序列的同一性MaACLl为61. 6%、MaACL2
为61. 9 %。而且来自小鼠(gi_29293809)、人(gi_38569421)、黑腹果蝇
(gi28372804)、线虫(gi_17551266)等动物的ACL或类似ACL的推定蛋白质序列也显
示出更低但为一定的同一性(图5)。实施例3(1)酵母表达载体的构建为使MaACLl及MaACL2在酵母中表达，如下构建酵母表达用载体。首先，以质粒 pB-ACLl 为模板，通过引物 ACL1F-EX、引物 ACL1R-HS，使用 ExTaq(TaKaRa Bio)来进行。引物 ACL 1F-EX :GAATTCTCTAGAATGTCTGCTAAAGCCGTTCGCG (序列号 22)引物 ACL 1R-HS :AAGCTTGTCGACTTAGGCCTTCTTGTTGATCG (序列号 23)将PCR产物用限制性内切酶EcoRI和Hindlll酶切。将所得到的DNA片段插入载 体PUC18的EcoRI-Hindlll位点，得到质粒pUC-ACLl。将其用限制性内切酶EcoRI和Sail 酶切，将酶切后得到的约3. 5kbp的DNA片段插入载体pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem.， 59，ppl221-1228，(1995))的 EcoRI-Sall 位点，得到质粒 pYEMaACLl。另一方面，将质粒 PB-ACL2用限制性内切酶NotI和Sal I酶切、或用限制性内切酶Sal I和Kpnl酶切，分别得到 约2. 7kbp和约lkbp的DNA片段。将pYE22m用限制性内切酶EcoRI酶切，用DNA Blunting Kit (TaKaRa Bio)进行末端平滑化后，插入NotI接头(pd (GCGGCCGC))，得到载体pYE22mN。 将此载体pYE22mN用限制性内切酶NotI和Kpnl酶切，连接上述得到的ACL2的Notl-Sall 片段和Sall-Kpnl片段，得到质粒pYEMaACL2。
(2)酵母的转化分别使用质粒p YE22m、pYEMaACLl或pYEMaACL2，通过醋酸锂法，转化酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)EH13-15 ^ (trpl, MAT a)(Appl. Microbiol. Biotechnol.， 30,515-520, (1989))。转化株选择在SC_Trp [每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids) (DIFC0)为6. 7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐 1. 25g、精氨酸0. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0. 6g、亮氨酸1. 8g、赖氨酸0. 9g、蛋氨 酸0. 6g、苯丙氨酸1. 5g、丝氨酸11. 25g、酪氨酸0. 9g、缬氨酸4. 5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0. 6g 的混合物)为1.3g]琼脂培养基(2%琼脂)上生长繁殖的菌株。实施例4(1)酵母的培养选择各个载体转化的转化株中的任意2株(c-1株、c-2株、MaACLl-1株、MaACLl_2 株及MaACL2-l株、MaACL2-2株)，用以下条件培养。即作为预培养，从平板上取1白金耳 酵母接种到SC-Trp培养基10ml中，在30°C下振荡培养2天。主培养是在SC_Trp培养基 100ml中添加预培养液lml，30°C下振荡培养1天。(2)酶液的制备将培养液通过离心分离进行集菌，用1/2量的灭菌水洗涤。用提取缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8. 0)、lmM EDTAUOmM DTTUmM PMSF) 5ml 悬浮，使用弗式压碎器用 16kPa 破碎 菌体。20，000xg、4°C下离心分离10分钟，回收上清。供与填充了 Shehadex G_25的PD-10 色谱柱(GE HEALTHCAREBIO-SCIENCES 公司)，用洗脱缓冲液(10mM 磷酸钠(pH7.4)、lmM MgCl2、0. ImM EDTAUmM DTT)洗脱，作为酶液。(3) ACL活性测定ACL活性通过测定以下由ACL催化反应而产生的草酰乙酸量、由苹果酸脱氢酶催 化反应而减少的NADH量在A34(1处的变化(6. 22mM"1cm"1)来求出。式2<ACL催化的反应〉柠檬酸+CoA+ATP—草酰乙酸+ADP+Pi+乙酰CoA<苹果酸脱氢酶催化的反应>草酰乙酸+NADH—苹果酸 +NAD+反应液的组成为10mM Tris-HCl (pH8. 4)、10mM MgCl2、ImM DTT、lOmM ATP、lOmM 柠 檬酸、0. 2mM CoA、6单位苹果酸脱氢酶、0. ImM NADH、50 yl酶液，总量为1ml。添加CoA使反 应开始。反应在28 °C下进行。结果如表3所示。表明与c-1株、c-2株相比，MaACLl-1株、MaACLl-2株及MaACL2_l 株、MaACL2-2株中ACL活性高，MaACLl基因及MaACL2基因的产物具有ACL活性。