一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法
【专利摘要】本发明公开了一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，先分别制作aroclor1254暴露和空白条件下A、B、C、D四种毛白杨不定根分化固体培养基，将上述培养基各装入三角瓶中，封口后进行灭菌；选择毛白杨同一克隆的组培苗，切取顶芽下第二至第三片叶之间粗细一致茎段，分别接种于所述A、B、C、D固体培养基中，每个三角瓶接种3-5个茎段；在培养室培养20~30天；分别收取A、B、C、D固体培养基的毛白杨材料并编号，合并成组包装、贮藏。该方法操作简单，所获取的毛白杨材料基因背景相同，经历各个生长时期，且多氯联苯影响因素确定，适合于进行广泛的基因分析，为寻找对多氯联苯耐受能力强的基因提供了试验材料。
【专利说明】一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体而言涉及一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法。
【背景技术】
[0002]多氯联苯(PCBs，aroclor 1254是一种典型的多氯联苯)是一类性质稳定、具有急性和慢性毒性、典型的持久有机污染物(POPs)，曾用在电容器和变压器的绝缘油、蓄电池、复写纸、涂料、润滑剂、防火剂、粘接剂、石蜡扩充剂、农药延效剂中，在电力工业、塑料加工业、化工和印刷业等领域均有广泛使用，截至1979年，除少量特殊用途外，世界各国因公害原因停止生产和使用PCBs。世界估计有120万吨PCBs，其中65%存在于电器系统、垃圾场或存储在陆地上，31%流失到环境中。由于其持久性和难降解性，至今仍是环境中最重要的有机污染物之一。由于PCBs具有强毒性、致癌性、致畸性、致突变性，许多国家已把PCBs列为优先控制的有机污染物名单。
[0003]关于多氯联苯的污染控制和土壤修复方法，主要有封存填埋法、高温焚烧法、物理方法、化学方法、微生物降解法(专利CN102550425、CN102108361、CN103252345)和植物修复法(专利CN1663702、CN101966529)。植物修复法，是利用植物和植物生长及其共存的微生物作为技术手段来净化环境中有机和无机污染物的方法，目前，植物修复法在实践上主要是从厌氧-好 氧交替堆制(CN101966529)、双接种(CN1663702)等方面对土壤进行修复，修复时选用对多氯联苯分解或富集能力好的紫花苜蓿、西葫芦等作物；在研究层面主要涉及植物萃取(phytoextraction)、植物固定(phytostabilisation)、植物降解(phytodegradation)、根际降解(rhizodegradation)和根滤作用(rhizofiltration)。一般而言，发现和筛选对多氯联苯有较强耐受、富集和分解能力的植物基因，是开发降解多氯联苯能力强、土壤修复效率高的植物新品种的关键，对植物修复法的理论和实践有着重要的意义。而发现和筛选对多氯联苯耐受、富集和分解能力强的植物基因，首先且极为重要的是要有基因背景相同、暴露条件可控、在多氯联苯暴露条件下经历各个生长时期且具有较高生物量的植物材料和相应的参比材料用于基因分析。目前植物修复研究中所用材料一般通过盆栽土培、容器液体培养等方法对靶试植物的种子或完整植物体进行暴露来获得。盆栽土培方法因所用土壤成分复杂、微生物影响未知等因素导致生长条件与质量控制困难，进而无法比较植物的生长差异是否单纯只与多氯联苯暴露有关，用容器液体方式进行培养使操作又偏繁琐，更大的局限性在于，如果用种子做暴露材料，因为不同的种子的基因背景不同，无法满足在相同基因背景下进行基因分析的要求，如果用完整植物体做暴露材料，因为完整植物体的各器官已经健全，就使基因分析无法揭示植物器官在生长分化过程中受多氯联苯的影响情况。上述弊端最终导致无法用种子或完整植物体进行多氯联苯暴露条件下的基因分析或者使基因分析具有较大局限性。因此，现有技术中还没有多氯联苯暴露条件下，用于基因分析的靶试材料和参比材料的简便获取方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，该方法操作简单，所获取的毛白杨材料基因背景相同，经历各个生长时期，且多氯联苯影响因素确定，适合于进行广泛的基因分析，为寻找对多氯联苯耐受能力强的基因提供了试验材料。。
[0005]为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:
