腋臭相关基因的定位方法

专利名称：腋臭相关基因的定位方法
技术领域：
本发明涉及遗传学、分子生物学、皮肤科学、临床医学、基因组学，更具体地涉及一种与定位、寻找、鉴定与腋臭相关的一个或一组基因(或位点)的方法。
背景技术：
近十余年来，高血压、糖尿病、肿瘤等多基因病的分子遗传学研究倍受重视，国内外在这方面研究资助强度不断增加，HGP草图的提前完成，为分子遗传学研究提供了丰富的遗传标志，如第一代的限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)[Chang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988；856856-6860]，第二代的小卫星DNA(minisatellite DNA，or variablenumber tandem repeats，VNTR)和微卫星DNA(microsatellite DNA，or短串联重复片段，short tandem repeats，STR)，第三代的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)等，它们在人类基因组中广泛分布，每20kb就有一个核心系列为3bp或4bp的STR位点，编码区及非编码区均有[EdwardsA，Civitello A，Hammond HA，Caskey CT.DNA typing and tetrameric tandemrepeats.Am.J.Hum.Genet.1991；49746-756]，估计约每400bp就有一个碱基不同，即有一个SNP。这些众多的多态性标记是进行遗传连锁分析和关联分析的重要“路标”，有助于基因的鉴定和定位。近年来许多遗传性疾病、肿瘤都是采用该方法对相应的致病基因成功定位的[Lander ES.The new genomics globalviews ofbiology.Science 1996；274536-9]。
寻找并获取疾病基因是国内外一个重要的研究方向与任务。目前，国内外研究主要偏重于高血压、糖尿病、心血管疾病、肿瘤等对人类生命和健康危害程度大的疾病的研究，但寻找和克隆这些疾病相关基因具有相当的难度，主要由于(1)致病因素及病理生理发生机制的复杂多样性。发病机制十分复杂，有的迄今仍未阐明，如血压调控的分子机制未明等。(2)环境因素和遗传因素有交互作用。(3)临床表现或症状多样而复杂。大多具有非单一的临床表现，或是多种具有不同病因所至临床表现的综合症，呈异质性，有些又表现外显不全等，故诊断标准难于把握，对采集疾病样本的一致性有影响，从而掩盖真正的致病因素，影响其后的相关分析结果。这也是目前关于这类疾病的相关或易感基因的报道很多，但很难或无法重复的重要原因。(4)基因的异质性。不同个体、不同民族，在不同条件下基因都存在结构上和表达上的差异。(5)侯选基因的局限性。所以对这类重大疾病的相关或易感基因的研究方面，虽然投入了大量资金，有一些成绩，但效果不大。若在这类多基因病的发病机理及遗传模式上无所突破，及没有出现更为适合的多基因病的研究策略、技术和方法，这类疾病相关或易感基因的克隆和定位是无法有更深层次的进展的，无法走出目前的“瓶颈”状态。
腋臭，这个为人所忽略的单/多基因病，就其危害程度，虽然不及高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等多基因病严重，但是具有其突出特点和研究的方便之处，表现为(1)分析样本的有效性好。腋臭临床表现明显单一，仅累及腋部大汗腺，诊断明确，不会误诊，加之腋臭不影响生存，发病早，收集的家系较完整。(2)本病大部分有家族史，且伴有油脂状耵聍栓塞、色汗等，其遗传方式比较符合单基因遗传病的“常染色体显性遗传”。(3)大汗腺活动受神经内分泌等支配。这些都提示大汗腺活动与这些系统之间存在某些关联。(4)人体的体味具有个体特异性，有种族和人群差别，呈数量性状遗传，而大汗腺的分泌物所发散的气味是人体体味的重要组成部分之一。

