Dna扩增方法

专利名称：Dna扩增方法
技术领域：
本发明总体涉及扩增感兴趣的核酸区域的方法，更特别地涉及用PCR方法扩增感兴趣的核酸区域的方法，所述PCR方法设计为用于使从结合非感兴趣的特异性区域的核酸 区域的引物的扩增子产生最小化。本发明方法基于下述的确定，即通过使正向引物或反向 引物的功能性低效，不相关核酸区域的扩增速率能相对于感兴趣区域的扩增而言降低。提 供感兴趣的核酸区域的选择性扩增的手段可具有一系列应用，包括但非限于特征在于特定 基因序列的疾病状况的诊断和/或监测，感兴趣基因区域的鉴定或分析，DNA断裂点区域的 鉴别或鉴定，感兴趣基因序列的分离，其中仅感兴趣基因序列一个末端的核苷酸序列是已 知的。
背景技术：
说明书中的关于任何现有技术的参考文献(或任何来源于此的信息)或任何已知 的内容都不应认为是认可或以任何形式提示现有出版物(或来源于此的信息)或已知内容 构成本发明涉及的领域的一般常识的一部分。本发明的作者引用的出版物书目细节以字母顺序收集在说明书结尾。聚合酶链反应(PCR)是用于扩增DNA链的特定区域的技术。其可以是单个基因、 基因的仅仅一部分或非编码序列。大多数PCR方法通常扩增达10千碱基对(kb)的DNA 片段，但一些技术允许扩增达40kb的片段(Cheng etal.，1994，Proc Natl Acad Sci. 91 5695-5699)。目前常用的 PCR 需要几种基础成分(Sambrook and Russel，2001，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Ed.)。这些成分是·含有待扩增的DNA片段的区域的DNA模板；·弓丨物，它们互补于在待扩增DNA区域的5'和3'末端的DNA区域；· DNA聚合酶(例如Taq聚合酶或另一种热稳定DNA聚合酶，最佳温度在大约 700C )，用于合成待扩增区域的DNA拷贝；及·脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，DNA聚合酶从它们构建新DNA。PCR在含有典型反应体积15-100 μ 1的小反应试管(0. 2-0. 5ml体积)中进行，这 些试管插入热循环仪中。这个仪器加热和冷却其中的反应试管至每个反应步骤所需的精确 温度。大多数热循环仪包含加热盖以防止在反应试管帽内侧的冷凝。或者可以将一层油置 于反应混合物上以防止蒸发。因此，PCR是一种允许指数扩增较长DNA分子内的DNA序列的方法。反应涉及一 些扩增循环，在每个循环中每个分子反应的模板是基因组DNA链或者在前一个循环中合成 的DNA链。每个PCR循环涉及下述步骤-加热变性以分离双链DNA分子的2条链-将上游和下游引物与它们的互补序列杂交-经DNA聚合酶延伸弓I物以产生模板序列的互补拷贝。
通常PCR试剂和条件被选择以便变性、杂交及延伸以接近最大效率发生，结果希 望的序列的量在每个循环增加接近2倍。在PCR结束时发生实质扩增，例如30个循环的 PCR将产生原始模板的几乎23°(1，000，000，000)倍的扩增。这个程度的扩增促进扩增产物 的检测和分析。其它核酸扩增技术，如连接酶链反应(LCR)或基于核酸序列的反应(NASBA)，也用于扩增DNA中的希望的序列。反应策略与PCR不同但是它们也使用与靶序列的2个末端杂 交的引物，及同样反应常规进行以保证每个步骤包括杂交均在或接近最大效率发生。尽管 接下来的讨论基本上针对PCR，所述概念同样适用于其它扩增技术。一些扩增循环后，PCR产物可以各种方式分析，最常用凝胶电泳分析。在其最简单 形式中，这个分析方法是半定量的。产物的量不与输入DNA的量紧密相关，由此使得这种类 型PCR是检测具体DNA存在或不存在的定量工具。为了测量信使RNA(mRNA)，所述方法使用逆转录酶以先将mRNA转化为互补 DNA(cDNA)，然后经PCR扩增及经琼脂糖凝胶电泳分析。在许多情况中这个方法已用于测量 不同条件下具体mRNA水平。但是，这个方法因为额外的逆转录酶步骤实际上比DNA的PCR
定量性还差。为了提供定量能力，开发了实时PCR。这个程序遵循PCR的一般模式，但是扩增的 DNA在每个循环被定量。两个常用定量方法是使用间插双链DNA的荧光染料及修饰的DNA 寡核苷酸引物或探针，所述引物或探针的荧光在PCR步骤之一中变化。通常，实时聚合酶链 反应与逆转录酶聚合酶链反应组合以定量低丰度信使RNA (mRNA)，使得研究者可以在特定 时间或在特定细胞或组织类型中定量相对基因表达。(i)使用结合双链DNA的染料的实时PCRDNA结合染料结合PCR反应中的所有双链(ds)DNA，导致增加的染料荧光。PCR期 间DNA产物的增加因此导致荧光强度增加，其在每个循环中测量，由此允许定量DNA浓度。 与其它实时PCR方法类似，获得值不具有与其相关的绝对单位(即mRNA拷贝/细胞)。因 此，测量的DNA/RNA样品与标准稀释液的比较仅给出样品相对于标准的分数或比率，使得 仅允许在不同组织或实验条件之间的相对比较。为保证定量精确性，通常需要将靶基因表 达针对稳定表达的基因标准化。这可以校正实验样品间RNA数量或质量中的可能差异。(ii)荧光报道序列方法已开发了一些使用荧光报道引物或探针的不同方法，它们趋于比使用DNA结合染 料更精确及可靠。它们使用一或多个DNA引物或探针以仅定量与引物或探针杂交的DNA。 使用报道探针显著增加特异性及可允许甚至在一些非特异性DNA扩增的存在下的定量。使 用序列特异性引物或探针允许多重化(multiplexing)-通过使用具有不同颜色标记的特 异性序列或探针在相同反应中分析几个不同扩增产物，条件是所有靶均以相似效率扩增。关于定量，在反应指数阶段存在的DNA的相对浓度通过以对数规格用荧光对循环 数目绘图而确定。高于背景的荧光增加或者低于背景的荧光降低的阈值(根据具体方法) 被确定。来自样品的荧光超过阈值的循环被称为循环阈值，Ct。由于指数阶段每个循环DNA 数量加倍，可以计算DNA相对量，例如一个样品Ct比另一个早3个循环具有23 = 8倍的更 多模板(假定每个循环的扩增DNA的量加倍)。DNA量然后通过比较结果和由已知量DNA的系列稀释液(例如未稀释的，1 4，1 16,1 64)产生的标准曲线而确定。但是，PRC的一个限制涉及这样事实，引物在一些情况中可以结合DNA样品的一个 以上区域，由此潜在导致产生与感兴趣DNA序列不相关的扩增序列。结合多个区域可在一 些情况中发生，其包括但非限于1.引物的非特异性结合，由于，例如，引物非常短或者简并或者设计有利于非特异 性结合或者受有利于非特异性结合的PCR条件影响。2.引物结合序列在基因组的许多区域天然存在。属于家族如alu和line的序列 广泛分布，虽然个体序列可略微变化，但是它们的同源性是使得结合一个家族成员的引物 很可能与许多其它成员结合。 3.引物结合序列已被导入基因组的许多区域。例如如果DNA由限制酶消化及共同 序列连接在消化位点，这可能发生。4.反应中存在多个引物。偶然地，一个引物可结合作为正向引物起作用，另一个可 结合作为反向引物起作用。这个现象发生概率随着引物数增加而增加。