表3MaACL活性测定 而后，考察MaACLl的Mg2+浓度依赖性。即在上述ACL反应液中，使MgCl2浓度为 5mM、10mM、20mM、40mM，同样进行测定。将MgCl2浓度为10mM时的活性作为1的相对活性表 示于图6。如图6所示，ATP 柠檬酸Mg2+的比大约为1 1 1时，ACL1显示最大活性。实施例5(1)被孢霉的基因组文库的构津将高山被孢霉(M. alpina) 1S_4株接种于100ml的液体培养基(1%葡萄糖、0. 5% 酵母浸膏、PH6.0)中，28°C下振荡培养4天。通过过滤器过滤收集菌体，用CTAB法提取基 因组DNA。将约200g所得到的基因组DNA用限制性内切酶Sau3AI进行部分分解，使切割DNA 的分布中心在20kb附近。所得到的DNA片段进行10% -40%的蔗糖密度梯度离心(转子 SW28 (Beckman)、25，OOOrpm、10°C、24 小时)，使用 AUTOMATIC LIQUID CHARGER(ADVANTEC 公 司)和MICRO TUBE PUMP (EYELA公司)，每次分离1ml。纯化在20kbp附近有分布中心的组 分。将如此得到的基因组DNA片段使用入BlueSTAR/BamHI载体试剂盒(N0VAGEN公司)制 备基因组文库。(2)URA5基因组DNA的克降作为标记基因，为使用来自被孢霉的URA5基因，将含有该基因的启动子及终止 子区域的基因组DNA如下进行克隆。即以来自被孢霉的URA5基因的cDNA序列(Biosci Biotechnol Biochem.，68，pp277_285 (2004))为基础制备探针，从被孢霉的基因组文库中 进行筛选，以确定含有该基因的约2. lkbp的碱基序列(序列号13)。(3)GAPDH同源基因基因组DNA的克降为使导入基因在被孢霉中进行组成型高表达，克隆已知在许多生物中组成型高表 达的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源基因。以实施例1的EST中发现的GAPDH 同源基因序列(序列号14)为基础制备引物ATGACCATCAAGATCGGCATCA(序列号24)和引 物TTAAGCATGATCCTTCTTGGCC(序列号25)。使用这些引物，以被孢霉的cDNA为模板，用与 实施例2同样的方法制备探针，从基因组文库中进行筛选，以确定包含GAPDH同源基因的约 3kbp的碱基序列(序列号15)。实施例6被孢霉表汰载体的构建高山被孢霉(M. alpina)的GAPDH的结构基因上游0. 9kb的区域使用弓丨物 AAGCTTGATCACGTCGGGTGATGAGTTGCTGTTGAC (序列号 26)、弓丨物 GAATTCGATGTTGAATGTGTGGTGTG (序列号 27)，此外，下游0. 5kb的区域使用弓丨物 TCTAGATAAGAAAAGGGAGTGAATCG (序列号 28)、弓丨物 GCGGCCGCGATCCATGCACGGGTCCTTC (序列号 29)，分别进行 PCR 扩增，进行GAPDH启动子(序列号16)、GAPDH终止子(序列号17)的克隆。将这些用分别附加于引物 上的 Hindlll 和 EcoRI 及 Xbal 和 NotI 酶切，分别插入 pBluescriptllSK-(Stratagene)上 的Hindlll/EcoRI位点和Xbal/NotI位点。而且，将此质粒的Apal位点进行平滑化，将质粒 pD4(Appl EnvironMicrobiol.，66，pp4655_4661 (2000))用 Xbal 和 Hindlll 酶切后进行平 滑化而得到的18SrDNA(0. 9kb)进行整合，制备质粒pBGptR。将含有高山被孢霉(M. alpina) 的Ura5基因的启动子 终止子的基因组DNA的Sail酶切片段(2. lkb)插入pBGptR的Xhol 位点，制备载体PH001。而且，为使PUFA有用基因容易导入，在GAPDH启动子和终止子之间 插入多克隆位点，所以，在将pHOO 1的GAPDH启动子的5’末端侧的HindllI位点和GAPDH 终止子的3’末端侧的NotI位点用各限制性内切酶酶切后进行平滑化，而后通过自我连接， 将Hindlll和NotI的位点分2阶段破坏，以构建载体pH002。使多克隆位点制备用寡核苷 酸SC/MCS-F2 :5，-ctagcgcggccgcctcgagaagcttcccggggcatgcctgcagtctagag(序列 号30)和SC/MCS-R2 :5，-aattctctagactgcaggcatgccccgggaagcttctcgaggcggccgcg(序列 号31)互补退火而制成的EcoRI/Nhel突出片段插入pH002的EcoRI/Xbal位点，构建载 体PH003。在载体pH003中，作为多克隆位点，可使用EcoRI .Xbal .Pstl .Sphl .Smal Hindll I .Xbal .NotI。而后，在pUC19的EcoRI位点和HindllI位点的各个外侧的2处，导入8碱基 识别的限制性内切酶AscI位点，构建用AscI酶切使插入区域整体切出的载体pUCAA。将此 pUCAA用EcoRI/Hindlll酶切后进行平滑化时，插入将pH003进行BssHII部分酶切后得到 的插入片段(4. 