专利名称：一类针对目的基因Rig－G的高效siRNA分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学、细胞生物学、血液学领域。具体地说，本发明涉及一类能对目的基因Rig-G的表达进行高效干扰的小片段双链RNA分子。
背景技术：
急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性髓系白血病中一种临床表现较为凶险的亚型。我国医学界在国际上率先使用全反式维甲酸(ATRA)分化诱导治疗APL获得成功，成为肿瘤治疗史上一个全新的里程碑。为了阐明ATRA诱导APL细胞分化的机制，十多年来各国学者进行了大量的研究。但是迄今为止有关维甲酸的信号传导途径仍然是个迷。为了对这方面的研究有所突破，这些年来，我们上海血液学研究所一直致力于APL细胞分化过程中有关维甲酸受体靶基因的研究。
Rig-G基因是我们实验室利用差示PCR技术从急性早幼粒白血病细胞株NB4中克隆得到的一个可被维甲酸(ATRA)诱导表达的基因，在未经ATRA处理时，Rig-G在NB4细胞中的表达很低，几乎不能被检测到，而经ATRA处理12小时后，其表达水平明显上升，24小时后达到高峰，并可持续至72小时以后(见图1)。
通过酵母双杂交技术我们筛选到了一些能与Rig-G发生相互作用的蛋白，其中JAB1和PIAS3两个蛋白在细胞信号传导途径中具有重要作用，被确定为进一步研究的候选基因。深入研究Rig-G和JAB1以及PIAS3蛋白之间的关系，可以为阐明Rig-G的功能提供信息据文献报道，JAB1是AP-1蛋白的辅助激活因子。我们发现尽管c-Jun的转录活性可以被JAB1大大加强，但是随着Rig-G的加入，c-Jun的转录活性会逐渐减弱，且Rig-G对AP-1的这种抑制效应呈剂量依赖性，提示Rig-G可以通过和JAB1相互作用来抑制AP-1蛋白的转录活性(见图2)。
另据报道，JAB1还具有协助降解细胞周期抑制蛋白p27的功能，Western blot分析发现随着JAB1转染剂量的增加，p27的降解逐渐加剧，但是当有Rig-G与JAB1共转染时，这种加剧则被抑制，提示Rig-G具有抑制JAB1辅助p27降解的功能(见图3)。
已知JAB1是一种活跃的蛋白分子，能够在细胞核与细胞浆之间穿梭传递信号，分布呈弥散状态。我们发现当Rig-G与JAB1共同转染NIH3T3细胞时，JAB1蛋白的分布情况会发生改变，呈现为主要在细胞浆内分布，细胞核内的含量减少。我们认为JAB1蛋白在细胞内分布的改变可能是因为位于胞浆的Rig-G蛋白通过与JAB1的相互作用将部分JAB1滞留在细胞浆内所引起的，并进而影响到JAB1和c-Jun的结合，造成c-Jun与其对应的反应元件结合的稳定性降低，从而抑制AP-1蛋白的转录活性。这种Rig-G蛋白将JAB1部分滞留的现象同样可以用来解释Rig-G对JAB1辅助降解p27的干扰，通过延长p27的半衰期，增加其稳定性，阻碍细胞进入周期。
PIAS3是活化的STAT3的抑制因子。STAT3可以在白细胞介素6(IL-6)等细胞因子的刺激下，活化形成同二聚体[36]，PIAS3可以和活化的同二聚体发生相互作用，封闭STAT3与DNA结合的位点，从而抑制STAT3的转录激活活性。我们的研究发现Rig-G可以加强PIAS3对STAT3转录激活活性的抑制，且呈剂量依赖性(见图4)。
另外，我们还发现转染了Rig-G的NIH3T3细胞会被明显阻滞在G1期，而处于S期的细胞相应减少(见图5)。以上这些结果说明Rig-G似乎具有抑制细胞增殖，阻碍细胞凋亡的功能，与细胞从增殖周期退出趋向分化有着密切的关系，而且Rig-G的这种作用很可能是通过与JAB-1和PIAS3的相互作用来实现的。
由于维甲酸受体的靶基因很可能是细胞由增殖转向分化的开关基因，通过直接调控这些靶基因的表达，也许在不久的将来可以绕过维甲酸受体实现白血病的逆转，这对提高我国研究基因功能及其与疾病相关性方面的水平具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于进一步深入研究Rig-G基因在维甲酸传导途径中的作用。我们拟应用RNA干扰技术来抑制Rig-G基因的表达，希望通过建立Rig-G基因缺失的细胞模型，研究Rig-G对维甲酸诱导白血病细胞分化可能产生的影响，为阐明Rig-G生物学功能提供直接有力的证据。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的根据现有文献报道的RNAi实验设计基本原则，我们从Rig-G(目的基因Rig-G在Genbank的登陆号为U52513)的cDNA序列中，选定了8个长度为21个核苷酸的序列作为合成siRNA的候选位点。