专利名称:基因的浓缩方法
技术领域：
本发明涉及在从微生物混合物中制备的DNA样品中浓缩稀有基因的方法，所述稀有基因源自少数的微生物，或源自不能被培养的微生物，或在动植物细胞中仅少量表达的稀有基因的浓缩方法，涉及由所述浓缩方法获得的稀有基因，分析所述稀有基因的方法，浓缩稀有基因的设备以及浓缩稀有基因的试剂盒。
在本发明说明书中，最初仅少量存在于DNA样品中的基因称为“稀有基因”，而最初就大量存在的基因称为“丰度基因”。
从微生物中制备上述有用的基因通常开始于如下程序，其中将具有有用基因的微生物分离和培养以便从所述微生物中抽提出DNA，并在此基础上制备基因文库。主要是通过适当方法使所述基因文库在适当宿主中导入和表达，以及将活性转化子筛选出来。然而，采用这种方法从微生物中制备有用基因费时费工，所述微生物仅占其中混合了各种微生物的样本的部分，或者不能被分离和培养。尤其当具有有用基因的微生物在混合物中是少量时，以及进一步当所述微生物不能被培养时，从所述微生物中制备有用基因基本上是不可能的。假如基因源自仅少量存在于基因样本中的微生物，或者源自在样本中不能被培养的微生物，或换而言之，如果稀有基因或痕量基因可被相对浓缩，其后则能有效筛选有用基因，于是可大大节省人工、时间和费用。
同时，人们已经认为组成人体的细胞可划分为200或更多的类型，并且各种细胞具有共同的基因组，所述基因组包括约100,000种基因，以及认为成千上万的基因的表达取决于细胞类型。这种基因表达的研究变得越来越重要，不仅是为了获得有关各基因功能的信息，而且是为了阐明生命过程。此外，迄今为止已对少量相对有限的基因进行了详细分析，结果发现多个基因在许多生命过程中以合作方式起作用。
根据表达量，基因表达大致划分为三类。丰度型为每个细胞约103-4拷贝，中间型约为102拷贝以及稀有型仅约为101拷贝。另一方面，关于表达基因的类型，在哺乳动物中每个细胞有多至成千上万种，但大多数基因属于稀有类型。因此，对于细胞中的表达基因，仅有几种基因属于丰度类型，具有高的表达量(103-4拷贝)，而有相当多种类的基因属于稀有类型，仅具有少的表达量(101拷贝)(例如，Alberts，B.等(1989)Molecular Biology of the Cell，2ndEdition，Garland PublishingInc.)。在这些情况下，对其中更详细分析多种基因包括稀有基因的技术存在着必要性，作为这种分析的结果，其在医学领域中的利用如基因诊断人们已经可以期待。
关于目前对稀有基因的分析，已知的方法例如有其中以多链体PCR作为基础的方法，包括经典法(Minoru S.H.Ko(1990)NucleicAcids Res.，18，5705-5711)、差示法(Liang，P.和Pardee，A.B.(1992)Science，257，967-971)以及分子指数法(Kikuya Kato(1995)NucleicAcids Res.，23，3685-3690等)，还有利用DNA芯片的方法。在经典法中，将高分子的核酸混合物置于杂交条件下，经过一段适当时期后，变成双链状的核酸从仍维持在单链状的核酸中分离，于是稀有基因可被浓缩至与丰度基因相同程度的量。但在经典法中，不会发生处理后的稀有基因数多于丰度基因，因此，浓缩效果有限。在利用多链PCR如差示法进行分析的情况下，已知有竞争性PCR发生，并对现有的基因量产生了大的误差，由此检测的灵敏度低于普通PCR，因而稀有类基因的检测变得困难(David，J.Bertioli等(1995)Nucleic Acids Res.，23，4520-4523)。作为克服这些缺点的方法，其公开在日本专利公开号2000/37,193中，其中存在于核酸样品中的已知丰度基因被去除，而稀有基因得到浓缩。然而，这种方法是不适用的，除非存在的丰度基因是已知基因。
另一方面，所谓的消减法(subtraction method)及其修饰方法可用于鉴别某些生物物种的突变基因(Ellen E.Lamer和E.Palmer(1984)Cell，37，171-177；Ilse Wieland等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2720-2724；Anne Kallioniemi等(1992)Science，258，818-821；以及Nikolai Lisitsyn等(1993)Science，259，946-951)。这些方法如下其中在相同生物物种的两个个体中大多数是一样的基因(譬如A和B)之间，质量或数量不同的基因得到浓缩和分离，或者其中在从两种不同状态、相同种类细胞的mRNA中制备的cDNA中，具有不同存在量的基因(譬如A和B)得到浓缩和分离。其原理是，当与B(A)相同的A(B)中的基因通过B(A)的基因以任何方法去除时，可制备仅存在A(B)的特异基因。因此，在所述方法中，其中所含的大多数基因相同的两种DNA样品是必需的。
然而，在自然界(如土壤、湖水和河水)的某些样本中，存在着很多种微生物，并且通常微生物组成随各个样本而变化，其中各个样本又有自己固有的组成。因此，当源自小微生物(minor microbe)的稀有基因得到浓缩时，就有可能制备两种DNA样品，其中所含的大多数基因---消减或被消减---是相同的，由此利用上述消减法进行所述稀有基因的浓缩是可能的。即使cDNA样品中的稀有基因可被浓缩，制备两种cDNA样品也很不容易，其中一个cDNA样品含有所述稀有基因而另一个不含所述稀有基因，这两种样品所含大多数基因相同。结果，采用上述消减法浓缩所述稀有基因是困难的。
本发明人已反复进行了深入研究，结果认为，在用于分析基因组大小和重复序列的Cot分析中，双链再形成的反应速率与基因组大小成反比，而与同样序列的浓度成正比，于是含有稀有基因和丰度基因的DNA样品中的稀有基因可得到浓缩，以及本发明人已证实稀有基因可从大肠杆菌(Escherichia coli)DNA、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)DNA和小牛胸腺DNA的混合溶液中浓缩出来，因此，本发明已经完成。
所以，本发明涉及如下方面(1)浓缩少量存在的基因的方法，其特征在于，将含有少量存在的基因和大量存在的基因的DNA样品进行下列操作，以使少量存在的基因从大量存在的基因中分离出来(a)把DNA样品分成两等份。一份DNA样品称为驱动DNA(driver DNA)组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分；(b)将靶DNA和驱动DNA混合，并把混合液中的DNA制成单链。或者，先将靶DNA和驱动DNA制成单链后再混合；(c)杂交，并使由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA从上述混合液中去除；以及(d)将(b)和(c)的操作进行一次或多次，其中使用(c)中所获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA。
(2)浓缩少量存在的基因的方法，其特征在于，将含有少量存在的基因和大量存在的基因的DNA样品进行下列操作，以使少量存在的基因从大量存在的基因中分离出来(a)把DNA样品分成两等份。一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分；(b)将驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA组分切割。此时，驱动DNA的分子量被制成低于靶DNA的分子量；(c)标记驱动DNA。如果需要，将接头连接物连接到靶DNA上；(d)让靶DNA与过量的标记驱动DNA混合，然后使混合液中的DNA制成单链并进行杂交；(e)通过标记驱动DNA的方法，将由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA从上述混合液中去除；以及(f)将(d)和(e)的操作进行一次或多次，其中利用(e)中所获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA。
(3)根据以上(1)或(2)所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中驱动DNA的混合量(d)与靶DNA的混合量(t)的比例(d/t)大于1至高达1000。
(4)根据以上(2)或(3)所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中驱动DNA标记有生物素、地高辛、荧光素或罗丹明。
(5)根据以上(2)-(4)所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中驱动DNA的平均链长为200-300个碱基对，以及靶DNA的平均链长为1000或更多个碱基对。
(6)根据以上(2)-(5)所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中通过4个碱基识别的限制性酶对驱动DNA组分进行DNA切割，而通过5-8个碱基识别的限制性酶对靶DNA组分进行DNA切割。