发明内容
为了从分子水平认识腋臭的发病机制、遗传方式，为数量性状的研究提供素材和思路，本发明的目的是提供一种与定位、寻找、鉴定与腋臭相关的一个或一组基因(或位点)的方法。这种新的方法和思路都优于现有的方法，而且这种新的基因定位方法相对见效快、成本低。
为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是腋臭相关基因的定位方法，其特征是包括以下步骤(1)、家系的收集与处理收集经严格临床确诊的相对隔离封闭的腋臭大家系，作出系谱图分析，计算子代同胞间分离比是否同该病遗传方式所固有的理论分离比相一致。若所观察的分离比与理论分离比一致，则对腋臭遗传方式的假设成立，即为常染色体显性或是常染色体隐性遗传等。
若为显性性状，计算理论值同实际值之差的x2值，以求证腋臭的分离比是否符合常染色体显性遗传病的分离比。可按公式(1)计算x2值。x2=[(A-N)-1]2A+N]]>公式(1)(注A为患者子女数，N为正常子女数)若为隐性性状，可用下列几种方法。
方法一，先验法，即先假定一理论分离比，即有病子女占同胞总数的1/4，然后按公式估算期望值，将之与实际值相比，用统计方法证明实际值是否符合理论设想。
理论值或期望值按截尾二项分布律(1-q)估算。 公式(2)具方差为Σ[spq1-qs-s2p2q2(1-qs)2]·ns]]>公式(3)(注s＝同胞组大小，ns＝不同s同胞组的数目，p＝理论比例(即1/4或0.25)，q＝1-p)方法二，单病例法。其计算如公式(4)和(5)。根据估计的p值大小，来判断腋臭是否为常染色体隐性遗传病。P=R-JT-J]]>公式(4)(注p＝待校正的估计分离比，R＝患者总数，T＝同胞总数，J＝家庭内同胞中只有一例患者的家庭数)s.e.p=(R-J)(T-R)(T-J)3]]>公式(5)P值＝P±2s.e.p公式(6)方法三，Smith法[沈福民。群体遗传学与遗传浒病学，遗传医学，沈福民主编，上海医科大学出版社，1995，127-128]。
(2)、采集家系各成员血样，用常规有机溶剂法抽提基因组DNA；选择微卫星标志，使密度达到在染色体上平均覆盖约5～10cM，合成这些标志的PCR扩增产物，引物为荧光或非荧光的均可，以前者为佳，并利用复合PCR进行扩增；也可用目前商业化的试剂盒进行。电泳检测各标志的基因分型，并用DNA测序仪及相关软件系统对电泳所得数据进行分析处理。
(3)、连锁分析对基因初步定位采用直接法、Bernstein统计法、Fisherμ统计法、经典似然法、参数连锁分析对数优势记分法(或对数概率比记分法)等[Risch NJ.Searching for genetic determinants in the new millennium.Nature 2000；405847-856.Curtis D.Use of siblings as control in case-control associationstudies.Ann.Hum.Genet.1997；61319-333.Schaid DJ.Use of parents，sibs andunrelated controls for detection of associations between genetic markers and disease.AM.Jhum.Genet.1998；631492-1506.Terwilliger JD，Jurg Ott.Handbook ofhuman genetic linkage.The Johns Hopkins University Press，1994.Hawley ME，KiddKK，HAPLO.A program using the EM algorithm to estimate the frequencies ofmulti-site haplotypes.J.Hreed，1995；86(5)409-411.kruglyak L，Kaly MJ，Reeve-Daly MP，et al.Parametric and nonparametric linkage analysisa unifiedmultipoint approach.Am.J.Hum.Genet1996；581347-1363.]