我们分别采用体外转录和构建siRNA表达载体pSilencer 3.1-H1(Ambion)的策略制备siRNA，为了检测所选位点对目的基因的沉默效率和沉默时相，我们将体外合成的siRNA或siRNA表达质粒与Rig-G表达载体(pEGFP-Rig-G)分别共转至两个不同的细胞系(293和cos-7)系统中进行实验，并分别用Western-blot(图6)和荧光显微镜(图7)分析检测GFP-Rig-G融合蛋白的表达水平。通过反复实验，目前我们已确定在8个候选位点中，有7个位点对目的基因有着不同程度的抑制效应，其中有3个位点效果明显，沉默效率可达90％以上；另有3个位点的沉默效率可达70％-80％；还有1个位点的沉默效率也可达50％-60％，我们的实验还显示虽然是瞬时转染，这些siRNA的沉默效果也可持续到72小时以上。
本发明所公开的一种针对目的基因Rig-G的高效siRNA，可以通过以下步骤制备得到(1)在目的基因的cDNA序列中选择位点，合成DNA模板(2)体外转录，合成RNA片段。
本发明又公开一种针对目的基因Rig-G的高效siRNA，可以通过以下步骤制备得到(1)在目的基因的cDNA序列中选择位点，合成DNA模板；(2)将模板DNA序列，构建至RNAi表达质粒。
本发明的优点表现在使用这些siRNA，可以有效地抑制Rig-G基因的表达，为建立Rig-G缺失型的细胞株模型奠定了基础，同时也有助于我们进一步认识Rig-G在维甲酸信号传导网络中的作用，从而深入揭示维甲酸诱导APL细胞分化的分子机制。
图1显示NB4细胞用维甲酸处理不同时间后Rig-G的表达情况。
图2显示Rig-G对AP-1蛋白转录活性的抑制效应。
图3显示Rig-G具有抑制JAB1辅助降解p27的功能。
图4显示Rig-G可以加强PIAS3对STAT3转录激活活性的抑制，且呈剂量依赖性。
图5显示转染了Rig-G的NIH3T3细胞会被明显阻滞在G1期，而处于S期的细胞相应减少。
图6显示体外合成的siRNA或siRNA表达质粒与Rig-G表达载体(pEGFP-Rig-G)分别共转至cos-7细胞系后，用Western-blot分析检测GFP-Rig-G融合蛋白的表达水平。
图7显示体外合成的siRNA或siRNA表达质粒与Rig-G表达载体(pEGFP-Rig-G)分别共转至cos-7细胞系后，用荧光显微镜分析检测GFP-Rig-G融合蛋白的表达水平。
图8显示siRNA表达质粒。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1抑制目的基因Rig-G表达的高效siRNA(一)1.在目的基因上选择序列，合成DNA模板根据RNAi有效序列的基本特点，我们在目的基因Rig-G基因的cDNA序列中选择位点(见表1、表2)，合成DNA模板(由博亚生物公司合成)。
在目的基因上选择候选siRNA序列的基本要求1)在目的基因的编码区启动子下游50-100bp的位置寻找候选序列(但非绝对)。
2)siRNA双链的两条模板链(正链和反链)均由AA起始，以保证体外转录得到的siRNA双链3’突出两个UU。
3)在配对的19个核苷酸中，第一位为G，第十九位为C。
4)GC含量最好在40～55％。
5)同源性比较将所选到的siRNA序列与GENBANK数据库比对，排除与其它基因完全匹配的序列，以保证其特异性。
6)应用mRNA二级结构分析软件，选择低二级结构区域作为候选靶点。
2.体外转录合成siRNA的实验步骤1)模板准备按所选的19个核苷酸合成DNA寡聚核苷酸，如5’-aaN(19)tatagtgagtcgtatta-3’2)以合成的DNA寡聚核苷酸为模板，以T7启动子DNA多聚核苷酸为引物，用T7RNA聚合酶进行体外转录反应过程为
i)先分别将DNA模板(正链或反链)和引物稀释至50μM，各取20μl和10μl的水混合，95℃，反应2分钟，缓慢降至室温退火。
ii)然后进行体外转录反应体系取退火产物10μl，T7 RNA聚合酶1μl，10×反应缓冲液5μl，rNTP 20μl，RNase抑制剂2μl，DTT5μl，补足H2O至50μl，37℃，反应2小时。
3)消化DNA模板体外转录的反应体系中加入2-5个单位的DNase，37℃，反应30分钟。
4)RNA复性混合对应的正反链转录产物，先95℃反应5分钟，然后37℃，孵育1小时。
5)沉淀RNA加入3M，pH5.2乙酸钠溶液10μl，混合后加入乙醇260μl，离心(13000rpm，4℃，30分钟)，再用75％乙醇洗涤，离心(13000rpm，4℃，15分钟)，空气干燥。
6)溶解RNA用50μl DEPC处理过的水溶解双链RNA，取3μl双链RNA在12％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴乙锭染色鉴定。