(7)根据以上(6)所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中通过MspI对驱动DNA组分进行DNA切割，而通过Sse8387I对靶DNA组分进行DNA切割。
(8)根据以上(2)-(5)所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中DNA切割通过超声波或机械剪切力进行。
(9)浓缩少量存在的基因的方法，其特征在于，将含有少量存在的基因和大量存在的基因的DNA样品进行下列操作，以使少量存在的基因从大量存在的基因中分离出来(a)DNA样品分成两等份。一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分；(b)将驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA切割。此时，驱动DNA的分子量被制成低于靶DNA的分子量。如果需要，将接头连接物连接到靶DNA上；(c)将驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA制成单链；(d)使如此制成单链的驱动DNA固定在载体上；(e)让其上固定有单链驱动DNA的载体与制成单链的靶DNA溶液接触或混合从而进行杂交；(f)把载体和溶液分开，并去除与驱动DNA形成双链的靶DNA；以及(g)利用(f)中所获得的靶DNA溶液代替靶DNA溶液进行一次或多次(e)和(f)的操作。
(10)根据以上(1)-(9)所述浓缩少量存在的基因的方法，其中DNA样品是从混有至少两种微生物、生物体、生物组织或细胞的样品中制备的DNA样品，或是从生物个体、生物组织或细胞中抽提的核酸，和/或从所述核酸中制备的DNA样品。
(11)通过以上(1)-(10)所述的方法制备的DNA样品，其特征在于，在处理前原有少量稀有基因与原有多量基因的比例在处理后增加。
(12)分析稀有基因的方法，其包括通过以上(1)-(10)所述的方法浓缩少量存在的基因(下文简称“稀有基因”)的步骤，从稀有基因被浓缩的所得DNA样品中获得稀有基因的步骤以及对稀有基因的碱基序列进行分析的步骤。
(13)从通过以上(1)-(10)所述的方法得到的DNA样品中获取的基因，其中少量存在的基因被浓缩。
(14)浓缩稀有基因的设备，其包括(a)一种装置，其中将靶DNA和标记驱动DNA的混合液中的DNA制成单链，(b)一种装置，其中进行杂交，(c)一种装置，其中通过标记驱动DNA的方法来去除由驱动DNA和靶DNA所形成的双链DNA，以及(d)一种装置，其中利用由(c)所获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA，以及重复(b)和(c)的操作。
(15)浓缩稀有基因的设备，其包括(a)一种装置，其中将制成单链的驱动DNA固定于载体上，(b)一种装置，其中将固定有单链驱动DNA的载体与制成单链的靶DNA的溶液接触或混合从而进行杂交，(c)一种装置，其中使载体和溶液分开，以去除与驱动DNA形成双链的靶DNA，以及
(d)一种装置，其中利用(c)中所获得的靶DNA溶液代替靶DNA溶液而重复(b)和(c)的操作。
(16)浓缩稀有基因的试剂盒，其包括切割DNA的装置、标记的物质或载体、标记DNA的试剂或将DNA固定到载体上的试剂、杂交试剂以及去除由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA的装置。
图2表示小牛胸腺DNA的再形成。△(空心三角形)表示小牛胸腺DNA浓度为2μg/ml的样品，●表示小牛胸腺DNA浓度为10μg/ml的样品，○表示小牛胸腺DNA浓度为600μg/ml的样品，▲(实心三角形)表示小牛胸腺DNA浓度为8,600μg/ml的样品，以及+表示添加了8,600μg/ml小牛胸腺DNA的样品，利用43μg/ml放射性标记的大肠杆菌DNA作为内标(Shin Seikagaku Jikken Koza，KakusanI，第199页)。
图3表示实施例如何进行操作。
图4(A)表示电泳凝胶，其中将4μl用Sse8387I处理的组分E/B靶DNA进行PCR，以扩增各个基因，采用常规方式在100伏特下取样10μl置于3％琼脂糖凝胶中电泳40分钟，并用溴化乙锭染色。1道大肠杆菌基因；2道短小芽孢杆菌基因；3道酵母基因(对照)；4道DNA大小标记(自下而上依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200和1500碱基对；下文同样如此)。
图4(B)表示电泳凝胶，其中将4μl用Sse8387I处理的组分H/E/B靶DNA进行PCR，以扩增各个基因，采用常规方式在100伏特下取样10μl置于3％琼脂糖凝胶中电泳40分钟，并用溴化乙锭染色。1道DNA大小标记；2道人基因；3道大肠杆菌基因以及4道短小芽孢杆菌基因。
图5(A)表示电泳凝胶，其中将经碱处理并用乙醇沉淀的核酸溶解于18μl的水和1μl的TE中，然后加入10×PCR缓冲液、B×10、dNTP、rTaq以及引物对以制备25μl的反应液，进行PCR，采用常规方式在100伏特下把反应液的部分置于3％琼脂糖凝胶中电泳40分钟，并用溴化乙锭染色。将反应液的部分(3μl)用于1、2、4、5、7和8道，而同时将反应液的部分(9μl)用于3和6道。1道10大肠杆菌基因；2道10短小芽孢杆菌基因；3道20大肠杆菌基因；4道20大肠杆菌基因；5道20短小芽孢杆菌基因；6道30大肠杆菌基因；7道30大肠杆菌基因；8道30短小芽孢杆菌基因；；以及9道DNA大小标记。
图5(B)表示电泳凝胶，其中将经碱处理并用乙醇沉淀的核酸溶解于18μl的水和1μl的TE中，然后加入10×PCR缓冲液、B×10、dNTP、rTaq以及引物对以制备25μl的反应液，为此进行PCR，采用常规方式在100伏特下把反应液的等分以等量置于3％琼脂糖凝胶中电泳40分钟，并用溴化乙锭染色。1道DNA大小标记；2道30人基因；3道30大肠杆菌基因；4道30短小芽孢杆菌基因。
图6表示在一个根据本发明所述浓缩稀有基因方法的实施方案的操作流程。虚线表示在鉴定丰度基因去除状态的情况下的操作流程。
图7表示实施例2的测试实施例1的结果。采用PCR通过靶基因DNA(00)、10、20和30对各个基因进行扩增。利用0.8％琼脂糖(由K.K.Nippon Gene制造)在100伏特下把它(8μl)进行电泳30分钟，并用溴化乙锭染色。至于大小标记，利用λ-Hind III消化物。1道DNA大小标记(λ-Hind III) 2道00大肠杆菌基因；3道00希氏硫化叶菌(S.Shibatae)基因；4道20大肠杆菌基因；5道10希氏硫化叶菌基因；6道20大肠杆菌基因；7道20希氏硫化叶菌基因；8道30大肠杆菌基因 9道30希氏硫化叶菌基因；10道不含大肠杆菌的模板DNA的PCR反应液；以及11道不含希氏硫化叶菌的模板DNA的PCR反应液。
实施本发明的最佳方式现在本发明将如下文详细描述。首先，将提及Cot分析(KojiSawada等Shin Seikagaku Jikken Koza，Kakusan I，第10章，通过杂交分级分离核酸(Fractionation of Nucleic Acid by Hybridization)，第193-238页)，其是本发明的理论背景。
高分子核酸的杂交形成反应遵循下列二级反应式，其中互补链之间的有效碰撞是速率决定的因素以及反应速率与单链DNA的浓度[C]的平方成正比。
d[C]/dt＝-k[C]2(1)(在式中，[C]是单链DNA的浓度，t是反应时间以及k是反应速率常数)当动物细胞的DNA含有重复序列时，各个序列的起始浓度是不同的，所以，反应级数是多相型。当互补链的一种是过量(20倍或更多倍)时，有可能以假一级反应来处理。
利用液相核酸杂交反应中的动力学因素，可分析核酸的一级结构。这就是Cot和Crt分析。Cot分析是DNA-DNA杂交的分析，而Crt分析是DNA-RNA或RNA-RNA杂交的分析以及后者也称为Rot分析。在1968年，Britten和Kohne动力学地分析了动物细胞DNA的双链DNA的再形成反应，并首先显示Cot分析能用于(1)分析基因组大小(基因组DNA的碱基序列的多重性)和(2)分析碱基序列的重复(R.J.Britten和D.E.Kohne，Science，161，529)。Cot和Crt分析也用作核酸分级分离的指数。(1)Cot分析和基因组大小当式(1)是积分以及起始浓度为[C0]时，建立了[C]/[C0]＝1/(1+k[C0]t) (2)(在式中，[C0]是单链DNA的起始浓度以及t和k具有如上所定义的相同意思)以及以[C0]t为横坐标作图，而以[C]/[C0]为纵坐标作图，从而获得Cot曲线(
图1)。
Cot的单位为核苷酸摩尔.秒/升。当核苷酸的平均分子量为314时，1μg/ml DNA为3.19×10-6核苷酸摩尔.秒/升，所以[C0]t＝DNA(μg/ml)×1.15×10-2×时间(小时) (3)。
当此是近似时，[C0]t＝DNA(A260)×时间(小时)/2 (4)(在式中，A260是260nm处的吸光度。)当DNA分子中没有重复序列时，Cot曲线变成一级的S形曲线(图1)。