一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，包括如下步骤:
(a)制作如下A、B、C、D毛白杨不定根分化固体培养基，蔗糖、琼脂以所占固体培养基总质量的质量百分比表示，1/2MS为大量元素减半的MS培养基，IBA为吲哚丁酸:
A、1/2MS+ 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 琼脂，ρΗ5.0~6.0
B、1/2MS+ 0.5 mgLlBA + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 琼脂，ρΗ5.0~6.0
C、1/2MS+ 2.0 ~8.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 琼月旨，ρΗ5.0~6.0
D、1/2MS+ 0.5mg L-1IBA + 2.0 ~8.0 mg L-1 aroclor 1254+ 1.(Tl.5% 蔗糖 +
0.6~1.0% 琼脂，ρΗ5.0~6.0
将上述培养基各装入三角瓶中，封口后进行灭菌；
(b)选择毛白杨同一克隆的组培苗，切取顶芽下第二至第三片叶之间粗细一致茎段，分别接种于所述A、B、C、D固体培养基中，`每个三角瓶接种3-5个茎段；
(c)在培养室采用450-680nm的LED光源，以16小时光照8小时黑暗为光周期，光照强度为3000-4000 Lux,培养温度为23~27°C，培养20~30天；
Cd)分别收取A、B、C、D固体培养基内的毛白杨材料并编号，合并成组包装、贮藏。
[0006]优选的，所述步骤(a)中，A、B、C、D毛白杨不定根分化固体培养基为:
A、1/2MS + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
CU/2MS + 4 mgL-1 aroclor 1254 + 1.2% 蔗糖+0.8% 琼脂，ρΗ5.6
DU/2MS + 0.5mg L-1IBA + 4 mg I/1 aroclor 1254+ 1.2%蔗糖+ 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
所述步骤(b)中培养25天。
[0007]本发明的有益效果是，所用的固体培养基组成确定，能够将毛白杨茎段直接插在培养基上，不要其他辅助装置进行固定，克服了土壤成分复杂、影响因素不易确定、溶液培养需要单独固定装置、操作繁琐的弊端，所用组培苗选择同一克隆样本，很好的消除了基因背景差异，而且所用茎段从器官分化开始经历各个生长阶段，消除了完整植物体无法研究器官分化以及生长过程中植物材料对暴露物的反应的局限性。本发明方法获取的毛白杨材料为进行深入广泛的基因分析提供了重要材料，有助于发现对多氯联苯耐受能力强的基因。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为A、B、C、D培养基中毛白杨茎段的生根情况比照图；
图2为不同剂量的Aroclro 1254单独暴露以及协同0.Smgr1IBA暴露对毛白杨组培苗不定根生物量累积影响。【具体实施方式】
[0009]以下1/2MS为大量元素减半的MS基本培养基，属于公知的培养基；IBA为吲哚丁酸；aroclor 1254为一种多氯联苯，蔗糖、琼脂的含量用各自所占固体培养基总质量的质量百分比表示，含有琼脂的固体培养基公知的制作方法是先按量加入各组成成分配成水溶液，然后加热至沸腾，再冷却至40°C以下通过琼脂凝固形成固体培养基。
[0010]实施例一:多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，包括如下步骤:
(a)制作如下A、B、C、D毛白杨不定根分化固体培养基:
A、1/2MS + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
CU/2MS + 4.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.2%蔗糖+ 0.8%琼脂，？昍.6
DU/2MS + 0.5 mg L-1IBA + 4.0mg L-1 aroclor 1254+ 1.2%蔗糖+ 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
将上述培养基各装入三角瓶中，封口后在121°C下进行灭菌16min。
[0011](b)选择毛白杨同一克隆的组培苗，切取顶芽下第二至第三片叶之间粗细一致茎段，分别接种于所述A、B、C、D固体培养基中，每个三角瓶接种3个茎段。