3.将siRNA转染至细胞转染在cos-7细胞中进行，cos-7在含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO/BRL)中培养。当细胞生长至密度约80％时，利用转染试剂transmessenger(QIAGEN)，将得到的siRNA片段转染至cos-7细胞中，并同时共转目的基因表达质粒pEGFP-Rig-G。
4.目的基因沉默效率检测荧光显微技术和western-blot蛋白印迹技术。
在细胞转染24小时，48小时，72小时后，分别应用荧光显微镜观察融合蛋白GFP-Rig-G的表达情况；并同时裂解细胞，抽提蛋白，应用western-blot蛋白印迹技术检测GFP-Rig-G融合蛋白表达水平的变化。
5.蛋白印迹(Western Blot)cos7细胞按照要求转染一定时间后，用PBS洗涤细胞一次，用0.25％的胰酶消化细胞，置于1.5ml离心管中，1000rpm离心5min，用1XPBS漂洗两次，将全细胞溶于2X细胞裂解液(100mMTris-HCl，pH6.8，200mMDDT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)中，煮沸10min，超声裂解，将等量的蛋白提取物上样至10％SDS-PAGE胶，160V电泳1小时，经60V转移2小时至硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉封闭1小时，与1∶10000稀释的抗Rig-G的多克隆抗体(自制)4℃孵育过夜，经PBS漂洗后再与羊抗兔HRP抗体结合1小时，用ECL(Armersham)化学发光系统显影。
表2
实施例2抑制目的基因Rig-G表达的高效siRNA(二)1.在目的基因上选择序列，合成DNA模板
根据RNAi有效序列的基本特点，我们在目的基因Rig-G基因的cDNA序列中选择位点(见表1、表2)，合成DNA模板(由博亚生物公司合成)。
在目的基因上选择候选siRNA序列的基本要求1)在目的基因的编码区启动子下游50-100bp的位置寻找候选序列(但非绝对)。
2)siRNA双链的两条模板链(正链和反链)均由AA起始，以保证体外转录得到的siRNA双链3’突出两个UU。
3)在配对的19个核苷酸中，第一位为G，第十九位为C。
4)GC含量最好在40～55％。
5)同源性比较将所选到的siRNA序列与GENBANK数据库比对，排除与其它基因完全匹配的序列，以保证其特异性。
6)应用mRNA二级结构分析软件，选择低二级结构区域作为候选靶点。
2.体外转录合成siRNA的实验步骤1)模板准备按所选的19个核苷酸合成DNA寡聚核苷酸，如5’-aaN(19)tatagtgagtcgtatta-3’2)以合成的DNA寡聚核苷酸为模板，以T7启动子DNA多聚核苷酸为引物，用T7 RNA聚合酶进行体外转录反应过程为i)先分别将DNA模板(正链或反链)和引物稀释至50μM，各取20μl和10μl的水混合，95℃，反应2分钟，缓慢降至室温退火。
ii)然后进行体外转录反应体系取退火产物10μl，T7 RNA聚合酶1μl，10×反应缓冲液5μl，rNTP 20μl，RNase抑制剂2μl，DTT5μl，补足H2O至50μl，37℃，反应2小时。
3)消化DNA模板体外转录的反应体系中加入2-5个单位的DNase，37℃，反应30分钟。
4)RNA复性混合对应的正反链转录产物，先95℃反应5分钟，然后37℃，孵育1小时。
5)沉淀RNA加入3M，pH5.2乙酸钠溶液10μl，混合后加入乙醇260μl，离心(13000rpm，4℃，30分钟)，再用75％乙醇洗涤，离心(13000rpm，4℃，15分钟)，空气干燥。
6)溶解RNA用50μlDEPC处理的水溶解双链RNA，取3μl双链RNA在12％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用溴乙锭染色鉴定。
3.将siRNA转染至细胞转染在细胞株293中进行，293在含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO/BRL)中培养。当细胞生长至密度约80％时，利用转染试剂transmessenger(QIAGEN)，将得到的siRNA片段转染至293细胞中，并同时共转目的基因表达质粒pEGFP-Rig-G。
4.目的基因沉默效率检测荧光显微技术和western-blot蛋白印迹技术。
在细胞转染24小时，48小时，72小时后，分别应用荧光显微镜观察融合蛋白GFP-Rig-G的表达情况；并同时裂解细胞，抽提蛋白，应用western-blot蛋白印迹技术检测GFP-Rig-G融合蛋白表达水平的变化。
5.蛋白印迹(Western Blot)