这些情况之一的结果是，一个引物可结合作为正向引物起作用，相同或另一个引 物结 合作为反向引物起作用。如果结合位点足够近，可发生非特异性扩增。如果考虑到PCR 扩增十亿倍以上的能力也增加扩增错误DNA序列的可能性超过十亿倍，使这种可能性最小 化的重要性显而易见。因此，有持续兴趣和需要开发克服这个问题的手段。通常途径是嵌套式PCR。在这 个方法中两对PCR引物用于一个基因座。第一对扩增基因座如任何PCR实验所见。第二对 引物(嵌套式引物)结合在第一个PCR产物内并产生比第一个短的第二个PCR产物。这个 策略后面的逻辑是如果不想要的基因座也被扩增，则其被第二对引物扩增第二次的概率非 常低。但是，嵌套式PCR仅在如下情况下有价值第一对引物内部的一些或全部DNA序列是 已知的从而一或多个提供额外特异性的内部引物可以被合成。在导致本发明的工作中，开发了另一个使不想要的扩增事件最小化的方法。特别 地，已经确定如果两个PCR引物之一(例如引物2)被设计或使用从而其低效杂交及包含本 身导致第三个(标记)引物的结合位点的核酸标记，则发生扩增“瓶颈(bottleneck)。瓶 颈发生是因为希望产物的有效扩增仅在引物2杂交及延伸后开始，这个过程是低效的。在 后续循环中，从如此产生的模板开始的指数扩增是有效的，由引物1在一个方向的有效杂 交及延伸和标记引物在另一个方向的有效杂交及延伸介导。但是，对于从可以引物2作为 正向和反向引物的序列产生的不希望的扩增子，PCR期间的瓶颈更严重。对于这种序列，标 记引物的有效扩增仅在引物2的2个连续的低效杂交发生后发生，一个在正向，一个在反 向。因此，通过有意保证PCR中一个引物杂交被低效化，可以根据序列的扩增选择正向和反 向引物，使得有利于由利用该引物从一个末端及利用有效杂交引物从另一个末端扩增的序 列的扩增。发明_既述在整个说明和权利要求中，除非上下文相反，则词语“包含”应理解为包括所述整 数或步骤或者整数或步骤组但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤组。如本文所用，术语“衍生自”应理解是指特定整数或整数组源自所述物种，但非必 须直接得自所述来源。另外，本文所用单数形式包括复数，除非上下文清楚表明不是这样。
除非另外定义，本文所用所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的意义。本发明的一个方面提供了鉴别感兴趣核酸区域的方法，所述方法包括(i)使核酸样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的核酸样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的核酸与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的核酸样品。本发明另一方面提供了扩增感兴趣DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。在本发明另一个方面中，本发明提供了扩增感兴趣的基因或基因片段的方法，所 述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣基因或基因片段的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣基因或基因片段的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。在另一个方面中，提供了扩增感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的方法，所述 方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。在另一个方面中，提供了扩增感兴趣的DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣的区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣的区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连 接寡核苷酸标记，以及其中所述功能上低效的引物组是具有与非靶DNA区域混杂地 (promiscuously)杂交的潜力的引物组；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。在另一个方面中，提供了扩增感兴趣的DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物低效杂交并在它们的5’末端可操纵地连接寡核苷酸标 记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。本发明的另一个方面提供了扩增感兴趣的DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物低效杂交并在它们的5’末端可操纵地连接寡核苷酸标 记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iν)经PCR扩增步骤(i i i)的DNA样品。本发明的另一个方面提供了扩增感兴趣的DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及
(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物低效杂交并且是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的部分或全部序列的引物接触；(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品；及(ν)分离和/分析所述扩增的DNA。附图简述

图1是示意图，描述了用于扩增感兴趣序列的在2个(非必需连续)PCR循环中的 2个事件，其必须在有效扩增发生之前发生。第一个是当低效引物2杂交并延伸形成反义链 时，第二个是当有效引物1与所得反义链杂交并延伸形成含有标记引物的结合序列的有义 链时。然后在后续循环中发生由引物1和标记引物引发的有效扩增。图2是瓶颈PCR期间的阴性选择的示意图。在经典PCR中在上游和下游引物位点 均具有有效杂交及延伸。在瓶颈PCR中由于在一个或两个引物结合位点的低效杂交而具有 瓶颈。这导致与仅在一个末端具有瓶颈的靶相比在每个末端均有瓶颈的靶的阴性选择。图3是使用瓶颈PCR富集BCR-ABL断裂点序列的实验设计示意图。第二、第三和 第四轮PCR是瓶颈PCR，因为杂交-标记下游引物以低浓度存在，导致低效杂交和延伸。在 第一轮中还有一些偶然瓶颈效应，是由于每个下游ABL引物的低浓度所致。在典型实验中， 前3轮各涉及20个PCR循环，最终第四轮涉及20-35个循环。图4是用瓶颈PCR富集希望产物的实验设计示意图。初始PCR涉及正向基因特异性引物(Fl)及一个简并(通用)反向引物(如果进行基因步移)或者反向引物集合(如 果进行跨易位断裂点的扩增)。