专利名称：一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种稳定诱导人脐带间充质干细胞的方法。
背景技术：
神经系统创伤的修复在临床上仍然是一大亟待解决的难题。作为神经缺损修复黄金标准的自体神经移植存在着来源有限，供区遗留感觉障碍等缺点。干细胞具有来源丰富，分离培养容易，体外增殖能力强，具有多向分化潜力的特点，近年来已成为组织工程产品种子细胞研究的热点。研究发现，胚胎干细胞(ESCs)，神经干细胞(NSCs)、骨髓基质干细胞(BMSCs)、脐血干细胞等均具有向神经细胞分化的潜能，在移植于动物模型后能改善其神经功能，可作为治疗神经系统疾病的种子细胞。然而，ESCs 尚存在定向分化和纯化的技术障碍，且面临众多伦理、法律方面的问题，移植后有形成畸胎瘤的可能，应用受到一定限制。NSCs也受到取材困难、不易获得及伦理、法律方面问题的影响。虽然自体BMSCs在体内或体外均可诱导成为类许旺细胞，自体移植既可解决许旺细胞来源问题，促进神经再生，又符合医学伦理学的规范，但BMSCs细胞采集过程对供者造成痛苦，分离细胞量有限，且随着年龄增长其干细胞数量和增殖能力也显著下降，较难满足临床需要。脐血MSC含量稀少，分离困难，不适合规模化操作，其采集也面临着伦理学的限制。近来研究表明，人脐带富含间充质干细胞(HUCMSCs)，是一个可能优于骨髓和其它组织的种子细胞源泉，能够克服以上所有的缺陷，具备以下优点(1)来源充足，取材方便， 作为一种分娩废弃物，其采集不存在任何伦理问题；(2)每根脐带的长度在40 60cm，细胞数量丰富，增殖能力强；C3)分离出的MSC免疫表型不成熟，具有较弱的免疫细胞抗原性。HUCMSCs具有与BMSCs相似的干细胞特性，具有良好的自我更新和多向分化增殖能力， 因此可在较短的时间内可获得更多的细胞数量，以满足临床需求。研究表明HUCMSCs在体外可被诱导为神经元样或神经胶质样细胞，移植治疗大鼠脊髓损伤或帕金森病，可在体内微环境内向神经元和星形胶质细胞分化，为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的种子细胞来源。将干细胞诱导为类神经细胞的传统方法是化学诱导法，即干细胞在各种诱导剂作用下，可表现出神经细胞形态及特异性标志物。但诱导剂可能影响细胞分裂和存活，引起细胞收缩并提高细胞对抗体的免疫活性，是否能用于临床还需要进一步的实验证实。近来发现，将体细胞与干细胞共培养，通过体细胞分泌的营养因子等因素，可诱导干细胞定向分化，是一项较简便经济的方法。将大鼠许旺细胞与大鼠BMSCs或人胚胎神经嵴细胞共培养， 发现上述两种干细胞均可表达NeStin，GFAP等神经细胞表面标志。这些实验为将HUCMSCs 向许旺细胞定向分化提供了新方法。至今为止，尚未有将HUCMSCs通过化学或共培养的方法诱导为类神经细胞，并应用于神经损伤修复研究的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法。
本发明提供了一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，该方法包括(1)将脐带间充质干细胞与许旺细胞用0. 4μ m孔径的Transwell小室隔离共培养，所用培养液为许旺细胞培养液；(2)每三天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。所用的干细胞通常为脐带间充质干细胞，两周时间可以是10-15天。所述的隔离共培养是小室内放置许旺细胞，下层培养板放置脐带间充质干细胞。所述的隔离共培养也可以是小室内放置脐带间充质干细胞，下层培养板放置许旺细胞。所用的培养液中含有福司柯林和神经生长因子。其中，福司柯林的浓度通常是 2-14 μ m,神经生长因子的浓度通常是10-200ng。所用的脐带间充质干细胞可以取脐带，通过下述方法获得将脐带从手术台上取下，无菌下浸入DMEM/10% FBS培养基中；PBS充分洗去血液，去除脐静脉及动脉，将脐带剪碎至Imm3大小组织块，移至0. 复合胶原酶NB4和0. 1 %透明质酸酶混合液中，37°C持续振荡消化池，然后加入3倍勻浆量的PBS稀释，继续振荡30分钟后，细胞滤器过滤，离心、重悬、计数。细胞接种于培养皿中，置于37°C，5% CO2孵育箱培养。培养4 后更换培养基， 去掉未贴壁细胞。以后每2天换液1次，至细胞融合传代。所用的小鼠许旺氏细胞可通过下述方法获得取出生2周龄GFP C57BL6小鼠，脱臼处死后，放入75%酒精浸泡10分钟，在无菌条件下，取小鼠双侧坐骨神经。置于盛有2% 复合胶原酶NB4的15ml离心管中消化，2小时后，离心去上清，加入许旺细胞培养液重悬细胞，计数种植。待培养4 细胞融合后，吸弃培养液，加入0. 复合胶原酶NB4，消化30分钟后，轻轻振荡，收集细胞，离心，弃上清，用培养液重悬细胞，计数种植，4 后再重复上述操作一次。细胞表面分子标志检测如下取脐带间充质细胞，去掉培养液，用PBS洗1遍，再用0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集细胞，PBS洗涤后制成浓度为lxl06/200ul的单细胞悬液。