293细胞按照要求转染一定时间后，用PBS洗涤细胞一次，用0.25％的胰酶消化细胞，置于1.5ml离心管中，1000rpm离心5min，用1XPBS漂洗两次，将全细胞溶于2X细胞裂解液(100mMTris-HCl，pH6.8，200mMDDT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)中，煮沸10min，超声裂解，将等量的蛋白提取物上样至10％SDS-PAGE胶，160V电泳1小时，经60V转移2小时至硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉封闭1小时，与1∶10000稀释的抗Rig-G的多克隆抗体(自制)4℃孵育过夜，经PBS漂洗后再与羊抗兔HRP抗体结合1小时，用ECL(Armersham)化学发光系统显影。
实施例3抑制目的基因Rig-G表达的高效siRNA(三)1.在目的基因上选择序列，合成DNA模板根据RNAi有效序列的基本特点，我们在目的基因Rig-G基因的cDNA序列中选择位点(见表1、表2)，合成DNA模板(由博亚生物公司合成)。
在目的基因上选择候选siRNA序列的基本要求1)在目的基因的编码区启动子下游50-100bp的位置寻找候选序列(但非绝对)。
2)siRNA双链的两条模板链(正链和反链)均由AA起始，以保证体外转录得到的siRNA双链3’突出两个UU。
3)在配对的19个核苷酸中，第一位为G，第十九位为C。
4)GC含量最好在40～55％。
5)同源性比较将所选到的siRNA序列与GENBANK数据库比对，排除与其它基因完全匹配的序列，以保证其特异性。
6)应用mRNA二级结构分析软件，选择低二级结构区域作为候选靶点。
2.构建siRNA表达质粒根据所选定的序列(19个核苷酸)，分别合成两条互补的DNA寡核苷酸，如5’GATCCCGgagttaatccagcaagaacTTCAAGAGAgttcttgctggattaactcTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAAgagttaatccagcaagaacTCTCTTGAAgttcttgctggattaactcCGG 3’退火使之形成双链；然后通过酶切位点，构建到siRNA表达载体pSilencer 3.0-H1(Ambion公司，见图8)。
3.细胞转染转染在cos-7细胞中进行，cos-7细胞在含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO/BRL)中培养。当细胞生长至密度约80％时，利用转染试剂transmessenger(QIAGEN)，将RNAi表达质粒转染至cos-7细胞中，并同时共转目的基因表达质粒pEGFP-Rig-G。
4.目的基因沉默效率检测荧光显微技术和western-blot蛋白印迹技术。
在细胞转染24小时，48小时，72小时后，分别应用荧光显微镜观察融合蛋白GFP-Rig-G的表达情况；并同时裂解细胞，抽提蛋白，应用western-blot蛋白印迹技术检测GFP-Rig-G融合蛋白表达水平的变化。
5.蛋白印迹(Western Blot)cos-7细胞按照要求转染一定时间后，用PBS洗涤细胞一次，用0.25％的胰酶消化细胞，置于1.5ml离心管中，1000rpm离心5min，用1XPBS漂洗两次，将全细胞溶于2X细胞裂解液(100mMTris-HCl，pH6.8，200mMDDT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)中，煮沸10min，超声裂解，将等量的蛋白提取物上样至10％SDS-PAGE胶，160V电泳1小时，经60V转移2小时至硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉封闭1小时，与1∶10000稀释的抗Rig-G的多克隆抗体(自制)4℃孵育过夜，经PBS漂洗后再与羊抗兔HRP抗体结合1小时，用ECL(Armersham)化学发光系统显影。
实施例4抑制目的基因Rig-G表达的高效siRNA(四)1.在目的基因上选择序列，合成DNA模板根据RNAi有效序列的基本特点，我们在目的基因Rig-G基因的cDNA序列中选择位点(见表1、表2)，合成DNA模板(由博亚生物公司合成)。
在目的基因上选择候选siRNA序列的基本要求1)在目的基因的编码区启动子下游50-100bp的位置寻找候选序列(但非绝对)。
2)siRNA双链的两条模板链(正链和反链)均由AA起始，以保证体外转录得到的siRNA双链3’突出两个UU。
3)在配对的19个核苷酸中，第一位为G，第十九位为C。
4)GC含量最好在40～55％。
5)同源性比较将所选到的siRNA序列与GENBANK数据库比对，排除与其它基因完全匹配的序列，以保证其特异性。
6)应用mRNA二级结构分析软件，选择低二级结构区域作为候选靶点。
2.构建siRNA表达质粒根据所选定的序列(19个核苷酸)，分别合成两条互补的DNA寡核苷酸，如