初始PCR可以通过使反向引物低效而设计为瓶颈PCR，并且 当使用反向引物集合时，实际上由于每个反向引物的低浓度而作为瓶颈PCR进行。第二和 第三轮PCR是确定的瓶颈PCR。它们涉及相同或嵌套式正向引物和低浓度杂交-标记反向 引物，其导致这个引物的低效杂交及延伸。在典型实验中，前2或3轮各涉及20个PCR循 环，最终一轮涉及20-35个循环。图5是经针对非特异性产物选择而富集特异性产物的示意图。特异性产物是 BCR-ABL易位序列，非特异性产物是无名基因组序列，一或多个ABL引物杂交在所述基因组 序列每个末端导致扩增。来自具有BCR-ABL易位的患者的DNA在第1轮中用上游BCR引物 和282个下游标记ABL引物扩增。然后进行3轮连续瓶颈PCR，每轮使用上游BCR引物和下 游连接杂交标记厂标记i+1引物及标记i+1引物。每一轮扩增用BCR-ABL易位的序列特异性 引物及非特异性产物的标记引物量化。如2个产物的Ct值所示，非特异性产物在第一轮中 占据主导但是其相对量随着每一轮下降，从而特异性产物在第3和第4轮中占据主导。在 第2轮和第1轮之间及在第3轮和第2轮之间观察到的富集程度提示标记_标记引物以大 约最大效率起作用。图6是促进易位断裂点区域分离的瓶颈PCR的选择作用的图像。泳道2、5和17 显示用来自慢性髓样白血病的3名患者的DNA的扩增结果，泳道N显示用来自正常对照的 DNA的结果，泳道MQ显示来自水对照的结果。在PCR扩增的第一个循环中，所有样品均用1个针对BCR的上游引物和282个针对ABL基因的引物扩增。对于一个系列的扩增，第一轮 持续45个循环(第1轮)，而对于其它系列扩增PCR在20个循环后终止，使用1/100等份 进行进一步3轮瓶颈PCR(第4个循环)。第1轮结果显示异质产物的宽的成片条带，其由 于ABL引物在两个末端引发而扩增。第4轮产物不复杂得多并且可见同质条带。在所有样 品中均可见一个非特异性条带，在患者2和5中可见由于BCR-ABL易位的扩增导致的条带 (箭头)。
图7是瓶颈PCR的选择作用的另一个图像。泳道6、16和23显示用来自慢性髓样 白血病的3名患者的DNA的扩增结果，泳道N显示用来自正常对照的DNA的结果，泳道MQ 显示来自水对照的结果。在第一轮PCR扩增中，所有样品均用1个针对BCR的上游引物和 282个针对ABL基因的引物扩增；在第二轮中，所有样品均用1个针对BCR的嵌套式上游引 物和282个针对ABL基因的嵌套式引物扩增。当不进行瓶颈PCR时，第二轮持续45个循环， 而当其进行时，第二轮PCR在20个循环后终止，使用1/100等份进行进一步2轮瓶颈PCR。 这导致3名患者中BCR-ABL序列的优先扩增(箭头表示)。图8是示意图，描述了在经典PCR或其中一个引物或两个引物低效的单轮瓶颈PCR 中产生的扩增的模型。所述模型用Excel表格产生。在所示实施例中，对于每个PCR的起 始靶是一个DNA双螺旋，包含有义链和反义链，每个循环期间杂交及延伸的概率对于有效 引物是1，对于低效引物是0.001。指数扩增占主导之前的瓶颈是明显的。在任何给定数目 PCR循环后，用一个有效和一个低效引物扩增的靶与用两个低效引物扩增的靶相比增加大 约1000倍。图9显示用瓶颈PCR从急性早幼粒细胞白血病患者分离PML-RAR α易位断裂点的 实验的图像。a)患者DNA用多个RAR α引物和一个PML引物扩增，然后进行2轮瓶颈PCR。 该图显示在2%琼脂糖凝胶上电泳的扩增的DNA。P是患者DNA，N是正常DNA，W是水对照。 DNA梯显示从上至下700bp-100bp的条带。患者条带可在大约500bp见到。b)为证实断裂 点已被分离，用断裂点序列设计跨越断裂点的RARa弓丨物和PML引物，用这些引物扩增患者 DNA 一轮。该图显示在2%琼脂糖凝胶上电泳的扩增的DNA。P是患者DNA，N是正常DNA，W 是水对照。DNA梯显示从上至下700bp-100bp的条带。证实的患者条带可在大约150bp见 至IJ。c)从图的a部分的凝胶上显示的扩增条带获得的序列层析图。显示了 PML和RARa之 间的断裂点。图10示出用于基因步移的瓶颈PCR的应用，其使用“通用”简并引物，沿Myocillin 基因使用4个不同简并引物(泳道1-4)，其除了在它们的第5个最3’碱基是A、G、C或T之 外是相同的。第一轮是初始PCR，第二和第三轮是瓶颈PCR。随着系列瓶颈PCR复杂度的降 低是明显的。4个扩增的每一个中的主要条带的测序显示预期的Myocillin基因序列。泳 道M是DNA梯，产物从700-100bp，间隔IOObp，W是无DNA的水对照。图11是经瓶颈PCR针对非特异性扩增产物的进行性选择的示意图。实验研究了 沿APC基因的步移。初始PCR用20个循环，使用一个基因特异性和一个简并引物，随后3 轮瓶颈PCR，各20个循环。扩增产物每5个循环取样，在“read-out” PCR中测定特异性和 非特异性产物。降低的Ct表示增加产物。特异性产物在1个瓶颈PCR后开始占据主导。图12示出来自3轮基因步移实验的APC基因序列的图像。使用APC基因特异性 引物和简并反向引物的初始PCR后接2轮瓶颈PCR，扩增产物不经电泳而直接测序。示出使用不同测序引物的正向的3个APC序列。用于获得A的测序引物与第三轮PCR中使用的引 物相同。用于获得B和C的测序引物分别是来自最5’引物的732和1302bp。可读序列的 总长度是大约1. 5kb。发明详述本发明部分基于如下确定，即衍生自引物与非感兴趣区域的DNA区域的结合的不 想要的扩增子产生的几率可以通过标记在非感兴趣位点可能产生引物杂交及延伸的引物 及使其功能上低效而最小化。本发明方法因此提供了扩增感兴趣核酸区域的简单有效手 段。因此，本发明的一个方面提供了扩增感兴趣核酸区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触
(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iν)扩增步骤(iii)的DNA样品。核酸“感兴趣区域”应被理解是指任何要被扩增的DNA或RNA区域。这可以是基 因或基因部分。为此，“基因”应理解是指编码蛋白质产物的DNA分子，可以是全长蛋白质 或蛋白质片段。对于染色体DNA，基因包括内含子和外显子区域。但是，当感兴趣DNA是 cDNA时，例如如果感兴趣DNA是载体DNA或者逆转录的mRNA可能发生，可能不存在内含子 区域。然而这种DNA可包括5’或3’未翻译区。因此，本文“基因”是理解是包含任何形式 的DNA，其编码蛋白质或蛋白质片段，包括例如基因组DNA和cDNA。感兴趣的核酸区域也可 以是基因组DNA的非编码部分，未知其与任何特异基因相关(如通常命名的“无用，，DNA区 域)。其可以是由重组产生的基因组DNA的任何区域，在基因组DNA两个区域之间或者基因 组DNA —个区域与外来DNA如病毒或导入的序列之间。其可以是部分或全合成的或重组产 生的核酸分子的区域。感兴趣的核酸序列也可以是先前已用任何核酸扩增方法包括PCR扩 增的DNA区域(即其已通过扩增方法产生)。“核酸”区域可以是DNA或RNA或其衍生物或类似物。当感兴趣区域是编码蛋白质 分子的DNA序列时，其可以是基因组DNA、从mRNA转录物产生的cDNA或通过核酸扩增产生 的DNA的形式。但是当本发明DNA不编码蛋白质时，基因组DNA或者合成或重组产生的DNA 可以是分析的目标。本领域技术人员理解，合成和重组产生的DNA也可以编码蛋白质的全 部或部分。但是，如果本发明方法涉及检测RNA区域，应理解首先需要逆转录RNA为DNA， 如使用RT-PCR。本发明RNA可以是任何形式的RNA，如mRNA、一级RNA转录物、核糖体RNA、 转移RNA、微小RNA等。优选地，所述感兴趣核酸区域是感兴趣的DNA区域。为此，所述DNA 包括通过从RNA逆转录产生的DNA，其最终是分析的目标，以及通过核酸扩增方法如PCR产 生的DNA。本发明因此更优选地提供扩增感兴趣DNA区域的方法，所述方法包括
⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。“DNA”应理解是指脱氧核糖核酸或其衍生物或类似物。应理解其包含所有形式的 DNA，包括cDNA和基因组DNA。本发明的核酸分子可以是任何来源，包括天然发生的(如衍 生自生物学样品)、重组产生的或合成产生的。“衍生物”应理解是包括来自天然、合成或重组来源的所述DNA的片段、同系物或直 向同源物。“功能衍生物”应理解是显示DNA的任何一或多种功能活性的衍生物。所述DNA 序列的衍生物包括具有与其它蛋白质或非蛋白质分子融合的DNA分子的特定区域的片段。 本文所述“类似物”包括但非限于对核苷酸或核酸分子的修饰如对其化学组成或整体构象 的修饰。这包括例如掺入新的或修饰的嘌呤或嘧啶碱基或者修饰核苷酸或核酸分子与其它 核苷酸或核酸分子的相互作用的方式，如在骨架形成水平或互补碱基对杂交。核苷酸或核 酸分子的生物素化或其它形式的标记是本文限定的“功能衍生物”的一个例子。优选地，所述DNA是基因或基因片段，染色体基因易位断裂点或由先前核酸扩增 产生的DNA。根据这个方面，本发明提供了扩增感兴趣基因或基因片段的方法，所述方法包 括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣的基因或基因片段的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣的基因或基因片段的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。在另一方面，提供了扩增感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的方法，所述方法 包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物是功 能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；
(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。在另一个方面中，提供了扩增由先前的核酸扩增产生的DNA的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣的染色体基因易位断裂点区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。优选地，所述先前的核酸扩增是PCR。在经典PCR中，引物及反应条件被设计为正向和反向引物的引物杂交及延伸以最 大效率或接近最大效率发生从而扩增子数目每轮大约倍增，产生有效指数扩增。然而本发 明方法基于使用正向和反向引物组，其中一组引物已在其中它们不有效杂交及延伸的条件 下被设计或者另外使用。因此，尽管优选引物组正常扩增，低效组不会这样。结果，当感兴 趣序列被扩增时，扩增子链的数目显著低于经典PCR中发生的那些。有效扩增仅在扩增子 已被产生时开始，其在一个末端掺入低效引物的标记区域(这些扩增子的产生示于图1，标 记的功能在以下更详细讨论)。在这一点，针对标记区域的引物实现正常扩增速率。“瓶颈 (bottleneck) ”因此在从低效引物组产生转录物时有效产生。更严重瓶颈通常当被低效化的引物是简并的并广泛杂交或者针对常见重复序列 如alu序列时产生。如果引物结合位点紧密并列(apposed)时及如果低效引物可以作为正 向引物和反向引物，则可产生不想要的产物的扩增。但是，由于两个引物是低效的，扩增最 初极度低效及存在严重瓶颈。这种情况示于图2。有效扩增仅在一端包含低效引物的标记 区域及另一端包含其互补序列的扩增子链已产生时开始。但是在给定数目循环后，这种扩 增子的数目大大低于如上所述在感兴趣序列扩增期间产生的数目。扩增反应结束时不想要 产物的量相应降低。已正确杂交感兴趣序列的低效引物的杂交及延伸后，在随后循环中有效引物与先 前合成的扩增子的杂交及延伸，产生标记引物可以有效杂交及延伸的模板。由于这种分子 与其互补序列一起提供上游和下游结合位点，各针对有效引物(标记引物及有效组的一个 成员)，从这种模板的后续扩增循环是有效的及指数型的。结果是在最初延迟或“瓶颈”后， 扩增的整体速率在后面的循环中加速，从而产生每个循环几乎加倍的扩增子数。但是，净结 果是针对不希望扩增子的扩增与感兴趣序列的扩增子相比有阴性选择，这是由于对于前者 每个末端均有瓶颈，而对于后者仅在一个末端有瓶颈。因此，如果考虑起始靶序列的相同数目以及与经典PCR产生的扩增相比，本发明方法的应用使得产生感兴趣序列的扩增子数目增加较低，产生不想要的序列的扩增子数目 增加甚至更低，如图8所示。尽管想要的和不想要的产物的扩增均发生，但是相对于不想要 的序列，存在感兴趣序列的相对富集。绝对扩增与富集之间存在逆相关，因为降低低效引物 组的效率以较少扩增的代价产生增加的富集。本领域技术人员应意识到所述方法的第一和第二阶段不需要以物理上分离的反 应进行，可以简便地在同一反应容器中进行；第一阶段以循环1开始并进行，而第二阶段以 循环3开始并继续进行。关于决定是正向引物组或是反向引物组被低效化可以随情况变化。但是通常，人 们寻求使这样的引物组的杂交及延伸低效，即显示与非感兴趣靶的序列以最大概率结合的 引物组。关于本文提供的举例，富集BCR-ABL断裂点的实验设计基于使ABL引物组而非BCR 引物组低效。在另一个实施例中，如果感兴趣DNA区域的引物靶序列仅在该DNA区域的一侧 是已知的，可以使用通用或简并引物以从另一侧起始引物延伸和扩增。但是，由于这种引物 定义是混杂结合样品DNA，通过使这个引物组低效，可以实现感兴趣DNA区域与无关序列相 比增强的扩增。在另一个实施例中，当被扩增的DNA样品已通过先前的核酸扩增产生时，关 于确定是正向引物组或是反向引物组被低效化，如果在初始扩增中的正向引物是混杂的， 人们可能寻求使正向引物的杂交及延伸低效，或者，相反，如果在初始扩增中的反向引物是 混杂的，则使反向引物的杂交及延伸低效。 优选地，被低效化的引物组是能与非靶DNA区域混杂杂交的组。