专利名称：：一种基因定点多位点突变的方法一种基因定点多位点突变的方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基因定点多位点突变的方法。
背景技术：
：随着人类基因组计划的完成，生物工作者越来越多地把研究重点转移到基因功能上。基因定点突变技术正适应了这一要求。有目的地将蛋白链上某一个或几个氨基酸突变为其它的氨基酸，可以确定蛋白的结构和功能中心；将启动子上顺式反应元件的一个或几个碱基突变，可以探索该元件的功能中心。另夕卜，定点突变技术也为基因工程改造、优化、提高酶的活性提供了一个途径。现在市场上4艮多^^司都有单点突变的试剂盒，如外国的有invitrogen,clontech,stratagene;国产的有全式金。可是，对多位点定点突变，却只有stratagene的multi-sitedirectedmutagenesisi式剂盒。然而，这个i式剂盒需要5，端磷酸化的引物、一种Taq酶和连接酶的混合物(该试剂盒独有的)，花费比较昂贵；而且突变产物为单链，转化效率不高。2004年，美国Seyfang等人发表文章，声称可以在一次PCR中做到IO个位点以上的突变。但是，他们的方法需要引物5，端磷酸化、单独做一次退火、用T4DNA聚合酶延伸和T4连接酶连接，最后再进行PCR，花费稍显昂贵、操作稍嫌繁瑣。2005年，丹麦Jensen等人发表了一种针对近距离的多基因突变的方法，是对stratagene公司的multi-sitedirectedmutagenesis试剂盒的补充，弥补了该试剂盒不能估丈近距离的多基因突变的缺陷。但是这也限制了该方法在其他情况基因突变中的应用。2007年，我国中科院大连化学物理研究所的Wang等人，发表了一种不需要引物磷酸化、不需要连接，只用PCR进行基因突变的方法，该方法花费低廉、操作相对简单，应该算是比较理想的多位点突变的方法。然而，该方法除了PCR之外还需要进行两步胶回收，稍显复杂了些。
发明内容本发明的目的是提供一种以较低成本、较少时间来进行基因定点多位点突变的方法，利用含有突变位点的引物、通过PCR、DpnI酶切消化模板质粒、再PCR的方法，来达成基因多位点定点突变的目的。为达到上述发明目的，本发明提出以下的技术方案一种基因定点多位点突变的方法，包括以下步骤51根据突变的碱基所处序列的位点分别设计一对正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5，端的位置；根据需要进行突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；52由第一对引物以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；53采用Dpnl酶将步骤S2中所得的基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；54以步骤S3中的酶切产物为模板，加入第二对突变引物进行PCR反应在第一个循环时，两条引物在高保真酶的作用下形成构成质粒一部分的新链；在第二个循环时，两条链与引物的互补区结合，在高保真酶的作用下，将每条链上缺失的部分分别补充完整，得到具有两个突变位点的产物；在经过多次循环后，即得到多个拷贝、具有两个突变位点、有开口的环状质粒；55以步骤S4中得到的环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物，按S4中的方式进行PCR反应，依次得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，所述步骤Sl设计的突变引物中，每条引物长度为2438个碱基，正向引物与正义链一致，反向引物与正义链反向互补，两条引物之间约520个碱基反向互补。根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，所述步骤Sl或S2中的PCR反应体系为10xPCR緩沖液2.5|iL2mMdNTP混合物25mMMgCl2正向引物(10pM)反向引物(10pM)模板质粒(200ng/pl)DNA聚合酶灭菌的去离子水2.5|iL1.2nL0.11pE0.1l|nL0.5515U至总体积为25pL根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，步骤Sl或S2中的PCR反应条件为94'C下变性0~5分钟；94。C下变性15~30秒，5565。C下退火30秒，6872。C下延伸4~8分钟，并进行1030个循环；最后6872。C下变性7分钟。根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，所述步骤S2中的高保真酶是KODPlus(日本Toyobo公司)。根据本发明所4是供的基因定点多位点突变的方法，所述步骤Sl中酶切的反应体系为10x緩冲液2nLPCR产物17.5DpnI0.5(iL总体积20nL根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，所述步骤S3中酶切的反应条件为先在37。C下反应1-1.5小时，再在85。C下反应15-20分钟，使酶失活。从以上技术方案可以看出，本发明所提供的方法的有益效果在于在得到第一个目标突变位点之后，利用引物互补区对有开口的环状质粒才莫^1完成聚合酶链式反应，加入第二突变引物进行下一次PCR反应，后续的PCR经过两次循环，在高保真酶的作用下，将每条链上缺失的部分分别补充完整，得到具有两个突变位点的产物；在经过多次循环后，即得到多个拷贝、具有两个突变位点、有开口的环状质粒；继而，以第二次PCR得到的环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物，并按第二次PCR的方式进行后续的PCR反应，经过多次循环后，即依次得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。本发明所提供的方法不需引物的磷酸化、不需连接、不需胶回收，可以以较低的成本、较少的时间完成多位点定点突变这一比较复杂的工作。图2所示是本发明所提供的方法实施过程中的原理图；图3所示是本发明第一实施例的三个突变位点示意图；图4所示是本发明第二实施例的五个突变位点示意图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。目的基因片段被克隆到克隆载体或者其它载体上，成为一个闭环超螺旋的质粒，且该质粒为DH5a等具有甲基化酶基因的宿主中提取纯化出来。因此，质粒上有被曱基化的位点。①引物设计(如附图1所示)设计引物的时候将突变碱基引入正向引物和反向引物。突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5，端的位置。每条引物长约24~38个碱基。正向引物与正义链一致，反向引物与正义链反向互补，两条引物之间约520个碱基反向互补。有几个突变位点就设计几对引物。如两个突变位点之间只相差几个i威基，也可于一对引物里引入多个突变位点；②以高保真酶进行PCR反应(PCR1)(如图2所示)；③Dpnl酶识别甲基化的GATC;故，以Dpnl将2)中的质粒模板消化掉，得到有一个目标突变位点、有开口的环状质粒(Pl)(如图2所示)；④以P1为模板，加入另一对突变引物，进行PCR反应(PCR2),第一个循环(R1)时，两条引物在高保真酶的作用下形成的新链不是完整的质粒单链，而是分别为质粒的一部分(P2-l);第二个循环(R2)时，两条链以引物的互补区结合，在高保真酶的作用下，将每条链上缺失的部分分别补充完整，得到具有两个突变位点的产物(P2-2);进行多次循环后，即可得具有两个突变位点的有开口的环状质粒(P2);(如图2所示)；⑤以④的产物为模板，加入第三对突变引物，按④中的方式进行PCR反应(PCR3)，得到有三个目标突变位点、有开口的环状质粒(P3)(如图2所示)；更多的突变位点依次类推。实施例一15kDa硒蛋白编码区三个位点突变(参见附图3)。人15kDa硒蛋白(Sep15)野生型基因已经克隆到pMD18-T(TAKARA)载体上，编号为pl5-MD-T。以Omega质粒提取试剂盒从DH5a中提取该质粒用于突变实验。该基因上三个TGA用被定点突变为TGC。Sepl5突变引物_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第一轮PCR:PCR以高保真酶(KOD-PLUS，TOYOBO,Japan)完成。反应体系如下:10xPCR緩沖液2mMdNTP混合物25mMMgC12Sepl5mutaFlSepl5mutaRlpl5-MD-T(200ng/pl)KOD-PLUS聚合酶灭菌的去离子水总体积2.5fxL2.51.2pL1|iLlpL1pL0.5pL15.3&25pLPCR条件如下94°C，2分钟；94°C,15秒；，60°C,30秒；P20个循环68°C,4分钟，(因载体加插入片段的长度约为4kb,而此高保真酶的效率是1kb/分钟);68°C，7分钟。Dpnl酶切PCR结束后，用DpnI(NEB,UK)将上述产物酶切，以出去产物中的模板质粒。酶切反应体系如下10x緩冲液42pLPCR产物17.5jaLDpnI0.5jaL总体积20反应条件37°C,1-1.5小时。85°C，15-20分钟，-使酶失活。第二轮PCR:以上述酶切产物为冲莫板进行第二轮PCR。反应体系如下10xPCR緩沖液2mMdNTP混合物25mMMgC12Sepl5mutaF2Sepl5mutaR2Dpnl酶切产物KOD-PLUS聚合酶灭菌的去离子水总体积PCR条件如下94°C，2分钟；94°C，15秒；、60。C，30秒；L20个循环68°C，4分钟；68。C，7分钟。2.5iaL2.5pL1.21|LlLlpL10.5juL15.3^25第三4仑PCR:以第二轮PCR的产物为模板，进行第三轮PCR，反应体系如下:10xPCR緩冲液2.5|aL2mMdNTP混合物2.5juL25mMMgC121.2pLSepl5mutaF21nLSepl5mutaR2第二轮PCR的产物1KOD画PLUS聚合酶0.5灭菌的去离子水15.3ju]总体积25(iLPCR条件如下:94°C，2分钟；94。C,15秒；60°C,30秒；卜20个循环68°C，4分钟；乂68°C，7分钟。转化以10|iL第三轮PCR的产物转化50nL感受态细胞50|iLDH5a。转化条件如下4°C,30分钟；42°C,1分30秒；4°C。力口100无抗性的LB液体培养基至上述管中，于摇床上37°C,220转/分钟，摇l小时。取出上述溶液，涂布于含有100ng/ml氨千的板上。37。C倒置培养过夜(1216小时)。挑取单克隆，于含有100ng/ml氨千的LB液体中，37°C，220转/分钟，培养过夜。收集过夜培养的细菌，提取质粒，测序(生工)。结果测试三个克隆经测序，结果为三个位点定点突变的克隆^t为1,突变效率为33.3%;两个位点定点突变的克隆数为2，突变效率为66.7%且均是前两对引物引起；一个位点定点突变3，突变效率为100%。详见表l:表1三个克隆测序结果定点突变数克隆数突变效率第一对引物引起突变3100%第二对引物引起突变266.7%第三对引物引起突变133.3%实例二将硒蛋白PcDNA上5个编码硒代半胱氨酸的TGA突变为TGC(参见附图4)引物列表如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果测试八个克隆经测序，结果为三对引物均引起突变的克隆数为3个，突变效率为37.5%;两对引物均引起突变的克隆数为5个，突变效率为62.5%且均是前两对引物引起；第一对引物引起突变的克隆数为6个，突变效率为75%。详见表2:表2八个克隆测序结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。权利要求1.一种基因定点多位点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤S1根据突变的碱基所处序列的位点分别设计正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5’端的位置；根据需要进行突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；S2由第一对引物以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；S3采用DpnI酶将步骤S2中所得的基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；S4以步骤S3中的酶切产物为模板，加入第二对突变引物进行PCR反应在第一个循环时，两条引物在高保真酶的作用下形成构成质粒一部分的新链；在第二个循环时，两条链分别与引物的互补区结合，在高保真酶的作用下，将每条链上缺失的部分补充完整，得到具有两个突变位点的产物；在经过多次这样的循环后，即得到多个拷贝、具有两个突变位点、有开口的环状质粒；S5以步骤S4中得到的环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物，按S4中的方式进行PCR反应，依次得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。2.根据权利要求1所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤Sl设计的突变引物中，每条引物长度为2438个碱基，正向引物与正义链一致，反向引物与正义链反向互补，两条引物之间520个碱基反向互补。3.根据权利要求1所述的基西定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S2、S4或S5中的PCR反应体系为`10xPCR緩沖液2.5(iL`2mMdNTP混合物2.5(iL`25mMMgCl21,2nL正向引物(lOpM)0.1~1pL反向引物(10pM)(XllpL模板质粒(200ng/jul)0.5~5juLDNA聚合酶15U灭菌的去离子水至总体积为25|iL。4.据权利要求3所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，步骤S2、S4或S5中的PCR反应条件为94"C下变性05分钟；94。C下变性1530秒，5565。C下退火30秒，6872。C下延伸48分钟，并进行1030个循环；最后6872。C下变性7分钟。5.根据权利要求1所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S2、S4或S5中的高保真酶是高保真的DNA聚合酶。6.根据权利要求1所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S3中酶切的反应体系为10x緩沖液2PCR产物17.5|uLDpnI0.5pL总体积20|aL。7.根据权利要求6所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S3中酶切的反应条件为先在37。C下反应1-1.5小时，再在85。C下反应15-20分钟，使酶失活。全文摘要一种基因定点多位点突变的方法，包括以下步骤根据突变的碱基所处序列的位点分别设计正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5’端的位置；再根据突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；由第一对引物以含有甲基化位点的质粒为模版，以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；采用DpnI酶将基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；再以环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物进行PCR反应，得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。本发明利用引物互补区对有开口的环状质粒模板完成聚合酶链式反应，从而引入多于一个位点的定点突变。文档编号C12N15/09GK101580829SQ200910105658公开日2009年11月18日申请日期2009年2月27日优先权日2009年2月27日发明者琼刘,静田,升董申请人:深圳大学