从(2)中，可建立([C0]-[C])/[C]＝k[C0]t (5)(在式中，[C0]、[C]、t和k具有如上所定义的相同意思)，以及以[C0]t为横坐标作图，而以([C0]-[C])/[C]为纵坐标作图，从而获得直线。其斜率的倒数为[C0]t1/2。
t1/2＝1/k (6)(在式中，t1/2表示50％的单链DNA变成双链DNA时的时间。[C0]和k具有如上所定义的相同意思。)当DNA浓度依据核苷酸摩尔浓度给出时，双链再形成的反应速率反比于基因组大小以及因此，其正比于[C0]t1/2。从中可计算出各种生物的基因组大小(图1)。(2)重复序列当DNA分子有重复序列时，其Cot曲线是单一序列的原始S形曲线和各个重复序列的原始S形曲线合成的结果。在小牛胸腺DNA的情况下，反应分成两个阶段，并接近于原始S形曲线的合成，其中对约40％来说，[C0]t1/2值为0.03，而对约60％来说，[C0]t1/2值则为3000。可认为后者是单一序列，而前者是具有100,000拷贝的高度重复的序列(图2)。当反应在适当时间终止时，将单链DNA和双链DNA分开，则有可能把单一序列和重复序列分开。
现在，从至少有两种微生物、生物体、生物组织或细胞以混合态存在的样本如土壤、湖水或河水中提取的DNA可看成高级动物基因组的等同物，并定义为多元性基因体(metagenome)。在多元性基因体中，源自微生物等的最低量基因可视为单一系列，而源自微生物以更多量存在的基因可视为重复序列。依据存在的数，将所述重复序列划分成高度的重复序列、中度的重复序列以及低度的重复序列。
此外，在从生物个体、生物组织或细胞提取的核酸和/或从所述核酸制备的DNA中，以其现有量也存在着大量的多重性，如同从mRNA中制备cDNA的情形一样，因此划分成单一序列和重复序列是可能的。
根据上述Cot分析的理论，DNA拷贝数越高，双链形成越快，所以，当本发明所用的DNA样品在适当条件下制成单链时，就会有双链再形成，并通过适当方法分离和去除所得的双链DNA，则在剩余单链DNA样品中稀有基因得到相对浓缩。然而对此应注意的是，该情形下的浓缩仅仅是相对的，稀有基因从来不会变成多数，最终即使在最高状态下，其量充其量是几乎相同。如上所述，这才是真正用作经典法的方法。
然而，通过下列方法，稀有基因的原有量经过处理后可产生多于丰度基因的量，于是完成了本发明。
更具体而言，根据本发明所述的基因的浓缩方法特征在于将含有稀有基因和丰度基因的DNA样品进行下列处理以便从丰度基因中分离稀有基因，从而浓缩稀有基因。因此，(a)将DNA样品一分为二。一份样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分；(b)使靶DNA和驱动DNA混合，并把混合液中的DNA制成单链。或者，将靶DNA和驱动DNA先制成单链后再混合；(c)进行杂交，并将由驱动DNA和靶DNA所形成的双链DNA从上述混合液中去除；以及(d)将(b)和(c)的操作进行一次或多次，其中利用(c)中获得的去除了双链DNA的DNA溶液来代替靶DNA。
其原理将如下说明。此处，丰度基因称为基因A，而稀有基因称为基因B。驱动DNA中基因A的部分序列和/或包括其周围序列的特异序列称为A，而其中基因B的部分序列和/或包括其周围序列的特异序列称为B。关于A和B，相同的序列也存在于靶DNA片段中。当杂交和非杂交分离进行n次时，[Xn]表示X的浓度。“＝∽”表示相同量或相同程度的量。
在第一次杂交以及杂交和非杂交分离的操作中，A被大大去除，其浓度变为[靶A1]([靶A0]＞[靶A1])。另一方面，[靶A0+驱动A0]＞＞[靶B0+驱动B0]，因此，当Cot合适时，[靶B1]几乎没有变化。在下一次杂交中，[靶A1+驱动A0]＝∽[驱动A0]＞＞[靶B1+驱动B0]，所以，反应为假一级反应，这只依赖于驱动DNA的浓度。因此，与A比较，B的杂交通常可忽略不计，并且在杂交和非杂交分离操作后，靶A进一步被去除，从而生成[靶A2]([靶A1]＞[靶A2])，但[靶B2]几乎没有变化。当此重复时，就有[靶An]＜＜[靶Bn]＝∽[靶B0]，于是仅具有B的基因B留在了靶DNA中。
因此，根据本发明所述的稀有基因的浓缩方法的特征是，给各个杂交新提供的驱动A总是以显著高的浓度存在于杂交体系中，因而A的杂交速度是显著高的。当常规经典法中A和B的浓度相同时，各个基因的杂交几率变为相同，所以，它们中的一个优先于另一个进一步被浓缩是不可能的。然而，根据本发明，由于驱动A的浓度总是显著高，有可能浓缩直到基因B变成多于基因A，如下所示。(i)在[靶A]＞＞[靶B]的情形下(在第一次操作的情形中)在此情形下，驱动A大量存在于靶DNA和驱动DNA混合的杂交体系中，驱动A与靶A有效碰撞后杂交的概率远大于B的情形。当由驱动DNA和靶DNA所形成的双链DNA被选择性去除后，靶A就可被有效去除，而靶B则很少被去除仍保留在体系中。因此有可能将基因A(丰度基因)和基因B(稀有基因)分开，从而浓缩基因B(稀有基因)。(ii)[靶A]＝∽[靶B](当操作反复进行时)即使进一步进行反复浓缩，以及“靶An”和“靶Bn”变成相同的程度，由于在该溶液和驱动DNA混合的新杂交体系中新供给的驱动A的浓度是显著高的，所以，靶A与驱动A的有效碰撞的概率远高于靶B和驱动B的有效碰撞的概率。因而，与驱动A杂交的靶A被去除，而大多数靶B仍保留在体系中。因此，基因B(稀有基因)可被浓缩直至其量达到多于基因A(丰度基因)。
关于本发明中所用的DNA样品，没有任何特殊的限制，可采用任何样品。样品为从至少有两种或更多种微生物、生物、生物组织或细胞混合的样品中提取的DNA样品。所以，有可能利用从具有固有微生物组成的样品中提取的DNA，所述固有微生物组成从无需分离的自然界如土壤、湖水和河水以及微生物的培养物中获得。根据本发明浓缩小微生物的方法具有如此优点，即也可适用于具有这种内在微生物组成的样品。
本发明所用的DNA样品可以是从生物个体、生物组织或细胞中提取的核酸的DNA样品和/或从所述核酸中制备的DNA样品。其样品是混合了发炎组织和正常组织的组织；混合了癌细胞和正常细胞的细胞或微生物；以及从mRNA和/或DNA中制备的cDNA样品，所述mRNA和/或DNA是从病毒感染细胞和非感染细胞的混合物中提取的。此外，其可以是从mRNA中制备的cDNA样品，所述mRNA中有许多种基因在细胞中表达。
关于DNA的提取方法，可利用的有本身已知的方法如碱性SDS法、离心法及其组合。适当利用市场销售的DNA提取试剂盒也是可能的。
作为本发明的实施方案，可举例的方法是其中(1a)将DNA样品一分为二(其中一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分)，(1b)使靶DNA和驱动DNA混合，并把混合液中的DNA制成单链，或者将靶DNA和驱动DNA先制成单链后再混合，(1c)进行杂交并将由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA从上述混合液中去除以及(1d)将(1b)和(1c)的操作进行一次或多次，其中利用(1c)中获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA，由此丰度基因从稀有基因中分离出来，以及稀有基因被浓缩。
在上述操作(1a)中，可将DNA样品随意分成两份。其中一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分。然而，DNA样品仅可少量获得，优选的是，考虑到操作(1b)中靶DNA和驱动DNA的混合比例，分成两份以使驱动DNA组分的量更多。此外，当总DNA量不够时，也有可能采用PCR方法先扩增，再分离成靶DNA组分和驱动DNA组分，并进行下列操作。在此情形下仅有驱动DNA组分通过PCR得到扩增，扩增程度的差异取决于序列，这将会给后来的序列浓缩带来麻烦。
在操作(1b)中，优选的是使过量的驱动DNA与靶DNA混合。这是因为，当添加过量的驱动DNA时，丰度基因可被有效去除。更具体而言，合适的是驱动DNA的混合量(d)与靶DNA的混合量(t)的比例(d/t)为大于1但不超过1000，优选约10-1000，或更优选约100-1000。尤其当驱动DNA的混合量更多时，杂交时间可缩短。因而，在例如本发明中的DNA样品不够利用的情形下，即使假设如上述混合比例(d/t)为大于1但不大于10或更优选约10，仍然是合适的。
关于将DNA制成单链的方法，可利用本身已知的方法，例如，约94℃加热约1分钟或进行碱处理，由此制备单链产物，实施例中所述的条件是优选的。或者，在靶DNA和驱动DNA混合后制备单链产物或在混合前使靶DNA和驱动DNA的各个制成单链也是可能的。
在上述操作(1c)中，将靶DNA和驱动DNA杂交。尽管实施例中所述的条件是优选的，但杂交条件可按照本身已知的方法。在此，靶DNA与驱动DNA的杂交还包括驱动DNA与部分靶DNA杂交的情形以及多个驱动DNA与靶DNA杂交的情形。
其后，将靶DNA和驱动DNA杂交的双链DNA去除。同时，杂交有驱动DNA的双链DNA以及单链DNA也可被去除。关于去除靶DNA和驱动DNA杂交的双链DNA的方法，可利用本身已知的方法，例如利用羟基磷灰石的分批法、柱层析法以及利用CsCl的比重离心法等。
