专利名称：一种dna多位点定向突变方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种基因定点突变方法，具体涉及一种DNA多位点定向突变的方法。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，生物工作者越来越多地把研究重点转移到基因功能上。基因定点突变技术正适应了这一要求，通过有目的地将蛋白链上某一个或几个氨基酸突变为其它氨基酸，以确定蛋白的结构和功能中心。通过将启动子上顺式反应元件的一个或几个碱基突变，以探索该元件的功能中心。另外，定点突变技术也为基因工程改造、优化、提高酶的活性提供了一个途径。PCR介导的定点突变技术因具有高效、便捷、经济等优点而倍受瞩目。基于PCR技术的发展，许多定点突变的方法得到进一步改进，例如，重叠PCR技术(Gene Splicing byOverlapExtension PCR, OE-PCR),基于 Class IIS 限制性内切酶的 DNA直接连接(Splicingby DirectedLigation, SDL)技术以及反向PCR技术等。这些技术的共同之处都是采用PCR技术通过特定的引物设计引入突变位点，不同之处在于获得带有全部突变位点的全长DNA片段的方法不同。OE-PCR技术利用首轮PCR引入的相同序列的互补进行后续的延伸或PCR获得全长片段；SDL技术利用酶切产生的粘性末端序列互补连接得到中间拼接产物，再将中间拼接片段连接到克隆载体，进行克隆子转化、筛选，得到带有突变的基因片段。现有技术的上述方法，在多位点定向突变的实践工作中均存有一些不足，例如，OE-PCR技术原理简单明了，但在实际操作中，当需要连接的中间片段数量多于三个时，准确拼接效率就会降低。改进的OE-PCR方法中“两两混合法”(double-mixing)、“步步拼接法”(Step-by-stepassembling)、“顺序连接法”(Sequentially connecting)等，虽提高了片段的正确拼接效率，但是多步的延伸、PCR反应都需要优化才能得到最适条件，因而费时费力。而SDL方法，虽在多个中间片段连接中具有优势，但通常都需要将拼接产物连接到克隆载体、通过转化、菌落筛选才能得到需要的DNA片段，耗时较多，增加工作量，因而应用并不广泛。
发明内容
本发明采用了 SDL技术的基于Class IIS内切酶和T4连接酶的中间片段连接策略及OE-PCR技术获取全长片段PC R扩增策略，克服了现有技术的上述缺陷，其目的是提供一种相对快速、操作简单、成本较低的DNA拼接及基因多位点定向突变的方法，利用含有Class IIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，通过PCR扩增、Class IIS限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接、连接产物直接PCR扩增的方法，来实现对DNA片段进行拼接及对多个位点同时突变的目的。本发明公开了一种DNA多位点定向突变方法，根据DNA突变位点，设计包含ClassIIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，经分段PCR扩增、酶切、连接反应得到连接产物，并以该连接产物直接进行PCR扩增，实现DNA多位点突变。本发明DNA多位点定向突变方法，包括以下步骤:步骤a)构建引物；所述引物包括外部引物和内部引物；其中，所述外部引物有两条:5’端的正向外部引物和3’端反向外部引物，所述外部引物的长度通常为18-30个碱基。正向外部引物序列与目标基因5’端序列相同；反向外部引物序列为目标基因3’端序列的反向互补序列。优选地，根据实验需要，也可以在外部弓I物的外侧弓IA限制性内切酶位点。其中，所述内部引物包含正向内部引物和反向内部引物。优选地，根据突变实验的具体要求的不同，内部引物可设计为多条。所述内部引物的一般序列组成自5’端到3’端依次为:保护碱基、Class IIS限制性内切酶识别位点、Class IIS限制性内切酶切割位点、以及目标基因区域。进一步优选地，内部引物设计序列由5’端到3’端依次为:2-3个保护碱基、Class IIS限制性内切酶识别位点、Class IIS限制性内切酶切割位点(即拟突变碱基区域)、目标基因区域。本发明中，根据拟突变碱基所处序列的位点及突变方式，分别设计所述内部引物的ClasslIS限制性内切酶切割位点序列组成。具体地，当拟突变位点为单个碱基突变，包括插入、缺失和置换突变，该突变碱基可以直接在Class IIS限制性内切酶切割位点体现；当拟突变位点为多个连续碱基的缺失突变时，Class IIS限制性内切酶切割位点应该设计为目标基因序列。本发明中，目标基因区域是指要进行研究的特定基因的序列。例如，实施例1中的AnSh基因序列即为该实施例中引物设计所指的目标基因区域。优选地，内部引物设计时，目标基因区域的碱基数为17-30bp 。进一步优选地，目标基因区域的碱基数为18-25bp。本发明中，由于相邻两个片段的拼接是通过以酶切产生的粘性末端互补进行，因此，将要连接的DNA片段对应的引物切割位点的碱基应该是互补序列。如，实施例1中Rl与F2，R2与F3，R3与F4，R4与F5，R5与F6中的切割位点序列都是互补的。步骤b)分段PCR扩增:利用步骤a中构建的所述内部引物和外部引物，以目标基因为模板，将目标基因对应的引物两两组合，通过分段高保真PCR扩增，分别扩增出各段序列，然后，将各扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，并分别回收各个目的片段。本发明中，目的片段指实验设计分段PCR扩增想要获得的目标基因分段的DNA片段，如实施例中以目标基因为模板，分别以Fl和RU F2和R2、F3和R4、F5和R6为引物，扩增得到的FlRl片段、F2R2片段、F3R4片段、F5R6片段等目的片段。步骤c)酶切并纯化:将步骤b)中回收获得的各个目的片段分别用Class IIS限制性内切酶进行酶切，将酶切产物进行纯化，得到酶切纯化片段。