对腋臭基因进行初步定位；其中最大似然法可用公式(7)估算。当Zi(θ)＞3时，肯定连锁；当Zi(θ)≥2时，可能连锁；当Zi(θ)＜-2时，为不连锁；当-2＜Zi(θ)＜2时，不能判断是否连锁，需更多的家系资料。
Zi(θ)＝Log [pi(θ)/pi(0.5)] 公式(7)(注Zi＝第I家系，重组率为θ的优势对数值，pi(θ)和pi(0.5)分别为θ和0.5的该家系的概率)参数连锁分析法(Lods法)。其原理是通过计算不同重组率时获得不同家庭概率积与无连锁时的获得不同家庭概率乘积之比，即连锁相对概率(PR)，相对应PR最大值的即为所求的重组率。其计算公式如公式(8)和公式(9)。当Lods＞1时，提示存在连锁；当Lods＞3时，肯定连锁；当Lods≤-2时，否定连锁。相应的软件包括LIPEO、LINKAGE、GENEHUNTER、SAGE、VITESSE等；PR=Πilnpi(θ)Πilnpi(0.5)]]>公式(8)Lods＝Log10PR公式(9)(4)、确定YAC文库利用距离上述定位的腋臭基因(位点)最近的DNA标志，筛选YAC、BAC、Pl、Cosmid类型基因组文库，运用染色体步移技术获得覆盖腋臭基因(位点)的一组连续的重叠的克隆群，即Contigs。
(5)、寻找表达序列从上述确定的Contigs中寻找表达序列，根据具体情况选择以下技术之一或几种技术配合使用，同时还可配合以寻找开放阅读框(ORF)、加强子(Enhancer)、启动子(Promoter)等结构；①、筛选cDNA，将所涉及的DNA区域内包含的表达序列全部调出，分别研究，确定目的基因，即用基因组片段直接筛选cDNA文库，或者进行Northern Blot，还可用直接cDNA筛选法，该法是以PCR为基础通过杂交的方法直接筛选cDNA文库；②、外显子捕获(exon trapping)，将所确定的Contigs分段连接到带标记的真核基因表达载体上进行表达研究，若所连接的DNA序列包含外显子，表达的mRNA将加长，从而确定基因的存在；几乎所有的真核基因在内含子和外显子的交接处的剪接位点都在一致性序列内含子5’端剪接供体位点SD(splice donor site)为RG/GTRAGT，3’端剪接受体位点SA(splice acceptor site)为NCAG/G，其中R代表嘌呤，N代表任意一种碱基；剪接体通过识别剪接位点，将外显子间的内含子去除；通过设计一个带有一套完整的剪接位点的外显子和内含子序列，即剪接盒的载体，将外源DNA片段插入载体的克隆位点(位于载体内含子中)，将重组载体转染真核细胞后，如果外源片段带有剪接供体和受体位点，就可进行剪接；利用载体的启动子，可在真核细胞染色体外转录形成mRNA；然后将载体上已知序列作为引物，进行逆转录PCA反应合成cDNA，该cDNA即为所要的外显子；主要流程制备载体→将基因组片段克隆至载体中→转化到E.coli中进行扩增→提取重组质粒→转染至COS-7细胞中→提取RNA→合成cDNA→第一轮PCR扩增→第二轮PCR扩增→克隆PCR产物→鉴定克隆的外显子；