上述操作(1c)的结果是丰度基因被去除以及稀有基因得到浓缩。然而优选的是，为了充分去除丰度基因，利用在(1c)中获得的双链DNA被去除的DNA溶液进行(1b)和(1c)的操作，取代利用靶DNA的操作(1d)，以及更优选重复进行操作(1d)至少一次或多次。
本发明另一优选的实施方案是通过从丰度基因中分离稀有基因而浓缩稀有基因的方法，其包括如下步骤(2a)将DNA样品分成二等份(其中一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分)，(2b)将驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个进行切割，以使驱动DNA的分子量低于靶DNA的分子量，(2c)标记驱动DNA，以及如果需要，把接头连接物连接到靶DNA上，(2d)使靶DNA与过量的标记驱动DNA混合，然后将混合液中的DNA制成单链，并进行杂交，(2e)通过标记驱动DNA，将由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA从上述混合液中去除。此时，由驱动DNA和单链驱动DNA形成的双链DNA也被去除。其后，(2f)将(2d)和(2e)的操作进行一次或多次，其中利用在(2e)中获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA。
关于在上述操作(2b)中DNA切割的方法，可利用本身已知的方法，如用限制性酶处理、采用超声波和物理剪切力处理。当利用限制性酶进行切割时，采用识别不同碱基对的限制性酶切割成所需大小的DNA片段是可能的。例如，利用识别8-碱基的NotI时，推测的片段长度平均为65,536个碱基对，对应于微生物约60个基因。当需要稍短的片段时，利用识别7个碱基的CpoI，因为一个碱基对是A或T，假定的平均长度为46×2＝8,192碱基对，以及所得长度含有7-8个基因。
一般而言，当靶DNA制成较大时，可得到以多个基因相连的产物。因此，关于靶DNA，优选平均链长约为1000个碱基对或更多。与某个代谢系统相关的基因经常制备其中所述基因以多个相连的基因簇，因此，根据本发明的方法可用于制备簇基因。此时，尽管驱动DNA的大小可与靶DNA的大小程度相同，但优选的是小DNA，这是因为杂交的效率和特异性得到提高。更具体而言，其可以是约200-300个碱基对，这是通常进行Cot分析所用的DNA的大小(链长)。当DNA的大小(链长)太长时，单链DNA上序列的组成方式变得复杂，在一些部分，有相似的序列，而在其他部分，有单一序列。结果，上述大小被优选。
为了使驱动DNA的分子量低于靶DNA的分子量，优选的是在如下操作(3a)中进行DNA切割，让识别4个碱基的限制性酶用于驱动DNA组分，而让识别5-8个碱基的限制性酶用于靶DNA组分。在驱动DNA组分，更优选的是通过4-碱基-识别的MspI切割驱动DNA组分的DNA，而通过8-碱基-识别的Sse8387I切割靶DNA组分的DNA。
优选的是在进行杂交(操作(2c))前先标记驱动DNA。作为标记的结果，优点为其中驱动DNA和靶DNA杂交的双链DNA可有效地被去除。对于标记驱动DNA，可利用本身已知的任何方法，只要其能够分离标记DNA和非标记DNA。除了实施例中所用的抗生物素蛋白以外，还可能采用例如地高辛、荧光素、罗丹明等。
在从混合液中去除由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA(操作(2e))时，依赖于标记，采用本身已知的方法可进行去除。当生物素用作标记时，例如与抗生物素蛋白键合的Dyna珠(Dynabead)能够去除靶DNA和驱动DNA杂交的双链DNA。可举例的是利用抗标记的抗体的方法。
还有可能的是，在靶DNA被片段化之后，将接头连接物添加其上(操作(2c))。结果是在浓缩操作后，通过PCR扩增并整合到克隆载体中可变得更容易。
同时，关于其他操作，它们与上述(1a)-(1d)相同。
本发明另一优选的实施方案是浓缩稀有基因的方法，其中稀有基因以下列方式从丰度基因中分离出来(3a)将DNA样品一分为二(其中一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分)，(3b)在各个驱动DNA组分和靶DNA组分中切割DNA，以使驱动DNA的分子量低于靶DNA的分子量，以及如果需要，使接头连接物连接到靶DNA上，(3c)在各个驱动DNA组分和靶DNA组分中使DNA制成单链，(3d)将如此制成单链的驱动DNA固定于载体上，(3e)让其中固定有单链驱动DNA的载体与制成单链的靶DNA溶液接触或混合从而进行杂交，(3f)使载体与溶液分离，并将与驱动DNA形成双链的靶DNA去除以及(3g)利用(3f)中获得的靶DNA溶液代替靶DNA溶液进行一次或多次(3e)和(3f)的操作。
为了有效去除驱动DNA和靶DNA杂交的双链DNA，也优选在杂交前先将驱动DNA固定于载体上，取代用驱动DNA标记(操作(3c))。关于将驱动DNA固定在载体上的方法，可利用本身已知的方法。其例子是用硝酸纤维素膜或尼龙膜吸附的方法以及物理吸附在用聚赖氨酸涂层的玻璃表面上，或用硅烷处理的玻璃表面上。另一例子是将上述标记有生物素的驱动DNA固定在把链霉抗生物素蛋白制成固相的载体上。
当驱动DNA如此固定到载体上时，有可能通过分离载体和靶DNA溶液(操作(3f))，由驱动DNA和靶DNA形成的多数双链DNA，或换言之，丰度基因容易从靶DNA的溶液中去除。
此时为了高精度地去除丰度基因，在去除进行的同时检查丰度基因的去除状态也是有效的。所以，在本发明中，还有可能运用如其中利用去除的双链DNA溶液或利用回收的单链DNA溶液对丰度基因的去除程度进行监控的方法，以及如果需要，可进行剩余丰度基因被去除的操作(2f)或(3g)。此种方法可以是本身已知方法的组合，以及特定的实施方案显示在图6中。如上进行同样操作直至杂交的双链DNA被去除。利用去除的双链DNA溶液，以及采用本身已知的方法检测其中的丰度基因。如果结果是丰度基因基本上不被检测到或与初始去除的双链DNA溶液中的丰度基因的浓度比较所述量降低显著，则表示溶液中的丰度基因是少的，因此，没有必要进一步进行操作(2f)或(3g)，但为了获得稀有基因可能要进行这一步骤。与之相反，如果获得相反结果，则优选进行上述操作(2f)或(3g)。
为了监控丰度基因的去除程度，利用序列(共同序列)作为标记有可能评价丰度基因的量，所述序列与大量存在的生物物种的基因组相同。为了测定共同序列的现有量，有可能利用杂交方法，其中共同序列是探针，或利用PCR方法，其中共同序列是引物。关于共同序列，在从混有多种生物的样本中提取DNA的情形下，存在于编码rRNA(rDNA)基因中的共同序列是优选的。这是因为，由于rDNA的碱基序列对许多生物物种来说是已知的，容易找到rDNA的共同序列，并且还由于每个基因组rDNA高的拷贝数，因此，rRNA的共同序列作为标记是有利的。当大量存在的生物物种受到限制，如它们限制在原核生物中的时候，则有更多的共同序列。当生物物种进一步受到限制，如限制到放线菌的时候，则还要有更多的共同序列。没有必要将共同序列限制到rDNA，但其可以是大量存在的生物物种的基因组中的共同序列，如存在于编码在所述生物物种中普遍存在的蛋白的基因中的共同序列。例如，由于细胞色素C基因存在于所有生物物种中，以及其碱基序列在许多生物物种中是已知的，因此存在于细胞色素C基因中的共同序列作为标记是适当的。
当DNA样品中的丰度基因源自相同生物物种中的生物个体、生物组织或细胞时，特异于所述生物物种的基因可用作评价丰度基因量的标记。当DNA样品是源自相同生物物种的生物个体、生物组织或细胞的cDNA时，具有多表达量的基因可用作标记。
优选的是重复操作(2f)或(3g)的数不可统一确定，但考虑到Cot值，通过N次操作回收的DNA组分中的多个回收的DNA组分置于基因制备操作之下。这是因为，其结果是有可能从多个DNA组分中获得有用的基因，所述DNA组分对其中第一样品中的存在数有区别的微生物/生物的各个基因具有不同的存在浓度。随着重复操作的继续，最低量的基因可更容易获得。
本发明更优选的实施方案是如下所述的方法(4a)把DNA样品分成两等份(其中一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分)以及(4b)利用限制性酶，并且在靶DNA组分的情形下，将其切割成平均链长约为1000个碱基对或更多的长DNA(靶DNA)，以及平均链长约为200-300个碱基对的短DNA(驱动DNA)；(4c)驱动DNA被化学性地生物素化；(4d)将所述生物素化的驱动DNA(其混合量d)和靶DNA(其混合量t)混合从而使它们的混合比(d/t)大于1但不大于1000，或优选约10，由此所述混合液中的DNA被制成单链并且在液相中进行杂交；(4e)抗生物素蛋白Dyna珠加入到混合液中，从而由驱动DNA和靶DNA杂交形成的双链DNA被去除。因此，连接到驱动DNA上的生物素就和抗生物素蛋白形成复合物。所以，与驱动DNA杂交的靶DNA被Dyna珠捕获。由于Dyna珠通过离心可被轻易分离，因此，通过驱动DNA和靶DNA的杂交所形成的双链DNA也可与Dyna珠一起被轻易去除。此时，由驱动DNA和单链驱动DNA所形成的双链DNA也被去除。(4f)利用(4e)中所获得的上清液代替靶DNA进行一次或多次(4d)和(4e)的操作。