根据这个方面，提供了扩增感兴趣DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物；其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记，以及其中所述功能上低效的引物组是能与非靶DNA区域混杂地杂交的引物组；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。“引物”或“寡核苷酸引物”应理解是指包含核苷酸序列的任何分子或其功能衍生 物或类似物，其功能包括与感兴趣的核酸分子的一个区域杂交(感兴趣的DNA可互换地指 “靶DNA”)。应理解引物可包含非核酸成分。例如，引物还可包含非核酸标记如荧光或酶标 记或者一些其它非核酸成分，其促进该分子用作探针或者其另外促进其检测或固定化。引 物还可包含额外的核酸成分，如寡核苷酸标记，其在后文详细描述。在另一个实施例中，弓丨 物可以是蛋白质核酸，其包含显示核酸侧链的肽骨架。优选地，所述寡核苷酸引物是DNA引 物。“正向引物”应理解是指通过杂交靶DNA的反义链而扩增感兴趣DNA样品中的靶 DNA的引物。“反向引物”应理解是指通过杂交靶DNA的有义链而扩增感兴趣DNA样品中的靶 DNA的引物。
适用于本发明的引物的设计和合成是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案 中，本发明引物是4-60个核苷酸长，在另一个实施方案中是10-50个核苷酸长，在另一个实 施方案中是15-45个核苷酸长，在另一个实施方案中是20-40个核苷酸长，在另一个实施方 案中是25-35个核苷酸长。在另一个实施方案中，引物是大约26、27、28、29、30、31、32、33 或34个核苷酸长。关于用于本发明方法中的引物的数目，这可以由本领域技术人员确定。如果感兴 趣序列的 两个末端的序列是已知的，则可能仅需要1个正向和1个反向引物，但是如果这个 信息是未知的，则可以采用多个正向和/或反向引物或者一或多个简并引物。对于可在相 互作用基因的大区域内的未知点发生的易位断裂点的分离，可使用多个引物以尝试保证至 少1个正向和1个反向引物紧密跨越断裂点，从而会发生有效PCR。对于慢性髓样白血病 (CML)，例如，几乎所有BCR易位均涉及两个区域中的一个，每个长度大约3kb。在这种情况 中，可以使用12个外(outer)正向引物。但是ABL基因更大，易位中通常涉及的区域长度 大约140kb，可以使用高达282个或更多个外反向引物。在一个特定实施方案中，组合使用 6个正向引物和24个反向引物，在另一个实施方案中组合1个正向引物和282个反向引物。 在另一个组合中，有6个正向引物和270-310个反向引物。在另一个组合中，有1-20个正 向引物和250-350个反向引物。选择使用的引物数目取决于感兴趣的靶区域及因此可随着 靶变化。本领域技术人员理解，对于经典PCR，每个PCR反应中的大的引物数目增加非特异 性扩增反应的概率。但是本发明方法使得可以使用大量引物，这是由于通过使一个引物组 功能低效而使非特异性扩增反应最小化。还应理解在单个正向或反向引物集合中存在2个或多个不同引物，可以使该集合 中的所有引物均低效，或者可以使这些引物中仅一个选定亚组低效，其据信对于产生不相 关扩增子是问题最大的。“功能上低效”是指本发明引物已被修饰和/或用在某种环境条件下，使得其杂交 及延伸比引物设计未被修饰或该引物未被用在所述环境条件下就从该引物产生扩增子的 数目和/或速率方面而言更为低效。使引物功能上低效的方法是本领域技术人员熟知的并 且包括但非限于(i)降低所用引物浓度；(ii)降低引物杂交时间；(iii)增加杂交反应发生所需的温度；(iv)修饰引物长度；(ν)改变引物解链温度；(vi)在杂交/引物延伸阶段中引入离液剂；(vii)将引物竞争性抑制剂如其互补序列导入反应中；(viii)将核苷酸错配导入引物序列；(ix)使用引物类似物，其在杂交中与氢键合有效性较差(hydrogen-bondless effectively)。应理解除了潜在修饰引物本身之外，还可以(或者另外)选择修饰反应条件以实 现相同结果。为此，应理解也可以设计一种系统，其使用两或多种上述方法以实现一个引 物的功能低效而不类似使另一个引物功能低效。当选择改变反应条件而非引物本身时，这更可能成为问题。例如，如果选择增加反应温度以降低效率，这会影响两个引物组(即正向引物和反向引物)的功能性。因此，为最小化所需的温度增加，可以组合使用这个方法及使 用长度已增加的引物以最大化一个引物而非另一引物的低效。在另一个实施例中，可以选 择不改变反应条件，而是可以降低使用的引物的浓度。在另一个实施例中，可以降低引物长 度或者降低其浓度组合降低杂交时间。设计及改变这些因素以实现功能低效是本领域技术 人员熟知的，因为它们是在设计PCR反应中本领域常规考虑和详细描述的问题(Sambrook J.andRussell D. “ Molecular cloning :a laboratory manual" 3rd edition published byCold Spring Harbor，2001)，尽管通常是降低正向和反向引物的功能低效的可能性，与 有意诱导这个状态相反。不过，设计有效PCR反应需要考虑的与设计使部分反应功能低效 需要考虑的相同。因此，问题仅仅是这些考虑如何应用。为此，应理解使引物功能低效不只 包括修饰引物本身的设计，而且或者任选包含修饰引物起作用所需的反应条件。优选地，功能低效是杂交低效，其通过修饰引物长度、序列、退火温度、起始浓度或 杂交时间之一或多种而实现。根据这个方面，提供了扩增感兴趣的DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。优选地，所述功能低效引物组是在未被功能低效化时能混杂杂交非靶DNA区域的 引物组。在另一个优选的实施方案中，所述感兴趣的DNA区域是基因或基因片段或者染色 体基因易位断裂点。如前所述，本发明方法目的在于富集感兴趣序列及使正向或反向引物组低效。结 果，感兴趣序列的扩增是低效的，但是对通过作为正向和反向引物的低效引物组的一或多 个成员扩增的其它不想要的序列而言更低效。这种情况在图2示出，导致针对这种不想要 的序列的阴性选择及感兴趣序列的富集。但是，还希望的是返回有效扩增水平以促进感兴 趣扩增子的拷贝数增加。这方便地通过向功能上低效的引物中掺入标记而实现，所述标记 可以本身起作用产生引物杂交靶位点。通过这种方法有效地使得可以实现与功能上低效引 物相同方向的有效扩增。使得在后面循环中由标记引物有效引发的这种模板的产生导致进一步富集，事件 顺序如图1所示。引物2包含寡核苷酸标记，其与模板链杂交，所述模板链是原始基因组链或在前 一个PCR循环中产生的扩增子链。这个引物低效杂交但是其在这第一个循环中确实产生一 些互补链。在第二个扩增循环中，引物1与引物2产生的扩增子链杂交并且延伸，产生包含标记引物的结合位点的链，其能够被标记引物在后续循环中有效扩增。附图示出这样的情 况，其中引物1是有效引物，其选择相应于感兴趣的DNA区域的扩增子并且有效产生含有标 记引物的结合位点的扩增子链。