[0012](C)在培养室采用600nm的LED光源，该光源可以防止紫外光对多氯联苯的分解作用，以16小时光照8小时黑暗为光周期，光照强度为3500 Lux,培养温度为25°C，培养25天，各三角瓶内培养基底部的生根情况如图1所示，由图1可见，C培养基中单独添加^igL-1的aroclor 1254暴露条件下毛白杨组培苗不定根生根率和不定根生长状况明显好于A培养基的空白对照。C培养基中毛白杨组培苗不定根生根率和不定根生长状况与D培养基中另外添加0.Smgr1IBA协同效应基本一致，与B培养基中未添加aroclor 1254的情况类似，说明本培养环境下C、D培养基中得到的毛白杨材料在aroclor 1254暴露条件下得到了良好的生长，不定根生物量较高，与A、B培养基中毛白杨材料一起可以作为基因分析的材料。
[0013]Cd)分别收取A、B、C、D固体培养基的毛白杨材料并编号，每种材料注明对应的培养基，将四种材料合并成组包装、贮藏，作为一组基因分析材料使用。通过对上述材料的基因分析和对比，有助于发现对aroclor 1254耐受力强的基因，为进一步开发植物新品种做准备。。
[0014]实施例二:多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，包括如下步骤:
(a)制作如下A、B、C、D毛白杨不定根分化固体培养基:
A、1/2MS + 1.0% 蔗糖 + 0.6% 琼脂，ρΗ5.0
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.0% 蔗糖 + 0.6% 琼脂，ρΗ5.0
CU/2MS + 2.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.0% 蔗糖 + 0.6% 琼脂，ρΗ5.0
DU/2MS + 0.5 mg L-1IBA + 2.0mg L-1 aroclor 1254+ 1.0%蔗糖 + 0.6%琼脂，？昍.0
将上述培养基各装入三角瓶中，封口后在120°C下进行灭菌18min。
[0015](b)选择毛白杨同一克隆的组培苗，切取顶芽下第二至第三片叶之间粗细一致茎段，分别接种于所述A、B、C、D固体培养基中，每个三角瓶接种4个茎段。
[0016](c)在培养室采用450nm的LED光源，该光源可以防止紫外光对多氯联苯的分解作用，以16小时光照8小时黑暗为光周期，光照强度为3000 Lux,培养温度为27°C，培养20天。C培养基中单独添加ZmgI/1的aroclor 1254暴露条件下毛白杨组培苗不定根生根率和不定根生长状况明显好于A培养基的空白对照。C培养基中毛白杨组培苗不定根生根率和不定根生长状况与D培养基中另外添加0.Smg^1IBA协同效应基本一致，与B培养基中未添加aroclor 1254的情况类似，说明本培养环境下C、D培养基中得到的毛白杨材料在aroclor 1254暴露条件下得到了良好的生长，不定根生物量较高，与A、B培养基中毛白杨材料一起可以作为基因分析的材料。
[0017]Cd)分别收取A、B、C、D固体培养基的毛白杨材料并编号，每种材料注明对应的培养基，将四种材料合并成组包装、贮藏，作为一组基因分析材料使用。通过对上述材料的基因分析和对比，有助于发现对aroclor 1254耐受力强的基因，为进一步开发植物新品种做准备。
[0018]实施例三:多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，包括如下步骤:
(a)制作如下A、B、C、D毛白杨不定根分化固体培养基:
A、1/2MS + 1.5% 蔗糖 +1.0% 琼脂，ρΗ6.0
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.5% 蔗糖 + 1.0% 琼脂，ρΗ6.0
CU/2MS + 8.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.5%蔗糖+ 1.0% 琼脂，ρΗ6.0
DU/2MS + 0.5 mg L-1IBA + 8.0mg L-1 aroclor 1254+ 1.5%蔗糖+ 1.0% 琼脂，ρΗ6.0
将上述培养基各 装入三角瓶中，封口后在125°C下进行灭菌15min。
[0019](b)选择毛白杨同一克隆的组培苗，切取顶芽下第二至第三片叶之间粗细一致茎段，分别接种于所述A、B、C、D固体培养基中，每个三角瓶接种5个茎段。