当利用如上所述的根据本发明的浓缩基因的方法时，制备DNA样品，其特征在于处理前稀有基因与丰度基因的存在比例在处理后增加。稀有基因可从DNA样品中制备。在制备中，可利用本身已知的方法，如在“分子克隆”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中所述的方法。也可利用市场上销售的试剂盒。如果此时利用添加的连接物接头的序列，则采用本身已知方法有可能容易克隆。关于制备的稀有基因，其碱基序列可被译码成原样，在整合到适当载体中并进行亚克隆之后，可进行碱基序列的译码。通过本身已知的方法可进行碱基序列的译码，如根据Maxam-Gilbert法或Sangar法的原理的方法，或者，可利用市场上销售的DNA测序仪。
本发明进一步提供浓缩上述DNA样品中稀有基因的试剂盒。更具体而言，优选的试剂盒包括切割DNA的装置、标记的物质或载体、标记DNA的试剂或将DNA固定在载体上的试剂、杂交试剂以及去除由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA的装置。在此，标记的物质或载体用于标记驱动DNA或用于固定驱动DNA，以便由驱动DNA和靶DNA的杂交所形成的双链DNA容易被去除。顺带而言，“标记DNA的试剂”表示用于标记驱动DNA的试剂，以及“将DNA固定在载体上的试剂”表示用于固定驱动DNA的试剂。更具体而言，可适当利用那些在以上方法中所提及的浓缩稀有基因的方法。关于试剂盒的组成、形式等，可利用本身已知的技术。
本发明进一步提供浓缩DNA样品中稀有基因的设备。更具体而言，提供了用于浓缩稀有基因的设备，其包括(a)一种装置，其中将靶DNA和标记驱动DNA的混合液中的DNA制成单链，(b)一种装置，其中进行杂交，(c)一种装置，其中依赖于标记驱动DNA，由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA被去除，以及(d)一种装置，其中利用由(c)获得的从中双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA，以及重复(b)和(c)的操作。各个装置与涉及上述浓缩稀有基因方法的描述是相同的。各个装置的组合可依据本身已知的方法。还有可能的是进一步将下列装置与其组合(a)一种装置，其中在驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA被切割以使驱动DNA的分子量制成低于靶DNA的分子量，(b)一种装置，其中标记驱动DNA，或者(c)一种装置，其中将接头连接物连接到靶DNA上。根据本发明，浓缩DNA样品中稀有基因的设备的另一实施方案是浓缩稀有基因的设备，其包括(a)一种装置，其中使制成单链的驱动DNA固定于载体上，(b)一种装置，其中将固定有单链驱动DNA的载体与制成单链的靶DNA的溶液接触或混合以便进行杂交，(c)一种装置，其中分离载体和溶液从而去除靶DNA与驱动DNA形成的双链，以及(d)一种装置，其中利用(c)中获得的靶DNA溶液代替靶DNA溶液重复(b)和(c)的操作。各个装置与涉及上述浓缩稀有基因方法的描述是相同的。各个装置的组合可依据本身已知的方法进行。还有可能的是(a)一种装置，其中在驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA被切割以使驱动DNA的分子量制成低于靶DNA的分子量，(b)一种装置，其中将接头连接物连接到靶DNA上，或者(c)一种装置，其中在各个驱动DNA组分和靶DNA组分中的DNA制成单链。
顺便提及，在本实施例中，采用下列限制性酶、缓冲液、试剂等。依据产品使用说明，进行各个限制性酶、试剂等的应用。
(a)MspI(由Takara Shuzo制造)10单位/μl[溶剂10mMKPO4、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.02％牛血清白蛋白(下文简称为BSA)以及50％甘油(pH7.5)](b)Sse8387I(由Takara Shuzo制造)10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、50mM NaCl和100μg/ml BSA(c)TE10mM Tris-HCl，pH7.5(d)10×M10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、10mMDTT和500mM NaCl(e)10×Mirus标记缓冲液A(Mirus)200mM MOPS，pH7.5(f)20×SSC3M NaCl和0.3M柠檬酸三钠(g)甲酰胺在加入完全再生的20-50目的AG501-x8(BioRadLab.，USA)后，将混合物旋转混合一夜，并利用所得的上清液。
(h)W×B5mM Tris-HCl、0.5mM EDTA和1M NaCl(i)Dyna珠(Dyna珠M-280链霉抗生物素蛋白，日本Dynal K.K.)让Dyna珠的悬浮液(1ml)分离成Dyna珠和液相，把Dyna珠重悬浮于含有tRNA(20μg/ml)W×B中，并通过Dynal MPC分离出珠和液相。再重复一次，最终，将Dyna珠悬浮于含有tRNA(20μg/ml)W×B中，并把必要量的悬浮液放置在各个测试管中。[操作1.DNA混合液的制备]将大肠杆菌DNA(80μg)和8ng短小芽孢杆菌DNA溶解于440μl的TE以生成液体A。
将人DNA(80μg)、80ng大肠杆菌DNA以及0.8ng短小芽孢杆菌DNA溶于700μl的TE以生成液体B。[操作2.驱动DNA的制备(DNA的断裂和生物素化)]向含有75μg大肠杆菌DNA和7.5ng短小芽孢杆菌DNA的液体A中加入120μl的10×B、600单位的MspI和水以制成1.2ml，并将此混合物37℃下保持2小时以切割DNA，然后在60℃下处理15分钟从而使MspI失活。反应液分成三份，并将DNA片段用乙醇沉淀，然后用离心分离器处理回收(下文它们将被称为E/B混合DNA片段)。
向含有75μg人DNA、75ng大肠杆菌DNA和75ng短小芽孢杆菌DNA的液体B中加入120μl的10×B、600单位的MspI和水以制成1.2ml，并将此混合物37℃下保持2小时以切割DNA，然后在60℃下处理15分钟使MspI失活。反应液分成三份，并将DNA片段用乙醇沉淀，然后用离心分离器处理回收(下文它们将被称为H/E/B混合DNA片段)。
各个测试管(各含1/3等量的混合DNA片段)中的沉淀物溶解于200μl的水和25μl的10×Mirus标记缓冲液A，然后加入25μl的Mirus标记IT试剂，并在37℃下反应2小时，于是DNA就标记有生物素。向此溶液中加入25μl的5M NaCl和550μl的乙醇，并把此混合物保藏于-20℃(下文生物素化的E/B混合DNA片段将简称为E/B驱动DNA以及生物素化的H/E/B混合片段将简称为H/E/B驱动DNA)。[操作3.靶DNA的制备(DNA的断裂)]向含有2.5μg大肠杆菌DNA和0.25ng短小芽孢杆菌DNA的液体A中加入10μl的10×M、10μl的0.1％BSA、20.4单位的Sse8387I和水以制成100μl，并将此混合物37℃下保持2小时以切割DNA，然后在60℃下处理15分钟使Sse8387I失活。向此反应液中加入20μg的tRNA、10μl的3M醋酸钠以及220μl的乙醇，并将此混合物保存在-20℃(该断裂的DNA下文简称为E/B靶DNA)。
向含有2.5μg人DNA、2.5ng大肠杆菌DNA和0.025ng短小芽孢杆菌DNA的液体B中加入10μl的10×M、10μl的0.1％BSA、20.4单位的Sse8387I和水以制成100μl，并将此混合物37℃下保持2小时以切割DNA，然后在60℃下处理15分钟使Sse8387I失活。向此反应液中加入20μg的tRNA、10μl的3M醋酸钠以及220μl的乙醇，并将此混合物保存在-20℃(该断裂的DNA下文简称为H/E/B靶DNA)。[操作4.杂交]将含有乙醇沉淀的E/B靶DNA的测试管以15,000rpm离心20分钟，并弃去上清液。向同样测试管中加入400μl乙醇沉淀的E/B驱动DNA的悬浮液，并将混合物以15,000rpm离心20分钟。弃去上清液，加入425μl乙醇沉淀的E/B驱动DNA的悬浮液，将此混合物离心并弃去上清液。室温下把最终沉淀物溶解于9.28μl水和0.96μl的3NNaOH中，将此混合物在冰上快速冷却，向其中加入0.96μl的3N HCl和50mM Tris-HCl(pH7.2)，然后加入8μl的20×SSC和20.8μl的甲酰胺，接着混合均匀。其中滴入一滴矿物油，并将此混合物用盖子紧紧封住，保持在37℃下以便进行杂交反应。
将H/E/B靶DNA和H/E/B驱动DNA相似处理以便进行杂交反应。
N0表示DNA溶液，其中杂交和非杂交操作进行N次。