对于特征在于由低效引物组的一或多个成员正向和反向引 发的情况，如通用序列如Alu或者能被简并或通用引物扩增的序列的扩增，及扩增是不希 望的，相应于图1中的引物1的引物是低效的并且其在第二个循环中的延伸产生更少的含 有标记引物的结合位点的链。因此，有效发生了进一步的针对这种不希望模板的产生的阴 性选择及有利于感兴趣序列的模板链的阳性选择，其在一个末端包含引物1，及在另一个末 端包含标记的结合位点。为了保证这些寡核苷酸标记不干扰引物延伸，引物在它们的5'末端与寡核苷酸 标记连接。“寡核苷酸标记”因此应理解是指通常少于50个核苷酸的核苷酸序列，其连接在 本发明功能上低效引物的5'末端。在一个实施方案中，标记长度是25-30个碱基。应理解 与关于正向和反向引物提供的定义一致，本文描述的寡核苷酸标记也可包含非核酸成分如 分离或显现标记，例如生物素、酶标记、荧光标记等。这使得通过非分子学方法快速简单分 离或显现标记的弓I物或扩增子。寡核苷酸标记与引物“可操纵地连接”应被理解是指那些区域的连接是使得标记 引物的如前所述的功能目的可以实现。关于这些区域连接所用手段及进一步地本发明寡核 苷酸引物结合其靶DNA区域所用的手段，它们相应于各种类型的相互作用。为此，“相互作 用”应理解是指任何形式的相互作用如互补核苷酸碱基对之间的杂交或者其它一些形式的 相互作用如在引物分子的任何核酸或非核酸部分或 标记分子与任何其它核酸或非核酸分 子如靶分子、显现手段、分离手段等之间形成键。这种类型相互作用可通过形成键例如但非 限于共价键、氢键、范德华力或任何其它相互作用机制而发生。优选地，相互作用发生在引 物和靶DNA区域之间时，所述相互作用是互补核苷酸碱基对之间的杂交。为了促进这个相 互作用，优选地，靶DNA被部分或全部单链化，时间和条件是足以使得与引物发生杂交。应理解本发明的寡核苷酸引物和标记不应限于本文举例的特定结构(线性、单链 分子)，而是可以延伸为实现本文描述的功能目的的任何合适结构构型。例如，可希望所有 或部分寡核苷酸是双链的，包含环区域(如发夹弯曲)或采取开环构象形式，即核苷酸引物 形状基本上是环状但其末端区域不连接。促进核酸引物与靶DNA的相互作用可以通过任何合适方法进行。这些方法是本领 域技术人员熟知的。为此，应理解针对标记的引物可以在任何合适时间点掺入反应试管中。 例如，其可以在最初扩增循环开始之前掺入，即与正向和反向引物组一起，或者其可以随后 掺入到最初2个扩增循环中。在每种情况中，标记区引物仅在掺入标记区的扩增子产生后 有功能，如前所述。实现引物指导的扩增的方法也是本领域技术人员熟知的。在优选的方法中，所述 扩增是聚合酶链反应，NASBA或者链置换扩增。最优选地，所述扩增是聚合酶链反应。使用来自前一个扩增的产物作为后一个反应的模板进行连续核酸扩增的方法，也 是本领域技术人员熟知的。在另一个优选的方法中，例如产生图3-12所示结果的方法，可 以进行瓶颈扩增以产生感兴趣DNA序列的选择性扩增，所述DNA序列已通过之前的瓶颈PCR 或之前的非选择性PCR产生。本领域技术人员理解可以进行连续瓶颈PCR。因此提供了扩增感兴趣的DNA区域的方法，所述方法包括
⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品。优选地，所述感兴趣的DNA区域已通过先前核酸扩增产生。在另一个优选实施方案中，所述感兴趣的DNA区域是基因或基因片段或者染色体 基因易位断裂点如BCR-ABL断裂点。关于实现本发明方法，应理解步骤⑴和(iii)的引物可以在前2个扩增循环之 前同时加入反应溶液中，或者步骤(iii)的引物可以在第一个和第二个扩增循环后导入。 这取决于本领域技术人员如何进行PCR反应。例如，为便于使用，经常希望能够在一个试管 中进行全部反应。然而，可以使用实现本发明步骤的任何其它方法。“样品”应理解是指生物学或非生物学样品。非生物学样品的例子包括例如合成产 生的核酸群体的核酸产物。“生物学样品”应理解是指衍生自动物、植物或微生物(包括微 生物培养物)的生物学材料的任何样品，如但非限于细胞材料、血液、粘液、粪便、尿液、组 织活检样本，导入动物体内随后取出的液体(例如在肺灌洗后从肺中抽出的盐溶液或者从 灌肠中取出的溶液)，植物材料或者植物繁殖材料如种子或者花或者微生物集落。根据本发 明方法测试的生物学材料可以直接测试或者可能在测试前需要一些形式的处理。例如，活 检样品在测试前可能需要勻浆或者可能需要切片以用于原位测试。另外，当生物学样品不 是液体形式时，(如果这种形式是测试所需的)，可能需要添加试剂如缓冲剂以移动样品。如果靶DNA存在于生物学样品中，则生物学样品可以直接测试或者存在于生物学 样品中的全部或一些核酸材料可在测试前被分离。在测试前预处理靶核酸分子是在本发明 范围内，例如失活活病毒或者在凝胶上电泳。还应理解生物学样品可以是新鲜采集的或者 其可以在测试前被储存(例如通过冷冻)或者在测试前另外处理(如通过培养)。使样品“接触”引物应理解为促进引物与样品的混合从而可以发生相互作用(例 如杂交)。实现这个目的的手段是本领域技术人员熟知的。选择何种样品最适合根据本文方法测试取决于情况的性质，如被监测状况的性 质。例如，在一个优选的实施方案中，瘤形成状况是分析主题。如果瘤形成状况是白血病，则 血样、淋巴液样品或骨髓吸出物会提供合适的测试样品。当瘤形成状况是淋巴瘤时，淋巴结 活检或血样或骨髓样品可能提供用于测试的合适组织来源。还需要考虑是否在监测瘤形成 细胞的原始来源或者是否监测转移的存在或其它形式的从原始点的瘤形成的扩散。为此， 可能希望采集和测试来自一个哺乳动物的一些不同样品。对于任何给定检测情形选择合适 样品是本领域技术人员的技能。术语“哺乳动物”当用于本文时包括人类、灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪、 驴)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、陪伴动物(例如狗、猫)和捕获野生动物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，哺乳动物是人类或实验室试验动物。更优选哺乳动物是 人类。如前所述，本发明方法优选地作为连续扩增循环系列进行。为此，在步骤(ii)需 要最少2个扩增循环以实现扩增子产生，所述扩增子适合用于利用低效引物的寡核苷酸标 记的引物和保留效率的原始引物进行的扩增。但是，应理解本发明方法可以设计为在实现 与寡核苷酸标记的引物接触之前进行3或更多个扩增循环。或者，如果本发明方法的所有 试剂在开始前均导入反应试管，则在步骤(iv)的基于标记的扩增变得有效之前可不发生 两个以上扩增循环。还应理解，甚至在同一 PCR之内，每个扩增循环可产生新的扩增子，其 然后适于后续的基于标记的扩增。尽管本发明方法已设计为使得扩增轮次可以直接在前一轮扩增的扩增产物上连 续进行，这不应被理解为限制是否任何额外步骤被本领域技术人员掺入，如富集/选择步 骤。例如，在第一轮扩增后可以寻求选择或富集希望的扩增子及之后仅在该材料上进行第 二轮扩增。