分别加入鼠抗人 CD90-PE、CD105-PE、CD73-APC、CD34-FITC、CD14-FITC、CD19-FITC、 HLA-DR-PE, CD44-FITC 抗体，对照组为 IgG1Ii-FITC, IgG2bK_PE、IgG1Ii-APC15 单抗各 5ul，最后4°C孵育30min，流式细胞仪检测。具体而言，本发明的高效诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，操作步骤如下一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，其特征是由下述步骤构成(1)将脐带间充质干细胞与许旺细胞用0. 4μ m孔径的Transwell小室隔离共培养。其中，包括小室内放置许旺细胞，下层培养板放置脐带间充质干细胞，或小室内放置脐带间充质干细胞，下层培养板放置许旺细胞。其所用培养液为许旺细胞培养液(含 2-14 μ mforskolin,10_200ng heregulin-β _1).(2)每三天全量或者半量换一次液，共培养至两周即可得到类神经细胞。本发明应用隔离共培养的方法，复合胶原酶和透明质酸酶混合后消化脐带可以大量分离脐带间充质细胞，经传代至第3代就可以获得高纯度的间充质干细胞。使脐带间充质干细胞诱导分化为了神经细胞，细胞分化率达到70%以上。经过共培养两周后，其细胞表达NF-200，nestin，β-Ill-tubulin等神经细胞特异性标记率达到70 80%。如图2和图3所示。
图1是培养得到的细胞镜下图。图2是培养一周后的细胞镜下图。其中，A4:共培养Iw后，部分细胞表现出神经元的形态，且B-III-bubulin阳性。B4 共培养一周后，形态似神经元，GFP阳性的一个细胞。 C4:共培养两周后，细胞形态非常接近神经元，伸出细长的突起，且NF-200标记阳性。图3是不同时间点神经元特异性标志的表达情况。1 5时间点分别为8h，Mh， 72h，lw,2w.可以看出，随着共培养时间的推移，Nestin神经前体细胞标记表达率在24h时升高，随后逐渐降低，符合细胞不断成熟过程。而其它成熟神经元特异性标记率呈逐渐增高的趋势。
具体实施例方式实验步骤一、材料和方法脐带取自上海市第一人民医院妇产科足月剖宫产婴儿，均经父母授权同意。二、主要试剂和因子2周龄C57BL/6小鼠10只(上海中科院试验动物养殖中心)、DMEM培养基 (Gibco, USA)、复合胶原酶 NB4(Serva，Germany)、胎牛血清(FBS =Hyclone, Australia)、 磷酸盐缓冲液(PBS，PH7. 2)、许旺细胞培养液(SCCM，khwann cells culture medium含 IOngheregulin-β -U2uM forsklinUO % FBSU00u/ml 青霉素、lOOu/ml 链霉素和高糖 DMEM)。兔抗人 NF-200、Β-tubulinIII、GFAP, Nestin (Milipore, USA)流式抗体购自(BD， USA)。三、分离脐带间充质细胞将脐带从手术台上取下，无菌下浸入DMEM/10% FBS培养基中，4°C保存；超净台内取出脐带，PBS充分洗去血液，去除脐静脉及动脉，将脐带剪碎至Imm3大小组织块，移至 0. 复合胶原酶NB4和0. 透明质酸酶混合液中，37°C持续振荡消化池，然后加入3倍勻浆量的PBS稀释，继续振荡30分钟后，细胞滤器过滤，离心、重悬、计数。细胞接种于培养皿中，置于37°C，5%C02孵育箱培养。培养4 后更换培养基，去掉未贴壁细胞。以后每2 天换液1次，至细胞融合传代。四、分离、纯化小鼠许旺氏细胞取出生2周龄GFP C57BL6小鼠，脱白处死后，放入75%酒精浸泡10分钟，在无菌条件下，取小鼠双侧坐骨神经。置于盛有2%复合胶原酶NB4的15ml离心管中消化，2小时后，离心去上清，加入许旺细胞培养液重悬细胞，计数种植。待培养4 细胞融合后，吸弃培养液，加入0. 1 %复合胶原酶NB4，消化30分钟后，轻轻振荡，收集细胞，离心，弃上清，用培养液重悬细胞，计数种植，4 后再重复上述操作一次。
五、细胞表面分子标志检测取第3代脐带间充质细胞，去掉培养液，用PBS洗1遍，再用0. 25%胰蛋白酶-EDTA 消化，收集细胞，PBS洗涤后制成浓度为lX106/200ul的单细胞悬液。分别加入鼠抗人 CD90-PE、CD105-PE、CD73-APC、CD34-FITC、CD14-FITC、CD19-FITC、HLA-DR-PE, CD44-FITC 抗体，对照组为IgGA-FITC、IgG2bK-PE、IgG^-APC0单抗各5ul，最后4°C孵育30min，流式细胞仪检测。六、向许旺细胞诱导分化1.接触共培养法按照许旺细胞和脐带间充质细胞1 1(5χ103 5xl03)比例种植在6孔板中，置入37°C CO2培养箱中，每隔一天半量换液。在8h、Mh、72h、lw,2w进行观察拍照，4 %多聚甲酸固定 30min，行免疫荧光鉴定，检测 Nestin、GFAP、NF-200、B_tubulinIII、MAB1580 表达情况。对照组为单纯培养的脐带间充质细胞。2.非接触共培养法在Transwell小室中种植脐带间充质细胞，下层6孔板中种植经纯化的许旺细胞，在8h，24h, 72h，lw，2w不同的时间用免疫荧光进行检测Nestin、GFAP, NF-200、 B-tubulinIII、MAB1580。对照组为单纯种植在Transwell小室中的脐带间充质细胞。