4kb)进行平滑化后的产物，以制备载体PH004。将pH004用EcoRI部分酶切 后进行平滑化后的产物连接，破坏BssHII旁侧的EcoRI位点，构建作为自我克隆用的基本 载体的pDuraSC。为使MaACLl及MaACL2在被孢霉中高表达，如下构建被孢霉表达载体。将质粒 PUC-ACL1用限制性内切酶Xbal和Hindlll酶切后得到的约3. 5kbp的DNA片段插入载体 pDuraSC的XbaI_SalI位点，构建质粒pDuraSC_ACLl。另一方面，将载体pDuraSC用限制性 内切酶EcoRI酶切并用Blunting Kit进行末端平滑化后用Xhol酶切后的产物、与将质粒 PB-ACL2用限制性内切酶NotI酶切用Blunting Kit进行末端平滑化后用Xhol部分分解而 得到的约3. 5kbp的片段连接，构建质粒pDuraSC-ACL2。实施例7被孢霉的转化使用质粒pDuraSC-ACLl或质粒pDuraSC_ACL2，以从高山被孢霉(M. alpina)中 根据专利文献(W02005019437 “脂质生产菌的育种方法”)方法诱导的尿嘧啶缺陷型株 Aura-3作为宿主，用基因枪法进行转化。转化株的选择中，使用SC琼脂培养基
。实施例8
转化被孢霉的评价(1)使用质粒pDuraSC-ACLl的转化株将所得到的转化株接种到4ml GY培养基(葡萄糖2%、酵母浸膏1 % )中，28°C下 振荡培养3天或4天。通过过滤回收菌体，使用RNeasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通 过 SuperScript First-Strand Synthesis System forRT-PCR(Invitrogen)合成 cDNA,而 后使用弓丨物 GCGTCATCCCCACCACTGTT (序列号 32)、引物 GCTGGCGGGAGGAGTGCCAGCACG (序列号 33)进行 RT-PCR。其结果，在各个转化株中筛选ACL1表达量多的菌株。将这些菌株接种于2%葡萄 糖、酵母浸膏的液体培养基中，28°C下振荡培养。培养过程中的第3天，添加培养液的 20分之1量的20%葡萄糖溶液。培养过程中的第4、6、7、8天，回收菌体的一部分，冷冻干 燥。使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析， 对菌体中的脂肪酸量进行定量。其结果如图7所示。如上所述，使MaACLl基因高表达的被孢霉菌株与野生株相比，可提高培养后期的 菌体内油脂含量。(2)使用质粒DDuraSC_ACL2的转化株将所得到的转化株在SC琼脂培养基上进行继代培养，筛选9株生长繁殖良好的菌 株。进一步将上述筛选出的菌株接种于GY培养基(2%葡萄糖、酵母浸膏)4ml中，28°C 下振荡培养4天。通过过滤回收菌体，进行冷冻干燥。取干燥菌体的一部分(约10-20mg 左右)，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气 相色谱法进行分析。其结果，筛选菌体内脂肪酸含有率、总脂肪酸中的花生四烯酸比率高的 菌株，作为 MaACL2#l 和 MaACL2#2。将这些菌株接种于4ml GY培养基中，28°C下振荡培养4天。过滤回收菌体，使用 RNeasy plant kit(QIAGEN) RNA。ilil SuperScript First-StrandSynthesis System for RT-PCR (Invitrogen)合成cDNA。为确认出导入的构建物中各基因的表达，以上述cDNA 为模板，用以下引物弓丨物 MaGAPDHpfw CACACCACACATTCAACATC (序列号 34)；及引物 ACL2-R5 CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTCG (序列号 35)；的组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，进行 94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 1 分钟为 1 个循环的25个循环的PCR反应。其结果，在这些菌株中，可确认出导入的构建物中的MaACL2 基因的表达。而且，将此2株与1S-4株接种于4ml GY培养基中(n = 3)，28°C、125rpm的条件 下振荡培养。培养第3天，添加20%葡萄糖200 iU，进一步培养到第6天。第6天过滤回 收菌体的总量，进行冷冻干燥。取干燥菌体的一部分(约10-20mg左右)，通过盐酸甲醇法 使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。将 菌体内的脂肪酸含有率、和每单位培养基中的花生四烯酸生产量分别归纳为以下表4及表 5。表 4菌体内脂肪酸含有率(％ )
如上所述，在使MaACL2基因高表达的被孢霉菌株中，与野生型相比，可提高菌体 内脂肪酸含有率及每单位培养基中的花生四烯酸生产量。因本发明的ACL基因可用于提高脂肪酸、脂质的生产能力，可提高在微生物、植物 中的多不饱和脂肪酸的生产率，所以优选。由此，因可提供比以往廉价且有效的脂肪酸或脂 质，所以，作为可适用于食品、化妆料、医药品、肥皂等中的成分而有用。序列表的自由内容