可以用于选择或富集的方法包括(i)基于与引物连接的独特标记的选择步骤。例如，引物之一的生物素化提供了鉴 别和分离通过正向或反向引物延伸产生的扩增子的手段。汇集(flooding)具有生物素化 引物的扩增产物，所述引物可以作为探针以鉴别感兴趣的扩增子，生物素化可以提供分离 那些扩增子的基础。通过保证本发明引物组的每一个均包含独特标记，可以以显著特定性 选择出仅感兴趣的特定扩增子。具体地，本领域技术人员会寻求排除由正向引物扩增但没 有随后被反向引物扩增的扩增子。(ii)在凝胶上对产物电泳并仅切离很可能相关的一定条带或区域，随后将它们进 一步扩增。当在第二个扩增循环后凝胶上存在条带时，如果测序有困难，可以尝试通过将该 产物切离凝胶并用单独的引物和/或较小的引物集合进行一系列PCR反应而进行清理。尽管本发明方法可以被改变以包括任何这种额外步骤，但是本发明方法的一个独 特优势是其被设计用于使不相关扩增子产生最小化，由此使实施富集或选择步骤的需要最 小化。然而，根据特定情况，掺入这种步骤可能是有用的。在另一个实施例中，希望改变本发明方法以各种方式组合适应本发明方法的一或 多个扩增和一或多个其它扩增步骤，以增加特异性及促进希望产物的分离。图6和11示 出实验结果，其中1个标准PCR后接3轮瓶颈PCR。图7示出实验结果，其中2轮标准PCR 后接瓶颈PCR的2个循环。图9、10和12示出实验结果，其中1个标准PCR后接2轮瓶颈 PCR。还可以交替步骤及瓶颈PCR的循环。因此，可以通过任何合适手段优化感兴趣序列的 扩增，如增加方法第二阶段的PCR循环数或者进行后续PCR或其它形式扩增。所述方法也 可以重复应用以提供感兴趣序列的进一步富集和扩增至希望程度。显示经重复使用所述方 法得到的感兴趣序列的进行性富集的例子见图5和11 ；用数据进行的计算提示用于这些实 验的第2和3轮的低效引物的效率大约是最大值的1%。这些不同实验设计是本领域技术 人员理解的。提供扩增感兴趣合适区域的有效手段可具有一系列应用，包括但非限于特征在于 特定基因序列的疾病状况的诊断和/或监测，感兴趣基因区域的鉴定或分析，DNA断裂点区 域的鉴别或鉴定，以及感兴趣基因序列的分离，其中仅在感兴趣基因序列一个末端的核苷 酸序列是已知的或者可以推导的。
本发明另一个方面涉及扩增感兴趣的DNA区域的方法，所述方法包括⑴使DNA样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核 苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的DNA样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的DNA与针对互补于步骤⑴的寡核苷酸标记的序列的 部分或全部序列的引物接触；(iv)扩增步骤(iii)的DNA样品；及(v)分离和/或分析所述扩增的DNA。本发明进一步通过下述非限制性实施例描述。实施例1用瓶颈PCR进行BCR-ABL DNA断裂点扩增用BCR和ABL特异性引物在4轮PCR筛选中扩增BCR-ABL DNA断裂点。设计了 6 个BCR特异性引物及282个ABL特异性引物分别跨越BCR(3. 2kb)和ABL(140kb)DNA的主 要断裂点区域。第一轮PCR扩增在25iU中进行，所述25 yl含有50ng单一 BCR特异性引物， lOOng所有282个ABL特异性引物(每个引物350pg)，50ng Tag A，50ng基因组DNA，50mM KCl,2mM Tris HC1 (pH8. 4)，1U Platinum Taq DNA 聚合酶(Invitrogen)，5mM MgCl2 和 300 u M每种dUTP、dATP、dGTP和dTTP。扩增条件是95°C 4分钟；然后6个循环的97 °C 1 分钟、65°C 1分钟，每2个循环温度降低1°C、72V 1分钟；然后是4个循环的96°C 30秒、 62°C 1分钟，前2个循环后温度降低1°C、72°C 1分钟；然后10个循环的94°C 30秒、61°C 1 分钟、72°C 1分钟。ABL特异性引物在引物5'末端具有标记区域(Tag A)，其不与ABL DNA互补。在 第一轮PCR中，附着于ABL特异性引物的标记序列掺入扩增子中，使得DNA进一步在后续轮 的PCR中扩增，使用BCR引物与TagA弓丨物而非ABL特异性反向引物。每轮PCR使用不同的 标记序列。第二、第三和第四轮PCR扩增25iU中进行，其含有前一轮PCR反应混合物的稀释 液(稀释倍数为100)，50ng单一 BCR特异性嵌套式引物，500pg嵌合Tag引物(在第二、第 三和第四轮中分别为Tag A/I，I/l，l/2)，50ng单一Tag引物(第二、第三和第四轮中分别为 Tag 1,1,2) ,50mM KCl,2mMTris HC1 (pH8. 4)，1U Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)， 5mM MgCl2和300 u M每种dUTP、dATP、dGTP和dTTP。扩增条件是95°C 4分钟；然后20个 循环的94°C 30秒，65°C 1分钟，72°C 1分钟。实施例2用瓶颈PCR进行PML-RAR a DNA断裂点扩增用瓶颈PCR从急性早幼粒细胞白血病患者分离PML-RARa易位断裂点。患者DNA 用多个RARa引物和单个PML引物扩增，然后进行2轮瓶颈PCR。扩增的DNA在2%琼脂糖 凝胶上电泳(图9a)。为证实已分离断裂点，用断裂点序列设计跨越断裂点的RARa和PML引物，用这些引物扩增患者DNA—轮(图9b)。还确定了图9a凝胶上所示的扩增条带的序 列(图9c)。实施例3用简并引物及瓶颈PCR的基因步移用50ng基因特异性正向引物、50ng各种简并反向引物之一和50ng反向标记引物 进行沿3个基因APC、BRCA1和myocillin的基因步移。简并反向引物在3'末端具有4_6 个随机正常残基，随后3-6个简并残基，随后12-18、通常18个正常残基的随机标记序列。 最常用简并引物在3'末端具有5个固定碱基，随后是5个简并碱基，随后18个碱基的标 记序列(5' TGCTAGGATCCAAGGNNNNNATTCG3‘ (SEQ ID N 0:1))。反向标记引物具有与简并 反向引物上的标记相同的序列。5个PCR循环(在35°C退火5分钟)，随后15个循环(在 55°C退火3分钟)。PCR 在 25ii 1 体积中进行，具有 50ng 总 DNA，5mM MgCl2，0. ImMdUTP，0. 2mM dTTP 和 0. 3mM 每种 dCTP、dATP 和 dGTP,和 1 单位 PlatinumTaq 聚合酶(Invitrogen)。引物来自 Sigma-Aldrich (St. Louis，M0，USA)或者 Invitrogen (Carlsbad，CA，USA)。PCR 循环条件典 型涉及在94°C变性30秒，如上所述退火，及在72°C延伸90秒。进行1-3轮的瓶颈PCR，通常来自上述最初一轮的扩增材料的1/100稀释液在第一 个瓶颈PCR中扩增，来自前一轮的扩增材料的1/1000稀释液用于每一后续轮次。每轮PCR 进行20个循环，但进行电泳时(在这种情况中其进行至完成)，进行30-40个循环。每个 PCR含有50ng嵌套式正向引物，0. 5ng杂合反向引物和50ng标记反向引物。杂合反向引物 由具有与前一轮PCR的标记引物相同的序列的3'末端及具有新标记序列的5'末端组成。 标记反向弓丨物具有与新标记序列相同的序列。PCR产物经凝胶电泳检查，分离分开的条带并通常用正向引物和用于最后扩增的 标记引物测序。在一些涉及基因步移的实验中，测序完整扩增产物，而无论是否一个或多个 分开的条带被显现。在一个涉及基因步移的实验中，测序反应用最初测序引物的732bp和 1302bp下游的引物进行。实施例4图13提供了适合用于本发明方法中的引物和标记序列的例子。本领域技术人员理解本文所述本发明适合进行不同于特别描述的变异和修饰。应 理解本发明包括所有这种变异和修饰。本发明还包括说明书中指出的所有步骤、特征、组合 物和化合物，其逐个或集合的形式，及任何两个或多个所述步骤或特征的任何及全部组合。参考文献Cheng et al. ,1994, Effective amplification of long targets from cloned inserts and humangenomic DNA. Proc Natl Acad Sci.91 :5695_5699Sambrook and Russel,2001, Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd Ed. ColdSpring Harbor, N. ff. :Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8 :In vitroAmplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction.Nailis H, Coeny e T, Van Ni euwerburgh F, Deforce D, Nelis HJ(2006). "Development andevaluation of different normalization strategies for gene expression studies in Candidaalbicans biofilms by real-time PCR". BMC MolBiol. 7 25 Nolan T, Hands RE, Bustin SA(2006). "Quantification of mRNA using real-time RT-PCR". Nat.Protoc. 1 :1559—158权利要求
扩增感兴趣核酸区域的方法，所述方法包括(i)使核酸样品接触(a)针对所述感兴趣区域的一或多个正向引物；及(b)针对所述感兴趣区域的一或多个反向引物其中组(a)或组(b)引物是功能上低效的并在它们的5’末端可操纵地连接寡核苷酸标记；(ii)通过至少两个扩增循环扩增步骤(i)的核酸样品；(iii)将步骤(ii)的扩增的核酸与针对互补于步骤(i)的寡核苷酸标记的序列的部分或全部序列的引物接触；及(iv)扩增步骤(iii)的核酸样品。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸是DNA。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(iv)的所述扩增的核酸被分离和/或分析。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述感兴趣的核酸区域是已通过扩增方法产生的 DNA分子的区域。
5.权利要求4的方法，其中所述扩增方法是PCR。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤(ii)和(iv)的扩增方法是PCR、NASBA或链置换扩增。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述引物是4-60个核苷酸长，10-50个核苷酸长， 15-45个核苷酸长，20-40个核苷酸长或25-35寡核苷酸长。
8.权利要求7的方法，其中所述引物是26、27、28、29、30、31、32、33或34个核苷酸长。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述引物通过如下方法被赋予功能上低效(i)降低所用引物浓度；(ii)降低引物杂交时间；(iii)增加杂交反应发生所需的温度；(iv)修饰引物长度； (ν)改变引物解链温度；(Vi)在杂交/引物延伸阶段中引入离液剂；(Vii)将引物竞争性抑制剂如其互补序列导入反应中；(Viii)将核苷酸错配导入引物序列；(ix)使用引物类似物，其在杂交中与氢键合有效性较差(hydrogen-bondless effectively)0
10.权利要求1-9任一项的方法，其中被低效化的引物组是能与非靶DNA区域混杂杂交 的引物组。
11.权利要求10的方法，其中所述引物是简并引物。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述感兴趣的区域是基因组DNA的区域、基因、 基因部分、DNA重组产物或染色体基因易位断裂点。
13.权利要求12的方法，其中所述染色体基因易位断裂点是BCR-ABL。
14.权利要求12的方法，其中所述染色体基因易位断裂点是PML-RARα。
15.权利要求13的方法，其中使用1-20个针对BCR的正向引物和250-350个针对ABL的反向引物。
16.权利要求15的方法，其中使用12个针对BCR的正向引物和282个针对ABL的反向 引物。
17.权利要求15的方法，其中使用6个针对BCR的正向引物和24个针对ABL的反向引 物。
18.权利要求15的方法，其中使用1个针对BCR的正向引物和282个针对ABL的反向 引物。
19.权利要求15的方法，其中使用6个针对BCR的正向引物和270-310个针对ABL的 反向引物。
全文摘要
本发明总体涉及扩增感兴趣的核酸区域的方法，更特别地涉及用PCR方法扩增感兴趣的核酸区域的方法，所述PCR方法设计为用于使从结合非感兴趣的特异性区域的核酸区域的引物的扩增子产生最小化。本发明方法基于下述的确定，即通过使正向引物或反向引物的功能性低效，不相关核酸区域的扩增速率能相对于感兴趣区域的扩增而言降低。提供感兴趣的核酸区域的选择性扩增的手段可具有一系列应用，包括但非限于特征在于特定基因序列的疾病状况的诊断和/或监测，感兴趣基因区域的鉴定或分析，DNA断裂点区域的鉴别或鉴定，感兴趣基因序列的分离，其中仅感兴趣基因序列一个末端的核苷酸序列是已知的。
文档编号C12Q1/68GK101849022SQ200880112859
公开日2010年9月29日 申请日期2008年10月2日 优先权日2007年10月22日
发明者A·A·莫利 申请人:莫诺匡特私人有限公司