七、免疫荧光鉴定对需要鉴定的细胞，用PBS洗2次后，4%多聚甲醛固定15min，0. 1 % Tritonx-100 破膜lOmin，PBS洗三次，5min/次，山羊血清室温孵育15min，加入一抗4°C过夜，PBS清洗，加二抗室温孵育1小时，加DAPI染核，一抗分别为兔抗鼠SlOOd 200)，P75，兔抗人 GFAP(1 200)、Nestin(l 200)、NF-200 (1 200)、B-tubulinlll (1 200)、 MAB1580(1 200)荧光显微镜下拍照，随机取6张IOOx视野相片计数，计算许旺细胞纯度及类神经元表达各类神经元特异标志的比率。实验结果一、脐带间充质细胞的分离、纯化及扩增细胞培养后，第二天即可见少量形态各异的贴壁细胞，散在分布。一周后，贴壁细胞形成集落，细胞形态随着传代逐渐均一，为两个或三个突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞，少量为多突起的星形细胞。细胞折光性好，核仁明显。成纤维样细胞增殖旺盛，至两周左右可以达到80%融合。二免疫表型测定对第3代脐带间充质干细胞行FACS检测。脐带间充质细胞表达⑶105、⑶73、⑶90 和 CD44 不表达 CD34、CD14、CD45、CD19 及 HLA-DR。CD105, CD90, CD73 是间充质细胞相关抗原，⑶14是单核巨噬细胞表面标志，⑶34和⑶45是造血干细胞阳性标记，⑶44为细胞粘附分子，在细胞的贴壁过程中发挥重要的作用。本实验结果表明，脐带间充质细胞表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血系细胞、内皮细胞特异性标志。三脐带间充质细胞诱导分化为类神经元。1).诱导后细胞形态的变化共培养ai，24h，7a!，脐带间充质细胞形态均无明显变化。共培养一周后，脐带间充质细胞的胞体开始变圆，部分细胞伸出长长的突起，呈双极、 多极型，有些形成次级突起。多个细胞的突起有时互相连接呈网状。到两周时，细胞形态更加接近神经元，而对照组细胞形态无变化。2).神经元样细胞表达神经细胞特异性抗原标志情况3组不同代次的脐带间充质细胞，在共培养诱导他后，15. 3士3 % Nestin 阳性，24h 时阳性率达到 70士3 %，72h 后，Nestin+(8士2 % )，NF_200+(32士5 % )， B-III-tubulin+08 士 7% )。共培养Iw后，类神经元表达神经元特异标志情况为 NF-200+(42 士 5 % )，B-III_tubulin+(54 士 7 % )，GFAP+QO 士 3 %)，其诱导 2 周后为 NF-200+(70. 5士5% )，B-III-tubulin+(68. 1 士3% ) ,Nestin(4. 2士3% )，GFAP08士2% )。
权利要求
1.一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，其特征是包括下述步骤(1)将脐带间充质干细胞与许旺细胞用0.4μπι孔径的Transwell小室隔离共培养，所用培养液为许旺细胞培养液；(2)每三天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)中所述的隔离共培养是小室内放置许旺细胞，下层培养板放置脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)中所述的隔离共培养是小室内放置脐带间充质干细胞，下层培养板放置许旺细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)中所用的培养液中含有福司柯林和神经生长因子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是步骤(1)培养液中福司柯林的浓度是 2-14 μ m0
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是步骤(1)培养液中神经生长因子的浓度是 10-200ng。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的干细胞为脐带间充质干细胞。
全文摘要
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法。该方法将脐带间充质干细胞与许旺细胞用0.4μm孔径的Transwell小室隔离共培养，所用培养液为许旺细胞培养液；每三天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。本发明应用隔离共培养的方法，复合胶原酶和透明质酸酶混合后消化脐带可以大量分离脐带间充质细胞，经传代至第3代就可以获得高纯度的间充质干细胞。使脐带间充质干细胞诱导分化为了神经细胞，细胞分化率达到70％以上。其细胞表达NF-200，nestin，β-III-tubulin等神经细胞特异性标记率达到70～80％。
文档编号C12N5/0775GK102191217SQ20101012459
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者沈尊理, 祝加学, 秦金保 申请人:上海市第一人民医院