③、Zoo Blotting，即筛选不同进化层次物种间都存在的保守序列，将所涉及的Contigs作为探针，与多种生物的DNA提取物杂交，若都有杂交信号就说明有结构基因存在；④CpG岛法，根据人类基因组中约40％的组织特异性表达基因的5’上游存在CpG岛的特点，确定所涉及的Contigs区域有无基因的存在，即识别基因5’端富含未甲基化的CpG区域，可通过鉴别成簇存在的稀有酶切位点，如NotI、BssHI、mluI等等来识别该区，(6)、寻找基因利用得到的表达序列，去识别全长cDNA，找出腋臭相关基因；(7)、鉴定基因对所找到的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列进行分析，确定该蛋白质的属性及可能的功能，再与腋臭基因具有的功能进行比较分析，进一步确定该基因是否致病基因、有否DNA结构变化(无义突变、移码突变、缺失、重排、剪接信号位点的改变等等)及其规律。
上述技术方案主要是从单基因遗传病的角度来对腋臭相关基因进行定位的。
以下从多基因遗传病(或复杂疾病)的角度来对腋臭相关基因进行定位。其采用的技术方案是腋臭相关基因的定位方法，其特征是包括以下步骤(1)、家系及一般人群或与腋臭者对应的对照人群的收集与处理收集经严格临床确诊的相对隔离封闭的腋臭大家系、患者同胞对家系、对照人群；(2)、遗传度估计遗传度的高低在临床实践上具有重要意义。遗传度达70％～80％，表明遗传因数在决定疾病易患性变异上有重要作用，环境因素的作用较小，遗传度达30％～40％，则表明遗传因素在决定疾病易患性变异上作用不显著，环境因素起重要作用。主要包括以下几种方法根据先证者亲属的发病率与遗传度有关而建立的Falconer公式法，亲属发病率遗传度越大；用公式(10)～(12)计算，经统计学分析，验证遗传度是否具有统计学意义。
h2＝b/r公式(10)b=Xg-Xrag]]>公式(11)b=pc(Xg-Xr)Ac]]>公式(12)
(注h＝遗传度，b＝亲属易患性对先证者易患性的回归系数，r＝亲属系数，Xg＝一群群体易患性平均值与阈值之间的标准差数，Xc＝对照组亲属中的易患性平均值与阈值之间的标准差数，Xr＝先证者亲属易患性平均值与阈值之间的标准差数，ag＝一般群体易患性平均值与一群群体中患者易患性平均值之间的标准差数，ar＝先证者亲属易患性平均值与先证者亲属中患者易患性平均值之间的标准差数，qg＝一般群体发病率，qc＝对照亲属发病率，pc＝1-qc，qr＝先证者亲属发病率。其中Xg、Xr、ag、ar、均可由一般群体发病率、对照亲属发病率和先证者亲属发病率查Falconer表得到。)根据遗传度越高的疾病，一卵双生的患病一致率与异卵双生患病一致率相差越大而建立的Holzinger公式法。用公式(13)计算。h2=CMZ-CDZ100-CDZ]]>公式(13)(注CMZ＝一卵双生子的同病率，CDZ＝卵双生子的同病率。)(3)、采集家系各成员血样，用常规有机溶剂法抽提基因组DNA；选择微卫星标志，使密度达到在染色体上平均覆盖约5～10cM，合成这些标志的PCR扩增产物，引物为荧光或非荧光的均可，以前者为佳，并利用复合PCR进行扩增；也可用目前商业化的试剂盒进行。利用变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测各标志的基因分型；利用DNA测序仪及相关软件系统对电泳所得数据进行分析处理；(4)、非参数连锁分析对基因初步定位采用定量性状的分析方法(如SAGE-SIBPAL-HE)和定性性状的分析方法(如MAPMAKFP-SIB)、血源一致性的分析方法(如SAGE-SIBPAL-ASP)和性状一致性的分析方法(如APM)、受累同胞对(如SAGE-SIBPAL)、受累亲属对方法(如GENEHUNTER-NPL)、患病家系成员分析法(affected pedigree member，APM)、表型极端不一致性同胞对等方法对腋臭基因进行初步定位；连锁分析原理就是在家系中，位于同一条染色体上的两个位点(致病基因与遗传标记)在减数分裂的过程中会发生交换与重组，染色体上两个位点间距离越远，重组率越高，两个位点同时遗传给后代的机会就越少。运用覆盖密度适当的遗传标记在家系中进行分型，找到与某一遗传标记紧密连锁的致病基因，从而初步确定该致病基因在染色体上的位置；利用全基因组扫描，综合分析，对经上述处理后的数据与家系分析得出的数据进行综合分析，计算每个遗传标记的Lods值，若Lods值＞3，则可以肯定该标记与腋臭相关基因连锁，即可将致病基因定位在某一条染色体的某一区段内。