24小时后，取出20μl的杂交反应液，并加到其中放置了1ml等量的Dyna珠悬浮液的测试管中。剩余物(10和20)继续加热。通过在43℃的恒温浴中加热，通常将所述测试管混合50分钟。使其置于Dynal MPC下并放置几分钟，液相分成两等份，并将各份加入到两个其中放置了1ml在-20℃冷却乙醇的测试管中，让其放置在-80℃的冷冻室中35分钟，并以15,000rpm离心20分钟以获得沉淀物。将测试管(A)之一中的沉淀物溶解于80μl水+10μl的3N NaOH中，并将总量转移到另一个测试管(B)中以便溶解沉淀物。在另一方面，使1/3等量的驱动DNA以同样条件下离心，分离出沉淀物，将此沉淀物溶解于80μl水+10μl的3N NaOH中，测试管(A)用此45μl洗涤，并把全部量洗到(B)中。向(B)中加入15μl的3N HCl和50mM Tris(pH7.2)，然后加入300μl的-20℃乙醇，接着混合，并让混合物放置在-80℃的冷冻室中30分钟或更长。向通过离心分离所获得的沉淀物中加入4.64μl水+0.48μl的3N NaOH从而在室温下充分溶解，将溶液在冰上快速冷却，然后依次向其中加入0.48μl的3N HCl+50mMTris-HCl(pH7.2)、4μl的20×SSC以及10.4μl甲酰胺。其上铺上一滴矿物油，并使混合物保持在37℃下。
20小时后，加入40μl含有tRNA(20μg/ml)的W×B，并混合，尽可能多地去除矿物油，加入以TE饱和的氯仿，并依据常规方法进行氯仿抽提。利用含有tRNA(20μg/ml)的W×B，把水相制成1ml并加入到其中放置了1ml等量的洗涤Dyna珠的测试管中。将此测试管43℃下保持50分钟，并在此期间，每隔1或2分钟将其混合。然后让其置于Dynal MPC中，并允许放置几分钟，将液相分成两等份，把各份加入到其中放置了1ml在-20℃冷却的乙醇的测试管中，允许在-80℃冷冻室中放置35分钟或更长时间，并以15,000rpm离心20分钟以便制备沉淀物。室温下将此沉淀物溶解于各50μl水和5μl的3NNaOH，并加到对应于一个试管的驱动DNA沉淀物中，加入10μl的3N HCl和50mM Tris(pH7.2)，然后加入220μl的-20℃乙醇，并让混合物在-80℃冷冻室中放置50分钟或更长时间。向离心的沉淀物中加入4.64μl水+0.48μl的3N NaOH，接着室温下充分溶解，在冰上快速冷却，依次加入0.48μl的3N HCl+50mM Tris-HCl(pH7.2)、4μl的20×SSC以及10.4μl甲酰胺，其上铺上一滴矿物油，接着保持在37℃下。
在213小时又50分钟后，取出10μl，加入40μl含有tRNA(50μg/ml)的W×B，如上所述去除矿物油，并将剩余物转移到测试管中，其中放置了500μl等量的洗涤Dyna珠，旋转，并附着到旋转机上后室温下混合过夜。将此置于Dynal MPC中以分离液相，用0.05ml等量的洗涤Dyna珠处理，并将所得最终液相用乙醇进行沉淀，以便回收DNA(30)。
另一方面，在119小时又5分钟后，从(10和20)中取出10μl。剩余物继续加温。取出的10μl用0.5ml等量的洗涤Dyna珠处理，以及如上相同，以乙醇和1/6等量的驱动DNA回收沉淀物。向沉淀物中加入9.28μl水+0.96μl的3N NaOH，接着室温下充分溶解，在冰上快速冷却，向其中依次加入0.96μl的3N HCl+50mM Tris-HCl(pH7.2)、8μl的20×SSC以及20.8μl甲酰胺，铺上一滴矿物油，然后37℃下保持87小时又10分钟。在去除矿物油后，由用1ml等量的洗涤Dyna珠处理所得到的液相进一步用0.1ml等量的洗涤Dyna珠处理，并将所得最终液相用乙醇沉淀以回收核酸(20)。
将保持加温的剩余物在37℃下保持289小时又20分钟，先用0.5ml再用0.05ml洗涤Dyna珠进行相似处理，以及将所得最终液相用乙醇沉淀以回收核酸(10)。
最后，向所有回收核酸的沉淀物中加入0.5μl ETHACHINMATE以及20μl的0.3N NaOH，37℃下处理1.5小时以便降解和去除过量tRNA，然后加入20μl的0.3N HCl+5mM Tris-HCl(pH7.2)，并通过乙醇沉淀回收DNA，接着溶解于TE中。
上述实验的流程由图表显示(图3)。各个组分的加温时间以及从中计算的Cot总结在下表中。
表1
沉淀物溶解于TE中，加入等份溶液以制备25μl的PCR反应液(其包括2.5μl的10×PCR缓冲液、2μl dNTP、0.25μl rTaq、1μl引物对以及模板DNA，并加入水补齐到25μl)，加入一滴矿物油，然后紧紧封住，进行35次循环的PCR，各循环条件为94℃/1分钟、60℃/1分钟以及72℃/2分钟，然后让混合物72℃下放置8分钟，并冷却至23℃。关于引物对，各利用0.5μl的Ef和Er(针对大肠杆菌基因)、Bf和Br(针对短小芽孢杆菌基因)或Hf和Hr(针对人基因)的混合物。
将下列各个寡核苷酸溶解于TE中，并把所得100μM溶液用作上述引物。
(a)大肠杆菌下列ompA ecompa.gb_bal，1-2271 CDS 172-669的部分用作引物。
Ef 1102-11195’-TCCGAAAGATAACACCTG-3’(SEQ ID NO1)Er 1892-19085’-GGGATACCTTTGGAGAT-3’(SEQ ID NO2)由PCR扩增的产物具有807个碱基对。
(b)短小芽孢杆菌下列xynA bpxyna.gb bal，1-1070 CDS 61-747的部分用作引物。
Bf 243-2605’-ATTTAGTGCAGGCTGGAA-3’(SEQ ID NO3)Br 650-6725’-CGTTTCATACATTTTCCCCATTG-3’(SEQ IDNO4)由PCR扩增的产物具有430个碱基对。
(c)人类下列IL5hj03478.gb pr2，1-3220的部分用作引物。
Hf 1600-16295’-ACTTTTTGAAAATTTTATCTTAATATGTGG-3’(SEQ ID NO5)Hr 1981-20075’-TGGCCGTCAATGTATTTCTTTATTAAG-3’(SEQ ID NO6)由PCR扩增的产物具有408个碱基对。
采用下列其他溶液(i)10×PCR缓冲液100mM Tris-HCl、pH 8.3+500mMKCl+15mM MgCl2(ii)dNTP混合物各2.5mM的dATP+dGTP+dCTP+dTTP(iii)Taq5单位/μl(溶剂20mM Tris-HCl+100mM KCl+0.1mMEDTA+1mM DTT+0.5％Tween 20+0.5％Nonidet P-40+50％甘油)(iv)DNA模板[结果1]如图4A所示，E/B DNA混合液的大肠杆菌基因和短小芽孢杆菌基因的PCR产物条带很好反映了各DNA的量。当其进行一次杂交(10)时，大肠杆菌基因和短小芽孢杆菌基因变成近乎相同的量。当其进一步进行二次(20)和三次(30)杂交时，结果为大肠杆菌基因＜＜短小芽孢杆菌基因(图5A)。因此，主要去除了混合物中占大多数的大肠杆菌基因。这显示相对浓缩程度远大于10,000倍。
如图4B将显示的，H/E/N DNA混合物中人基因、大肠杆菌基因和短小芽孢杆菌基因的PCR产物的条带很好反映了各DNA的量。由于短小芽孢杆菌基因在DNA混合物中仅以很少量存在，因此与其中仅有短小芽孢杆菌DNA以很少量存在的情形相比较，有许多非特异条带，430个碱基对的特异条带有轻微显示。当其进行杂交三次(30)时，注意的是与人基因比较，大肠杆菌基因显著被浓缩(图5B)。由于同对照PCR的情形比较，人基因为约数十分之一，而大肠杆菌基因为5-10倍(图4B)，浓缩程度经计算为约数百倍。在短小芽孢杆菌基因的情形下，出现了非特异条带，特异条带也能被清晰地鉴定，以及与污染DNA比较，注意的是实现了显著的浓缩。此时，浓缩不如与大肠杆菌基因相比的显著，这可被解释来支持首先过量存在的人DNA被特异性去除的事实。
在实施例2中，采用如实施例1中同样的酶、缓冲液、试剂等，以及关于实施例1中未提及的材料，采用下列材料(a)10×Mirus标记缓冲液A(Mirus)200mM MOPS、pH7.5
(b)糖原20mg/ml(c)MAGNOTEX-SA(Takara Shuzo)利用MAGNOTEX-SA试剂盒通过试剂盒手册中所述的方法将杂交DNA去除。因此，把MAGNOTEX-SA(50μl；1mg)放置在1.5ml的试管中，让试管在磁力搅拌器中振荡1分钟，并将上清液去除。2×结合缓冲液为试剂盒随带，其与相同量的生物素标记的DNA溶液混合，加入到试管中，混合后室温下放置10分钟。让试管在磁力搅拌器中振荡1分钟，并将上清液回收。另将200μl的1×结合缓冲液加入到MAGNOTEX-SA中并洗涤，然后重复洗涤一次。混合后，使试管在磁力搅拌器上振荡1分钟，然后将上清液回收。[操作1.DNA混合液的制备]将大肠杆菌DNA(80μg)和80ng的希氏硫化叶菌DNA溶解于440μl的TE中以制备液体A。[操作2.驱动DNA的制备(DNA的断裂和生物素化)]向含有75μg的大肠杆菌DNA和75ng的希氏硫化叶菌DNA的液体A加入120μl的10×B，600单位的MspI和水以制成1.2ml，将混合物37℃下保持2小时以便切割DNA，然后60℃下处理15分钟使MspI失活。把反应液分成三等份，用乙醇沉淀DNA片段，并通过离心分离器回收(下文将这简称为E/S混合DNA片段)。