序列号18引物
序列号19引物
序列号20引物
序列号21引物
序列号22引物
序列号23引物
序列号24引物
序列号25引物
序列号26引物
序列号27引物
序列号28引物
序列号29引物
序列号30引物
序列号31引物
序列号32引物
序列号33引物
序列号34引物
序列号35引物
权利要求
核酸，其特征在于，其包含以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列(a)碱基序列，其编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有ATP柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(b)碱基序列，其与由序列号9或序列号10所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有ATP柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(c)碱基序列，其由与序列号9或序列号10所组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有ATP柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(d)碱基序列，其编码与序列号11或序列号12所组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有ATP柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(e)碱基序列，其与由编码序列号11或12所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有ATP柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。
2.根据权利要求1中所述的核酸，其包含以下(a) (c)中任一项的碱基序列(a)碱基序列，其编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列中1 10个氨基酸 发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有ATP:柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(b)碱基序列，其与由序列号9或序列号10所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的 核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有ATP 柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。(c)碱基序列，其编码与序列号11或序列号12所组成的氨基酸序列有90%以上同一 性的氨基酸序列，且编码具有ATP 柠檬酸裂解酶活性的蛋白质。
3.核酸，其特征在于，其包含以下(a) (c)中任一项所述的碱基序列或其片段(a)碱基序列，其如序列号9或序列号10所示。(b)碱基序列，其编码由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(c)碱基序列，其如序列号5或序列号6所示。
4.蛋白质，其特征在于，其如以下(a)或(b)中任一项所述(a)蛋白质，其由序列号11或序列号12中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的 氨基酸序列组成，且具有ATP 柠檬酸裂解酶活性。(b)蛋白质，其由与序列号11或序列号12所组成的氨基酸序列有70%以上同一性的 氨基酸序列组成，且具有ATP 柠檬酸裂解酶活性。
5.蛋白质，其特征在于，其由序列号11或序列号12所示的氨基酸序列组成。
6.重组载体，其特征在于，其含有权利要求1 3中任一项所述的核酸。
7.转化体，其特征在于，其中导入了权利要求1 3中任一项所述的核酸。
8.转化体，其特征在于，其通过权利要求6中所述的重组载体转化。
9.根据权利要求8中所述的转化体，其中，通过导入权利要求6中所述的载体，提高了 脂肪酸的生产能力。
10.根据权利要求7 9中任一项所述的转化体，其特征在于，转化体为脂质生产菌。
11.根据权利要求10中所述的转化体，其特征在于，脂质生产菌为高山被孢霉。
12.脂肪酸或脂质的制造方法，其特征在于，从培养权利要求7 11中任一项所述的转 化体而得到的培养物中提取所述脂肪酸或脂质。
13.脂肪酸或脂质，其特征在于，其使用权利要求12中所述的制造方法获得。
14.食品，其特征在于，其中含有权利要求13中所述的脂肪酸或脂质。
全文摘要
本发明提供新型ATP柠檬酸裂解酶基因。具体为，其为含有序列号5、6、9或10所示的碱基序列或其片段的核酸。
文档编号C12N1/15GK101855347SQ200880113428
公开日2010年10月6日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月26日
发明者落合美佐 申请人:三得利控股株式会社