患病同胞对分析法(affectedsib-pair，ASP)，是连锁分析的一种特殊形式，其特点是无需知道遗传病的遗传方式、基因频率及外显率等，其原理是在遗传标记位点与致病基因无连锁时，双亲的标记位点等位基因随机分配至子代，故同胞间共有2个、1个及0个(即不共有)等位基因的机率应分别为0.25、0.5、0.25，若标记位点与疾病连锁(即共分离)，则患病同胞间共有等位基因机率将高于上述预期值。经x2检验可确认。包括患病同胞对血缘一致性连锁分析(identical-by-descent，IBD)和患病同胞对状态一致性连锁分析(identical-by-state，IBD)。经统计学分析验证，可对某标记与致病基因或易感基因是否存在连锁关系作出初步判断。APM法与ASP法类似，它把分析对象扩展到整个家系的所有成员。
(5)、关联分析进一步对基因定位关联分析(association study)的原理是致病基因与遗传标记如果足够近，则在减数分裂时它们就不会随机重组分离，通过比较患者与正常个体的遗传标记的等位基因频率得到连锁不平衡点，从而得到某一等位基因片段与引起疾病关联的相对危险度，该法定位基因更加精确。研究标记与疾病相关基因座之间的连锁不平衡，有助于遗传病基因的精确定位。简言之，即比较标记位点的等位基因频率在患者组与正常组间是否存在显著差异，若两组间基因频率有显著差异，表明该遗传标记或位点与所研究的疾病相关。计算公式见公式(14)和(15)。其中Δ值以1-r的速率递减，直至0。若Δ＝0，则A、B随机关联(即A、B连锁平衡)，若Δ＝1，则A、B完全关联，若0＜Δ＜1，提示非随机关联(即连锁不平衡)。若A位点代表致病基因或易感基因，B位点代表遗传标记，若二者处于连锁不平衡，则患者中遗传标记的频率将高于对照组人群。
Δ＝fAB-fA×fB公式(14)Δn＝Δ(1-r)n公式(15)(注Δ值＝两个连锁基因位点的等位基因A与B之间的关联，fAB＝AB基因型的频率，fA＝A基因型的频率，fB＝B基因型的频率，r＝两位点之间的重组值)关联分析的一些变通形式或改良法包括以患者核心家系成员(双亲及同胞)作为关联分析对照组的患者家系对照者分析(affected family-based controls，AFBAC)[Thomson，et al.1988]、单倍型相对风险率分析(haplotype relative risk，HRR)[Falk and Rubenstein，1987，Terwilliger and Ott，1992]，以及家系传递/连锁不平衡分析(transmission/disequlibrium test，TDT)[Spielman 1993]等。
(6)、确定YAC文库利用距离上述定位的腋臭基因(位点)最近的DNA标志，筛选YAC、BAC、Pl、Cosmid类型基因组文库，运用染色体步移技术获得覆盖腋臭基因(位点)的一组连续的重叠的克隆群，即Contigs。