将各个测试管(含有1/3等量的E/S混合DNA片段)中的沉淀物溶解于200μl的水和25μl的10×Mirus标记缓冲液A，然后加入25μl的Mirus标记IT试剂，并在37℃下反应2小时以便用生物素标记DNA。向此反应液中加入25μl的5M NaCl和550μl的乙醇，并将混合物储存在-20℃下。[操作3.靶DNA的制备(DNA的部分水解)]向含有2.5μg希氏硫化叶菌DNA的液体A中加入10μl的10×M、10μl的0.1％BSA、20.4单位的Sse8387I和水以制成100μl，并将此混合物37℃下保持2小时以切割DNA，然后在60℃下处理15分钟以使Sse8387I失活。向此反应液中加入10μg的NaOAc、220μl的乙醇以及1μl的糖原，接着在-20℃下搅拌(下文将此称为E/S靶DNA片段)。[操作4.杂交]将含有乙醇沉淀的E/S靶DNA的测试管以15,000rpm离心20分钟，并弃去上清液。向同样测试管中加入400μl乙醇沉淀的E/S驱动DNA的悬浮液，以15,000rpm离心20分钟。弃去上清液，加入425μl乙醇沉淀的E/S驱动DNA的悬浮液，将此混合物离心并弃去上清液。将最终获得的沉淀物室温下溶解于9.28μl水和0.96μl的3N NaOH中，并在冰上快速冷却，然后向其中加入0.96μl的3N HCl和50mMTris-HCl(pH7.2)，接着加入8μl的20×SSC和20.8μl的甲酰胺，混合均匀，并将此混合物称为00。其中滴入一滴矿物油，并将此混合物用盖子紧紧封住，37℃下保温以进行杂交反应。24小时后，取出10μl的杂交反应液，并利用1mg的MAGNOTEX-SA去除生物素标记的DNA。向回收的上清液中加入20μl的NaOAc、500μl的-20℃乙醇以及1μl糖原，沉淀物通过15,000rpm离心15分钟获得，并称为10。
利用1mg MAGNOTEX-SA对10μl(20)和20μl(30)的各个剩余杂交反应液也进行生物素标记的DNA的去除。向回收的上清液中加入20μl的NaOAc、500μl的-20℃乙醇以及1μl糖原，15,000rpm离心15分钟以生成沉淀物(20沉淀物A；30沉淀物B)。另一方面，1/3等量(20)和一管(30)的驱动DNA在相同条件下离心，沉淀物离心并溶解于80μl水+3N NaOH，将A和B全部溶解。其中加入15μl的3N HCl+50mM Tris-HCl(pH 7.2)之后，又加入300μl的-20℃乙醇，与其混合，并让此混合物在-80℃冷冻室中放置30分钟或更长。将通过离心制备的沉淀物室温下溶解于4.64μl水+0.48μl的3N NaOH中，并在冰上快速冷却，然后向其中依次加入0.48μl的3NHCl+50mM Tris-HCl(pH7.2)、4μl的20×SSC和10.4μl的甲酰胺，然后用一滴矿物油分层，并将此混合物37℃下保温。24小时后，从测试管A中取出10μl的杂交反应液，并采用上述同样方法回收靶DNA，并命名为20关于B，以上述相同的方式，除去生物素标记的DNA，回收上清液，并以15,000rpm离心15分钟，得到沉淀物(30沉淀物C)。将驱动DNA(1/3等量)离心，分离出沉淀物，溶解在50μl水+10μl的3N NaOH中，并将C完全溶解。加入10μl的3N HCl+50mM Tris(pH7.2)之后，再加入300μl的-20℃乙醇，混合，让此混合物在-80℃冷冻室中放置50分钟或更长时间，将离心制备的沉淀物在室温下充分溶解于4.64μl水+0.48μl的3N NaOH中，并在冰上快速冷却，然后向其中依次加入0.48μl的3N HCl+50mM Tris-HCl(pH7.2)、4μl20×SSC和10.4μl甲酰胺，接着加入一滴矿物油分层，并将此混合物在37℃保温。24小时后，从测试管C中取出10μl杂交反应溶液，并采用相同的方法回收靶DNA以生成30。最终，将所有回收的DNA沉淀物溶解于50μl的1×TE中。[测试实施例1.检查DNA组分中的基因]制备PCR溶液(包含2.5μl的10×PCR缓冲液、2μl的dNTP、0.25μl的rTaq、1μl引物对、3μl模板DNA，加水补齐到25μl)，采用热循环仪(Takara Shuzo)进行35次循环的PCR，循环条件为94℃/1分钟、60℃/1分钟和72℃/2分钟，随后在72℃下放置8分钟并冷却至4℃。关于引物对，各利用0.5μl的Ef和Er(针对大肠杆菌基因)和Sf和Sr(针对希氏硫化叶菌基因)。
将下列各个寡核苷酸溶解于TE中以制备100μM溶液，并将此用作上述引物。
(a)大肠杆菌下列部分ompA基因(ecompa.gb_bal)用作引物。
Ef2 5’-TCCGAAAGATAACACCTG-3’(SEQ ID NO7)Er2 5’-GGGATACCTTTGGAGAT-3’(SEQ ID NO8)通过PCR扩增的产物具有807个碱基对。
(b)希氏硫化叶菌下列部分酯酶基因(EstI)用作引物。
Sf 5’-ATGCCCCTAGATCCTCGAATC-3’(SEQ ID NO9)Sr 5’-TCAACTTTTATCATAAAATGTACG-3’(SEQ ID NO10)通过PCR扩增的产物具有918个碱基对。
关于其他溶液，利用下列材料(i)10×PCR缓冲液100mM Tris-HCl(pH8.3)+500mMKCl+15mM MgCl2(ii)dNTP混合物各2.5mM的dATP+dGTP+dCTP+dTTP(iii)Taq5单位/μl(溶剂20mM Tris-HCl+100mM KCl+0.1mMEDTA+1mM DTT+0.5％Tween 20+0.5％Nonidet P-40+50％甘油)(iv)DNA模板[测试实施例2.通过实时PCR进行定量测定]为了分析DNA混合物中各种基因存在的比例，通过实时PCR方法对各个循环的样品扩增方式进行分析。由于通过上述PCR方法，不可能分析各个基因存在的比例，因此，采用Light Cycler快速系统330(由Roche Diagnostics制造)对大肠杆菌基因和希氏硫化叶菌基因的存在比例进行分析。
PCR反应液的组成包括5μl模板DNA、2μl的Light Cycler-DNAmaster SYBR Green I、1μl引物对以及1.6μl的25mM MgCl2(终浓度3mM)，其中用水补齐到20μl。
将下列各个寡核苷酸溶解于TE中，并把所得10μM溶液用作上述引物。
(a)大肠杆菌下列ompA的部分(ecompa.gb_bal)用作引物。
Ef2 5’-TCCGAAAGATAACACCTG-3’(SEQ ID NO7)Er2 5’-GGGATACCTTTGGAGAT-3’(SEQ ID NO8)由PCR扩增的产物具有807个碱基对。
(b)希氏硫化叶菌下列酯酶基因(EstI)的部分用作引物。
Sf 5’-ATGCCCCTAGATCCTCGAATC-3’(SEQ ID NO9)Sr 5’-TCAACTTTTATCATAAAATGTACG-3’(SEQ ID NO10)由PCR扩增的产物具有918个碱基对。[结果2]如图7所示，注意的是随着其被浓缩，大肠杆菌的条带逐渐减少，以及在30时，实现完全去除。另一方面，确认的是希氏硫化叶菌基因的量在整个系列步骤中几乎相同(顺带而言，低分子量的条带据认为是引物变成的二聚体)。非特异条带整体上是多的原因据认为是靶DNA组分被Sau3A1消化的事实。
在大肠杆菌DNA的扩增曲线中，在靶DNA、10DNA、20DNA和30DNA的情形下，分别在18.2、20.74、23.31和23.80个循环处观察到指数生长期，从上文注意的是，靶DNA拷贝数减少最大，并以10、20和30的次序降低，于是占大部分的大肠杆菌DNA主要被去除。
另一方面，在希氏硫化叶菌DNA的扩增曲线中，对靶DNA和10DNA为19.22个循环、对20DNA为20.58个循环以及对30DNA为20.65个循环，尽管注意到在10→20中有降低，但是与大肠杆菌的降低速率比较，即使在系列浓缩步骤之后该存在比例几乎没有改变。进一步，作为两次杂交的结果，大肠杆菌DNA和希氏硫化叶菌DNA的量变成几乎相同，以及作为三次杂交的结果，为大肠杆菌DNA＜＜希氏硫化叶菌DNA。从上述结果中，通过定量法确认，当利用实时PCR方法对DNA混合液中各基因的存在比例进行分析时，图7的电泳结果所示大肠杆菌DNA被选择性去除。
工业实用性采用根据本发明所述的浓缩稀有基因的方法、浓缩稀有基因的试剂盒或浓缩稀有基因的设备，现在有可能将DNA样品中的稀有基因浓缩至比丰度基因更多的程度。此外，没有必要从DNA样品中被去除的一定是一种已知的丰度基因。因此，本发明的优点有例如DNA或从样本中抽提的类似物可用作样品，所述样本来自自然界如土壤、湖水或河水。
如所指的，当稀有基因被浓缩时，有可能大大降低用于克隆所述基因的待筛选基因文库的总克隆数。结果可能显著降低人力、成本和时间。因此，有用基因，例如在化学工业方面是重要的酶的基因，或抗生素和用于药物和农业化学品的前导化合物的合成基因组，可比常规方法更容易、更快速地获得。除了上述以外，利用根据本发明所述的浓缩稀有基因的方法，获得细胞表面抗原的基因也是可能的，以及采用所述基因或基因信息制备抗体，由此来鉴别具有抗原的细胞或微生物，或利用细胞分类器如FACS分离所述细胞或微生物。还有可能的是通过分析分离细胞或微生物的总基因组的碱基序列而获得新基因。另有可能的是通过根据本发明所述的方法或设备浓缩寄生或感染动物或植物包括人类的微生物的基因，由此鉴别寄生或感染的微生物，以及阐明和充分利用所述基因的功能仍是有可能的。照此，各种各样的应用是可能的。