步骤d)连接反应:利用T4DNA连接酶，将步骤c获得的各个酶切纯化片段进行连接反应，获得连接产物。步骤e)全长PCR扩增反应利用步骤a)构建得到的外部引物，以步骤d)获得的连接产物作为模板，用高保真酶进行PCR扩增全长，得到带有突变的全长目标基因。本发明中，所述突变可以同时用于多位点的缺失突变、插入突变、置换突变。本发明中的缺失突变，是指在目标基因中进行碱基缺失的突变，包括单个碱基缺失和多个碱基连续缺失。本发明中的插入突变，是指在目标基因中插入单个碱基或多个连续碱基的突变。本发明的置换突变，是指在目标基因中进行碱基置换的突变，包括单个碱基置换和多个碱基置换。上述三种突变方式都可以通过内部引物设计来完成。本发明中，所述Class IIS限制性内切酶是一类DNA限制性内切酶，其特点是识别位点与切割位点不是同一个序列，切割位点在识别位点之外。所述Class IIS限制性内切酶的识别位点与其切割位点分别位于双链DNA的不同区域，且该切割位点碱基序列组成与该内切酶是否能发挥内切酶功能相互之间没有关联。优选地，所述Class IIS限制性内切酶包括 Eco311、BbvI> Bsal、Esp31、SapI 等。本发明中，所述步骤b的分段高保真PCR反应、步骤d中的PCR扩增全长反应均是使用高保真DNA聚合酶进行PCR反应。本发明中，所述步骤b、步骤d中的PCR反应的反应体系如下:
权利要求
1.一种DNA多位点定向突变方法，其特征在于，根据DNA突变位点设计包含Class IIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，经分段PCR扩增、酶切、连接反应得到连接产物，并以该连接产物直接进行PCR扩增，实现DNA多位点突变。
2.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变方法，其特征在于，包括如下步骤: a.构建引物: 所述引物包括外部引物和内部引物； 其中，所述外部引物包括5’端的正向外部引物和3’端反向外部引物； 其中，所述内部引物包含正向内部引物和反向内部引物；所述内部引物自5’端到3’端依次为:保护碱基、Class IIS限制性内切酶识别位点、Class IIS限制性内切酶切割位点、以及目标基因区域； b.分段PCR扩增: 利用所述内部引物和所述外部引物，进行分段高保真PCR扩增反应，各扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，回收获得各目的片段； c.酶切、纯化: 将回收的所述目的片段分别用Class IIS限制性内切酶进行酶切，经纯化，得到酶切纯化片段； d.连接反应: 用T4DNA连接酶将步骤 c中获得的所述酶切纯化片段连接，得到连接产物； e.PCR扩增全长反应: 利用外部引物，以步骤d中的所述连接产物为模板，进行高保真PCR扩增全长。
3.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变方法，其特征在于，所述突变是可同时在多位点的缺失突变、插入突变、置换突变。
4.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述ClassIIS限制性内切酶包括 Eco311、Bbv1、Bsa1、Esp31、SapI。
5.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述高保真PCR反应是使用高保真DNA聚合酶进行PCR反应。
6.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系包括:10 u I 5XBuffer (Mg2+plus), 4 u I dNTP mixture (各 2.5mM), I U I 正向引物(IOuM)jIu I 反向引物(10uM),0.1 IOOng 模板，0.5 DNA 聚合酶(2.5U/iU)，加灭菌双蒸水至总体积50 yl。
7.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述步骤b、d中PCR反应条件包括:94 98°C下变性10秒 5分钟；94 98°C下变性10 30秒，45 65°C下退火0 30秒，68 72°C下延伸0.5 5分钟，并进行28 32个循环；72°C延伸2 10分钟。
8.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述步骤c中酶切的反应体系包括:5iill0XBuffer，20 30iil所述回收目的片段，4iil Class IIS限制性内切酶，加灭菌双蒸水至总体积50 u I ;所述步骤c中酶切的反应条件包括:先在37 65°C条件下反应5 30分钟，再在65 80°C下反应5 30分钟。
9.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法,其特征在于,所述步骤d中连接反应体系为:5iU 10 X Buffer，酶切纯化产物片段，I 5U T4DNA连接酶，加入灭菌双蒸水至总体积为50 u 10
10.按权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述步骤d中连接反应的条件 为4°C过夜，或16°C或室温15分钟 3小时。
全文摘要
本发明提供一种DNA多位点定向突变方法，根据DNA突变位点设计包含Class IIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，经分段PCR扩增、酶切、连接反应得到连接产物，并以该连接产物直接进行PCR扩增，实现DNA多位点突变。本发明能快速高效地同时实现DNA多位点定向突变。
文档编号C12N15/10GK103088015SQ201310016659
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者赵淑娟, 周禄斌, 胡之璧, 王峥涛, 周吉燕 申请人:上海中医药大学