(7)、寻找表达序列从上述确定的Contigs中寻找表达序列，根据具体情况选择以下技术之一或几种技术配合使用，同时还可配合以寻找开放阅读框(ORF)、加强子(Enhancer)、启动子(Promoter)等结构；④、筛选cDNA，将所涉及的DNA区域内包含的表达序列全部调出，分别研究，确定目的基因，即用基因组片段直接筛选cDNA文库，或者进行Northern Blot，还可用直接cDNA筛选法，该法是以PCR为基础通过杂交的方法直接筛选cDNA文库；②、外显子捕获(exon trapping)，将所确定的Contigs分段连接到带标记的真核基因表达载体上进行表达研究，若所连接的DNA序列包含外显子，表达的mRNA将加长，从而确定基因的存在；几乎所有的真核基因在内含子和外显子的交接处的剪接位点都在一致性序列内含子5’端剪接供体位点SD(splice donor site)为RG/GTRAGT，3’端剪接受体位点SA(splice acceptor site)为NCAG/G，其中R代表嘌呤，N代表任意一种碱基；剪接体通过识别剪接位点，将外显子间的内含子去除；通过设计一个带有一套完整的剪接位点的外显子和内含子序列，即剪接盒的载体，将外源DNA片段插入载体的克隆位点(位于载体内含子中)，将重组载体转染真核细胞后，如果外源片段带有剪接供体和受体位点，就可进行剪接；利用载体的启动子，可在真核细胞染色体外转录形成mRNA；然后将载体上已知序列作为引物，进行逆转录PCA反应合成cDNA，该cDNA即为所要的外显子；
主要流程制备载体→将基因组片段克隆至载体中→转化到E.coli中进行扩增→提取重组质粒→转染至COS-7细胞中→提取RNA→合成cDNA→第一轮PCR扩增→第二轮PCR扩增→克隆PCR产物→鉴定克隆的外显子；③、Zoo Blotting，即筛选不同进化层次物种间都存在的保守序列，将所涉及的Contigs作为探针，与多种生物的DNA提取物杂交，若都有杂交信号就说明有结构基因存在；④CpG岛法，根据人类基因组中约40％的组织特异性表达基因的5’上游存在CpG岛的特点，确定所涉及的Contigs区域有无基因的存在，即识别基因5’端富含未甲基化的CpG区域，可通过鉴别成簇存在的稀有酶切位点，如NotI、BssHI、mluI等等来识别该区，(8)、寻找基因利用得到的表达序列，去识别全长cDNA，找出腋臭相关基因；(9)、鉴定基因对所找到的基因的编码的蛋白质的氨基酸序列进行分析，确定该蛋白质的属性及可能的功能，再与腋臭基因具有的功能进行比较分析，进一步确定该基因是否致病基因、有否DNA结构变化(无义突变、移码突变、缺失、重排、剪接信号位点的改变等等)及其规律。
本发明所述定位方法还有如下的等同方法(1)、侯选基因方法侯选基因法的原理根据与疾病有关的生化机制，从已知基因中挑选出一个或几个基因作为研究对象，通过连锁分析和关联研究，以确定这些侯选基因是否与疾病相关。其基本步骤①确定待研究的侯选基因；②将侯选基因座位的遗传标记与该疾病进行连锁分析，以确定侯选基因是否与该疾病间存在连锁关系；③筛选该侯选基因的各种突变体；④基因多态性与疾病间的关联研究；⑤疾病相关基因的功能研究。
本发明选定在腋臭发病过程中与脂类代谢(包括肥胖基因、脂肪酸结合蛋白基因、APOA2基因、APOA1/C3/A4基因、APOB基因、APOE基因等)、铁代谢、糖代谢(包括糖转运及代谢相关的基因，如葡萄糖激酶基因、己糖激酶基因II、糖原合成酶基因、腺苷酸脱氨酶基因、磷酸稀醇式丙酮羧激酶基因I、葡萄糖转移酶基因1、2、4等)、汗腺分泌及信号转导有关的多个基因为研究对象。在上述侯选基因附近选定DNA遗传多态性标记，通过对这些遗传标记进行基因分型，可进一步研究其与疾病的连锁关系。
(2)、定位克隆利用大样本家系或同胞对，进行全基因组扫描，连锁分析，将疾病相关基因位点定位到某一染色体区域内，进一步用区域内遗传多态性标记进行精细定位，将范围缩小至1cM，经DNA测序等手段，分离并克隆出腋臭相关基因；(3)定位侯选克隆法通过(2)中定位克隆法得到的紧密连锁位点后，通过数据库查出该定位区域内的所有几，并从中选择有关基因进行基因突变检测；本发明优于现有的方法，定位流程较为简单、成本低。本发明使人们从分子水平了腋臭的发病机制、遗传方式，同时为数量性状的研究提供了素材，还有助于腋臭(或/和相关疾病)的治疗。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步地阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1以定位克隆法为例定位腋臭相关基因，采用4代46人(其中1/3为腋臭患者)的大样本家系，选用400个STR引物进行22条常染色体和X性染色体扫描和基因分型，运用GENEHUNTER软件进行两点和多点连锁分析，将与人群中腋臭相关的基因位点定位到1、2、3、6、7、11、14号染色体的11个区域内，在此基础上，对112个腋臭核心家系中的497名成员(其中腋臭患者352人组成401对患病同胞对)，用11对引物对2号染色体上2个区域进行了加密扫描。扫描密度从原先的10cM缩小至5cM，用GENEHUNTER软件进行参数、非参数连锁分析和TDT检验，结果显示D2S163和D2S2354与腋臭相关基因存在紧密连锁关系，然后可选择该两个位点附近的遗传多态性位点，进行进一步的精确定位。
同样，其它几个染色体上的相应区域，亦可用上述方法进行加大密度扫描，直至精确定位。由此，根据上述结果就能确定腋臭相关基因在染色体上的位置，为进一步分离、克隆基因做准备。
实施例2以相关分析法(或连锁不平衡分析)为例定位腋臭相关基因。以112例无血缘关系的腋臭患者和112例正常人(无腋臭者)为研究对象，对位于第6号染色体的HLA基因座位和第9号染色体上的ABO座位，利用血清学方法和分子生物学方法进行等位基因多态性分析，比较两组人群各位点等位基因的频率，发现在两个基因座位上，等位基因频率在腋臭者组与正常组见无显著差异，表明该两个位点与腋臭之间不存在相关。
实施例3以腋臭相关基因，或者相关疾病或症状为例。
(1)、由于具有家族聚集性的腋臭者99％伴有油脂状耵聍栓塞(油耳)，并同时传递给亲代，说明两者间存在一定的连锁关系，两者均为腺体组织，前者为大汗腺，后者为耵聍腺，提示两种腺体间的某种关联；(2)、由于腋臭主要由大汗腺分泌物中含脂肪酸等物质而发出特殊臭味，其发病受性腺、内分泌系统等调节，故腋臭所涉及的相关基因包括控制或调控大汗腺分泌的基因或位点、肾上腺素能相关的基因或位点、内分泌系统相关的基因或位点；(3)、由于大汗腺分泌物中含有脂类，故所涉及的基因可能与脂质代谢有关，而直接或间接地与脂质代谢紊乱相关的疾病有关，如动脉粥样硬化、肥胖症等，或者脂质代谢相关基因的某些变异与腋臭的发生有一定关系；(4)、由于绝大多数腋臭患者伴有油脂状耵聍栓塞(油耳)、色汗等症状，故腋臭所涉及的基因尚有控制或调控耵聍分泌的基因或位点、有色物质分泌的相关基因或位点、内分泌系统相关的基因或位点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用参考一样。此外，应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.腋臭相关基因的定位方法，其特征是包括以下步骤(1)、家系的收集与处理收集经严格临床确诊的相对隔离封闭的腋臭大家系，作出系谱图分析，计算子代同胞间分离比是否同该病遗传方式所固有的理论分离比相一致；若所观察的分离比与理论分离比一致，则对腋臭遗传方式的假设成立，即为常染色体显性或是常染色体隐性遗传；(2)、采集家系各成员血样，用常规有机溶剂法抽提基因组DNA；选择微卫星标志，使密度达到在染色体上平均覆盖约5～10cM，合成这些标志的PCR扩增产物，引物为荧光或非荧光的均可，以前者为佳，并利用复合PCR进行扩增；也可用目前商业化的试剂盒进行；电泳检测各标志的基因分型，并用DNA测序仪及相关软件系统对电泳所得数据进行分析处理；(3)、连锁分析对基因初步定位采用直接法、Bernstein统计法、Fisherμ统计法、经典似然法、参数连锁分析对数优势记分法(或对数概率比记分法)等对腋臭基因进行初步定位；(4)、确定YAC文库利用距离上述定位的腋臭基因(位点)最近的DNA标志，筛选YAC、BAC、Pl、Cosmid类型基因组文库，运用染色体步移技术获得覆盖腋臭基因(位点)的一组连续的重叠的克隆群，即Contigs。(5)、寻找表达序列从上述确定的Contigs中寻找表达序列；(6)、寻找基因利用得到的表达序列，去识别全长cDNA，找出腋臭相关基因；(7)、鉴定基因对所找到的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列进行分析，确定该蛋白质的属性及可能的功能，再与腋臭基因具有的功能进行比较分析，进一步确定该基因是否致病基因、有否DNA结构变化(无义突变、移码突变、缺失、重排、剪接信号位点的改变等等)及其规律。
2.腋臭相关基因的定位方法，其特征是包括以下步骤(1)、家系及一般人群或与腋臭者对应的对照人群的收集与处理收集经严格临床确诊的相对隔离封闭的腋臭大家系、患者同胞对家系、对照人群；(2)、遗传度估计遗传度的高低在临床实践上具有重要意义。遗传度达70％～80％，表明遗传因数在决定疾病易患性变异上有重要作用，环境因素的作用较小，遗传度达30％～40％，则表明遗传因素在决定疾病易患性变异上作用不显著，环境因素起重要作用；(3)、采集家系各成员血样，用常规有机溶剂法抽提基因组DNA；选择微卫星标志，使密度达到在染色体上平均覆盖约5～10cM，合成这些标志的PCR扩增产物，引物为荧光或非荧光的均可，以前者为佳，并利用复合PCR进行扩增；也可用目前商业化的试剂盒进行。利用变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测各标志的基因分型；利用DNA测序仪及相关软件系统对电泳所得数据进行分析处理；(4)、非参数连锁分析对基因初步定位采用定量性状的分析方法和定性性状的分析方法、血源一致性的分析方法和性状一致性的分析方法、受累同胞对、受累亲属对方法、患病家系成员分析法、表型极端不一致性同胞对等方法对腋臭基因进行初步定位；(5)、关联分析进一步对基因定位比较标记位点的等位基因频率在患者组与正常组间是否存在显著差异，若两组间基因频率有显著差异，表明该遗传标记或位点与所研究的疾病相关；(6)、确定YAC文库利用距离上述定位的腋臭基因(位点)最近的DNA标志，筛选YAC、BAC、Pl、Cosmid类型基因组文库，运用染色体步移技术获得覆盖腋臭基因(位点)的一组连续的重叠的克隆群，即Contigs。(7)、寻找表达序列从上述确定的Contigs中寻找表达序列；(8)、寻找基因利用得到的表达序列，去识别全长cDNA，找出腋臭相关基因；(9)、鉴定基因对所找到的基因的编码的蛋白质的氨基酸序列进行分析，确定该蛋白质的属性及可能的功能，再与腋臭基因具有的功能进行比较分析，进一步确定该基因是否致病基因、有否DNA结构变化(无义突变、移码突变、缺失、重排、剪接信号位点的改变等等)及其规律。
全文摘要
本发明提供了以腋臭家系为研究对象的腋臭相关基因(或位点)的定位、寻找、鉴定的方法，包括寻找并确定家系，收集血标本，利用STR、SNP等遗传标记对腋臭家系进行全基因组扫描、连锁分析、关联分析，定位腋臭相关基因或位点，精确定位，确定YAC文库，利用外显子捕获法、cDNA筛选法、Zoo Blotting、CpG岛法等方法寻找基因，最后对所找到的基因及其编码的可能的蛋白质进行鉴定，确定与腋臭的关系及遗传传递规律。其涉及分子遗传学、基因组学、生物信息学、生物统计学等技术方法。本发明从基因水平阐明腋臭发病的分子基础。为临床防治等提供科学依据和技术。
文档编号C12Q1/68GK1446926SQ0211402
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月27日 优先权日2002年3月27日
发明者江斌 申请人:江斌