序列表<110>三得利株式会社(SUNTORY LIMITED)<110>株式会社三得利生物医学研究所(SUNTORY BIOMEDICAL RESEARCH LTD.)<120>基因的浓缩方法(METHOD FOR CONCENTRATION OF GENE)<130>SCT030569-47<150>JP2000-386025<151>2000-12-19<160>10<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Ef<400>1tccgaaagat aacacctg 18<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>Er<400>2gggatacctt tggagat 17<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Bf<400>3atttagtgca ggctggaa 18<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>Br<400>4cgtttcatac attttcccca ttg 23<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Hf<400>5actttttgaa aattttatct taatatgtgg 30<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Hr<400>6tggccgtcaa tgtatttctt tattaag 27<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Ef2<400>7tccgaaagat aacacctg 18<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>Er2<400>8gggatacctt tggagat 17<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>Sf<400>9atgcccctag atcctcgaat c 21<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>Sr<400>10tcaactttta tcataaaatg tacg 24
权利要求
1.一种浓缩少量存在的基因的方法，其特征在于，将含有少量存在的基因和大量存在的基因的DNA样品进行下列操作以使少量存在的基因从大量存在的基因中分离出来(a)将DNA样品分成两等份，一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分；(b)将靶DNA和驱动DNA混合，并使混合液中的DNA制成单链，或者，先使靶DNA和驱动DNA制成单链，然后再混合；(c)杂交，并将由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA从上述混合液中去除；以及(d)将(b)和(c)的操作进行一次或多次，其中利用(c)中所获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA。
2.一种浓缩少量存在的基因的方法，其特征在于，将含有少量存在的基因和大量存在的基因的DNA样品进行下列操作以使少量存在的基因从大量存在的基因中分离出来(a)将DNA样品分成两等份，一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分；(b)将驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA组分切割，此时，驱动DNA的分子量被制成低于靶DNA的分子量；(c)标记驱动DNA，如果需要，将接头连接物连接到靶DNA上；(d)让靶DNA与过量的标记驱动DNA混合，然后使混合液中的DNA制成单链并进行杂交；(e)通过标记驱动DNA，将由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA从上述混合液中去除；以及(f)将(d)和(e)的操作进行一次或多次，其中利用(e)中所获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA。
3.根据权利要求
1或2所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中驱动DNA的混合量(d)与靶DNA的混合量(t)的比例(d/t)大于1至高达1000。
4.根据权利要求
2或3所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中驱动DNA标记有生物素、地高辛、荧光素或罗丹明。
5.根据权利要求
2-4所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中驱动DNA平均链长为200-300个碱基对，以及靶DNA平均链长为1000或更多个碱基对。
6.根据权利要求
2-5所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中通过4个碱基识别的限制性酶对驱动DNA组分进行DNA切割，而通过5-8个碱基识别的限制性酶对靶DNA组分进行DNA切割。
7.根据权利要求
6所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中通过MspI对驱动DNA组分进行DNA切割，而通过Sse8387I对靶DNA组分进行DNA切割。
8.根据权利要求
2-5所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中DNA切割通过超声波或机械剪切力进行。
9.一种浓缩少量存在的基因的方法，其特征在于，将含有少量存在的基因和大量存在的基因的DNA样品进行下列操作，以使少量存在的基因从大量存在的基因中分离出来(a)将DNA样品分成两等份，一份DNA样品称为驱动DNA组分，而另一份DNA样品称为靶DNA组分；(b)将驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA组分切割，此时，驱动DNA的分子量被制成低于靶DNA的分子量，如果需要，将接头连接物连接到靶DNA上；(c)将驱动DNA组分和靶DNA组分中的各个DNA制成单链；(d)使如此制成单链的驱动DNA固定在载体上；(e)让其上固定有单链驱动DNA的载体与制成单链的靶DNA溶液接触或混合从而进行杂交；(f)将载体和溶液分开，并去除与驱动DNA形成双链的靶DNA；以及(g)利用(f)中所获得的靶DNA溶液代替靶DNA溶液，将(e)和(f)的操作进行一次或多次。
10.根据权利要求
1-9所述的浓缩少量存在的基因的方法，其中DNA样品是从中混有至少两种微生物、生物体、生物组织或细胞的样本中制备的DNA样品或是从生物个体、生物组织或细胞中抽提的核酸，和/或从所述核酸中制备的DNA样品。
11.一种通过权利要求
1-10所述方法制备的DNA样品，其特征在于，在处理前原有少量稀有基因与原有多量基因的比例在处理后增加。
12.一种分析稀有基因的方法，其包括下列步骤通过权利要求
1-10所述的方法浓缩少量存在的基因(下文简称“稀有基因”)、从稀有基因被浓缩的所得DNA样品中获得稀有基因以及对稀有基因的碱基序列进行分析。
13.从通过权利要求
1-10所述方法得到的DNA样品中获取的基因，其中少量存在的基因被浓缩。
14.一种浓缩稀有基因的设备，其包括(a)一种装置，其中使靶DNA和标记驱动DNA的混合液中的DNA制成单链，(b)一种装置，其中进行杂交，(c)一种装置，其中通过标记驱动DNA而去除由驱动DNA和靶DNA形成的双链DNA，以及(d)一种装置，其中利用由(c)所获得的双链DNA被去除的DNA溶液代替靶DNA，以及重复(b)和(c)的操作。
15.一种浓缩稀有基因的设备，其包括(a)一种装置，其中使制成单链的驱动DNA固定于载体上，(b)一种装置，其中将固定有单链驱动DNA的载体与制成单链的靶DNA的溶液接触或混合从而进行杂交，(c)一种装置，其中将载体和溶液分开，以去除与驱动DNA形成双链的靶DNA，以及(d)一种装置，其中利用(c)中所获得的靶DNA溶液代替靶DNA溶液重复(b)和(c)的操作。
16.一种浓缩稀有基因的试剂盒，其包括DNA切割的装置、标记的物质或载体、标记DNA的试剂或将DNA固定到载体上的试剂、杂交试剂以及去除由驱动DNA和靶DNA所形成的双链DNA的装置。
专利摘要
本发明提供一种方法，其中有可能从大量表达的基因和仅少量表达的基因的混合物中浓缩仅少量表达的基因，即使大量表达的基因未知。
文档编号C12Q1/68GKCN1473196SQ01818521
公开日2004年2月4日 申请日期2001年12月18日
发明者中里纮, 中里 申请人:三得利株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan