专利名称：：从基因组dna中快速扩增目的基因的方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种关于基因克隆的方法。
背景技术：
：目前，扩增目的基因常用方法有两种PCR扩增和基因合成。传统的PCR扩增比较繁琐，因为基因组中含有内含子，以及一些特殊基因的低拷贝数，加上其他一些不能确定的因素，要从基因组DNA中直接扩增获得目的基因几乎是不可能的，所以一般都是经过组织RNA提取，反转录合成cDNA后应用传统的PCR技术扩增出目的基因。而其中的RNA提取操作过程要求严格，且很容易失败；加上一些含有目的基因的组织很难得到，所以此种方法有一定的局限性。应用化学合成的方法虽然可以得到目的基因，但是如果所需基因片段较长合成费用将会很昂贵。随着人类基因组计划以及一些真核生物基因组测序的完成，从基因组数据库查找所需基因的信息已不是难事，利用各种PCR技术扩增或是合成目的基因也已成为研究热点ο
发明内容本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种快速从基因组DNA中扩增目的基因的方法。为了实现上述目的，采用以下技术方案从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其包括如下步骤①基因组DNA制备；②设计基因外显子的扩增引物；③外显子扩增，分别扩增各个外显子；④基因片段扩增。进一步的技术方案是，设计基因外显子的扩增引物的具体过程是，先查到基因的外显子序列信息，针对每个外显子分别设计重叠引物(设计方式遵从一般引物设计规则即可)。第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物分别设计酶切位点。外显子扩增的扩增程序选用touch-downPCR程序。再进一步的技术方案是，基因片段扩增的具体过程是，将步骤③中扩增得到的所有外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物扩增得到目的基因片段，扩增程序选用touch-downPCR程序。本发明即是通过一种特殊的引物设计方法，首先从基因组中扩增出所需的外显子，纯化后混合，再用两端引物，在Touch-down的程序中扩增出所需的目的基因。这种基因拼接的方法，避免了RNA制备、反转录合成cDNA的过程，因此可以快速准确的在数小时内完成基因克隆，同时应用这种方法可以克隆任一知道序列信息的cDNA序列，且扩增长度不受限制。申请人已利用该技术成功克隆长度1540bp的人a-葡萄糖苷酶基因片段及长度1365bp的人MICA基因，具体过程在后续具体实施方式中详述。图1为外显子扩增引物设计原理示意图。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明的基因扩增方法作进一步的具体说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例一人a_葡萄糖苷酶基因片段扩增1.人基因组DNA的制备健康人的血液样本由四医大儿科实验室惠赠，全血基因组DNA提取试剂盒(溶液型)购自长沙联博志达生物技术公司。基因组DNA提取方法按照试剂盒说明操作，所得人基因组DNA于_20°C保存备用。2.人a-葡萄糖苷酶基因第25到第36个外显子的扩增引物设计根据查到的人a_葡萄糖苷酶基因的外显子序列信息(NM_004668.2)，针对12个外显子分别设计重叠引物，具体操作如图1所示(仅为原理示意图)12个外显子设计引物序列如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中Hgluex25F,Hgluex36R两引物(即第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物)分别设计相应的酶切位点以方便克隆到后面用到的载体中，本试验设计的酶切位点分别为XhoI和SacI。3.外显子扩增应用上述引物先分别扩增12个外显子，体系如下50μ1体系ddH2037μ125mMMg2+3μ110XPCRbuffer5μ1IOmMdNTP1μ1引物1Ιμ引物21μ1模板1.5μ1Pfu酶0·5μ1引物1和引物2分别指待扩增外显子的正向引物和反向引物，模板即步骤1中所制备的基因组DNA。扩增程序均选用touch-downPCR程序。即94°C5min预变性，退火温度从64-54°C每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94°C30s，退火30s，延伸温度为72°Clmin)，然后于54°C循环25圈，72°C延伸lOmin。4.人a-葡萄糖苷酶基因片段(2860bp_4399bp)扩增将上步扩增得到的12个外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用引物Hgluex25F,Hgluex36R扩增得到人a_葡萄糖苷酶基因片段(2860bp_4399bp)。反应体系同上，扩增程序选用touch-downPCR程序。即94°C5min预变性，退火温度从64_54°C每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94°Clmin，退火lmin，延伸温度为72°C2min)，然后于54°C循环25圈，72°C延伸lOmin。实施例二人MICA基因的克隆1.人基因组DNA的制备人基因组DNA的制备方法同实施例一。2.人MICA基因克隆的引物设计根据查到的人a_葡萄糖苷酶基因的外显子序列信息(NM_000247.1)，针对6个外显子分别设计重叠引物，设计原理如附图1所示。6个外显子设计引物序列如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.外显子扩增应用上述引物先分别扩增6个外显子，体系如下50μ1体系ddH2037μ125mMMg2+3μ110XPCRbuffer5μ1IOmMdNTP1μ1引物1Ιμ引物21μ1模板1.5μ1Pfu酶0·5μ1引物1和引物2分别指待扩增外显子的正向引物和反向引物，模板即本实施例步骤1中所制备的基因组DNA。扩增程序均选用touch-downPCR程序。即94°C5min预变性，退火温度从62-52°C每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94°C30s，退火30s，延伸温度为72°Clmin)，然后于52°C循环25圈，72°C延伸lOmin。4.人MICA基因(1365bp)扩增将上步扩增得到的6个外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用引物HMICAexlF,HMICAex6R扩增得到人MICA基因。反应体系同上，扩增程序选用touch-downPCR程序。即94°C5min预变性，退火温度从62-52°C每降一度为一循环共10个循环(其中解链温度为94°Clmin，退火lmin，延伸温度为72°C2min)，然后于54°C循环25圈，72°C延伸IOmin0上述两个是实例中touch-downPCR程序的温度和时间参数可以根据实际需要调iF.ο以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案。不脱离本发明精神和范围的任何修改或局部替换，应涵盖在本发明的权利要求范围当中。权利要求从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，包括如下步骤①基因组DNA制备；②设计基因外显子的扩增引物；③外显子扩增，分别扩增各个外显子；④基因片段扩增。2.根据权利要求1所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，设计基因外显子的扩增引物的具体过程是，先查到基因的外显子序列信息，针对每个外显子分别设计重叠引物。3.根据权利要求2所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物分别设计酶切位点。4.根据权利要求3所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，外显子扩增的扩增程序选用touch-downPCR程序。5.根据权利要求3所述的从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其特征在于，基因片段扩增的具体过程是，将步骤③中扩增得到的所有外显子胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正向引物扩增得到目的基因片段，扩增程序选用touch-downPCR程序。全文摘要本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种关于基因克隆的方法。基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其包括如下步骤①基因组DNA制备；②设计基因外显子的扩增引物；③外显子扩增，分别扩增各个外显子；④基因片段扩增。本发明即是通过一种特殊的引物设计方法，首先从基因组中扩增出所需的外显子，纯化后混合，再用两端引物，在Touch-down的程序中扩增出所需的目的基因。这种基因拼接的方法，避免了RNA制备、反转录合成cDNA的过程，因此可以快速准确的在数小时内完成基因克隆，同时应用这种方法可以克隆任一知道序列信息的cDNA序列，且扩增长度不受限制。文档编号C12N15/10GK101798570SQ201010124950公开日2010年8月11日申请日期2010年3月9日优先权日2010年3月9日发明者刘磊,支旭勃,王俊,郭海荣申请人:珠海市英平生物科技有限公司