[0020](c)在培养室采用680nm的LED光源，该光源可以防止紫外光对多氯联苯的分解作用，以16小时光照8小时黑暗为光周期，光照强度为4000 Lux,培养温度为23°C，培养30天。C培养基中单独添加SmgL4的aroclor 1254暴露条件下毛白杨组培苗不定根生根率和不定根生长状况明显好于A培养基的空白对照。C培养基中毛白杨组培苗不定根生根率和不定根生长状况与D培养基中另外添加0.Smg^1IBA协同效应基本一致，与B培养基中未添加aroclor 1254的情况类似,说明本实验方法下C、D培养基中得到的毛白杨材料在aroclor 1254暴露条件下得到了良好的生长，不定根生物量较高，与A、B培养基中毛白杨材料一起可以作为基因分析的材料。
[0021]Cd)分别收取A、B、C、D固体培养基的毛白杨材料并编号，每种材料注明对应的培养基，经四种材料合并成组包装、贮藏，作为一组基因分析材料使用。通过对上述材料的基因分析和对比，有助于发现对aroclor 1254耐受力强的基因，为进一步开发植物新品种做准备。
[0022]实施例四:不同aroclor 1254暴露剂量下不定根生物量的累积影响
制作若干aroclor 1254含量不同的固体培养基:1/2MS + 1.2%蔗糖+ 0.8%琼脂+XmglA ρΗ5.6，X 取 2、4、6、8、IOJOmgL' 得到 aroclor 1254 系列；再制作含有 IBA 的aroclor 1254含量不同的固体培养基:1/2MS + 1.2%蔗糖+ 0.8%琼脂+0.5 mg L4IBA+XmgL'pH5.6,X 取 2、4、6、8、10、20mgL-1,得至Ij aroclor 1254+IBA 系列。选择毛白杨同一克隆的组培苗，切取顶芽下第二至第三片叶之间粗细一致茎段，分别插入上述两系列的培养基中，在培养室采用600nm的LED光源，以16小时光照8小时黑暗为光周期，光照强度为3500 Lux,培养温度为25°C，培养25天，记录所生产不定根的生物量数据，然后作图，如图
2所示。由图2可见，毛白杨组培苗不定根分化和生长过程中的2.0-8.0 mgL—1剂量aroclor1254的单独暴露以及协同0.Smgr1IBA暴露，均促进不定根生物量的积累，其最高效应剂量为 4mgL'``
【权利要求】
1.一种多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，包括如下步骤: (a)制作如下A、B、C、D毛白杨不定根分化固体培养基，蔗糖、琼脂以所占固体培养基总质量的质量百分比表示，1/2MS为大量元素减半的MS培养基，IBA为吲哚丁酸:
A、1/2MS+ 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 琼脂，ρΗ5.0~6.0
B、1/2MS+ 0.5 mgLlBA + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 琼脂，ρΗ5.0~6.0
C、1/2MS+ 2.0 ~8.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 琼月旨，ρΗ5.0~6.0D、1/2MS+ 0.5mg L-1IBA + 2.0 ~8.0 mg L-1 aroclor 1254+ 1.(Tl.5% 蔗糖 +0.6~1.0% 琼脂，ρΗ5.0~6.0 将上述培养基各装入三角瓶中，封口后进行灭菌； (b)选择毛白杨同一克隆的组培苗，切取顶芽下第二至第三片叶之间粗细一致茎段，分别接种于所述A、B、C、D固体培养基中，每个三角瓶接种3飞个茎段； (c)在培养室采用450-680nm的LED光源，以16小时光照8小时黑暗为光周期，光照强度为3000-4000 Lux,培养温度为23~27°C，培养20~30天； (d)分别收取A、B、C、D固体培养基内的毛白杨材料并编号,合并成组包装、贮藏。
2.如权利要求1所述的多氯联苯暴露条件下毛白杨基因分析材料的获取方法，其特征在于，所述步骤(a)中，A、B、C、D毛白杨不定根分化固体培养基为:
A、1/2MS + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，ρΗ5.6
CU/2MS + 4 mgL-1 aroclor 1254 + 1.2% 蔗糖+0.8% 琼脂，ρΗ5.6
DU/2MS + 0.5mg L-1IBA + 4 mg I/1 aroclor 1254+ 1.2%蔗糖+ 0.8% 琼脂，ρΗ5.6 所述步骤(b)中培养25天。
【文档编号】A01H4/00GK103875536SQ201410152199
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】杜克久, 李玉灵, 李燕玲, 刘霞, 王子岚, 才满, 孙然 申请人:河北农业大学