5’GATCCCGgcagccaaatgttatgagaTTCAAGAGAtctcataacatttggctgcTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAAgcagccaaatgttatgagaTCTCTTGAAtctcataacatttggctgcCGG 3’退火使之形成双链；然后通过酶切位点，构建到siRNA表达载体pSilencer 3.0-H1(Ambion公司，见图8)。
3.细胞转染转染在293细胞中进行，293在含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO/BRL)中培养。当细胞生长至密度约80％时，利用转染试剂transmessenger(QIAGEN)，将RNAi表达质粒转染至293细胞中，并同时共转目的基因表达质粒pEGFP-Rig-G。
4.目的基因沉默效率检测荧光显微技术和western-blot蛋白印迹技术。
在细胞转染24小时，48小时，72小时后，分别应用荧光显微镜观察融合蛋白GFP-Rig-G的表达情况；并同时裂解细胞，抽提蛋白，应用western-blot蛋白印迹技术检测GFP-Rig-G融合蛋白表达水平的变化。
5.蛋白印迹(Western Blot)293细胞按照要求转染一定时间后，用PBS洗涤细胞一次，用0.25％的胰酶消化细胞，置于1.5ml离心管中，1000rpm离心5min，用1XPBS漂洗两次，将全细胞溶于2X细胞裂解液(100mMTris-HCl，pH6.8，200mMDDT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)中，煮沸10min，超声裂解，将等量的蛋白提取物上样至10％SDS-PAGE胶，160V电泳1小时，经60V转移2小时至硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉封闭1小时，与1∶10000稀释的抗Rig-G的多克隆抗体(自制)4℃孵育过夜，经PBS漂洗后再与羊抗兔HRP抗体结合1小时，用ECL(Armersham)化学发光系统显影。
权利要求
1.一种针对目的基因Rig-G的高效siRNA，其特征在于(1)在目的基因的cDNA序列中选择位点，合成DNA模板(2)体外转录，合成RNA片段。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于将RNA片段转染细胞株后能高效抑制目的基因的表达。
3.一种针对目的基因Rig-G的高效siRNA，其特征在于(1)在目的基因的cDNA序列中选择位点，合成DNA模板；(2)将模板DNA序列，构建至siRNA表达质粒。
4.根据权利要求3所述的siRNA，其特征在于将siRNA表达质粒转染细胞株后，能有效抑制目的基因的表达。
5.根据权利要求1或3所述的siRNA，其特征在于在目的基因的cDNA序列中选择位点为第80-100bp的碱基序列aagacagtgtctcaagggatc。
6.根据权利要求1或3所述的siRNA，其特征在于在目的基因的cDNA序列中选择位点为第1052-1072bp的碱基序列aagtccctgatgctgaaaagc。
7.根据权利要求1或3所述的siRNA，其特征在于在目的基因的cDNA序列中选择位点为第235-253bp的碱基序列gagttaatccagcaagaac。
8.根据权利要求5-7任一权利要求所述的siRNA，其特征在于siRNA对目的基因的沉默效率可达90％以上。
9.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于将RNA片段转染至细胞株cos7或293。
10.根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于将siRNA表达质粒转染至细胞株cos7或293。
全文摘要
本发明涉及一类能对目的基因Rig－G的表达进行高效干扰的小片段双链RNA分子(siRNA)。本发明所公开的一种针对目的基因Rig－G的高效siRNA，可以通过以下步骤制备得到(1)在目的基因的cDNA序列中选择位点，合成DNA模板；(2)体外转录，合成RNA片段；或构建siRNA表达质粒。使用这些siRNA，可以有效地抑制Rig－G基因的表达，为建立Rig－G缺失型的细胞株模型奠定了基础，同时也有助于我们进一步认识Rig－G在维甲酸信号传导网络中的作用，从而深入揭示维甲酸诱导APL细胞分化的分子机制。
文档编号C07H21/00GK1810985SQ20051002383
公开日2006年8月2日 申请日期2005年2月4日 优先权日2005年2月4日
发明者童建华, 肖澍, 贾培敏 申请人:上海第二医科大学附属瑞金医院