专利名称：北美大豆猝死病菌检测探针、引物、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，特别是涉及一种检测北美大豆猝死病菌Fusariumvirguliforme的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)等位基因TaqMan MGB探针、引物、试剂盒及其分型检测方法，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
背景技术：
大豆猝死综合症于1971年首次在美国的阿肯色州观察到，1982年正式命名为Fusarium solani， 1997年确定为F. solani f. sp. glycines。 2003年根据病菌形态和生物学特性确定为两个种，即南美大豆猝死病菌F. tuc咖aniae和北美大豆猝死病菌F. virguliform。北美大豆猝死病菌是一种新兴的病害，已知发生于美国、加拿大和阿根廷。我国尚未见大豆猝死综合症病的报道。 北美大豆猝死病菌是我国重要的大豆检疫性真菌，该病菌能导致大豆植株根腐、根冠坏死及维管束变色并能为害叶片导致褪绿、坏死和落叶。如果在幼苗期侵染，能导致植株不开花、不节荚或影响种子品质和产量。根据病菌侵染时期不同所造成经济损失从轻至绝产，在美国由该病造成的损失通常为5% 80%，严重时损失高达100%。近年来我国从美国、加拿大和阿根廷等北美大豆猝死病菌的疫区进口大豆越来越多，该病菌传入我国的风险也越来越大。准确快速的检测技术是阻止病菌传入的有效手段。近年来PCR (Polymerase Chain Reaction,艮卩聚合酶链反应)、RAPD (Random AmplifiedPolymorphic DNA)、PCR-RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism)、Southern杂交等方法已先后应用于北美大豆猝死病菌鉴定，但是这些方法存在操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点，在实际检测工作中难以推广应用。通过形态学鉴定需极丰富的经验，容易误判，而且检测周期长。所以为预防该病菌传入，极有必要建立对该病菌的快速检测方法。 SNP是近年来发展起来的一种高效、便捷的分子标记，它是由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失引起的点突变，使得群体之间和个体之间产生了差异。最初的SNP主要运用在与人体重要疾病的关联性研究中。随着检测技术不断提高以及多种生物SNP数据库的不断完善，单核苷酸多态性已经成为开展遗传疾病的检测、生物多样性评价、遗传图谱的构建、动植物基因标记、品种改良等领域研究的重要工具，在医学和生物学领域受到越来越多的关注。SNP等位基因TaqMan MGB探针鉴别分析是一种多重(每个反应包括一个以上的引物和探针对)终点(在PCR过程的终点收集数据)分析实验，用于检领煤个核酸序列的变异。每个反应中包括两个引物和探针对，通过两种不同荧光物质进行双通道同步检测，实现对每个检测样品的SNP位点的基因型判定，具有高通量的特点，应用于植物病原真菌的鉴定才刚刚起步。
发明内容
本发明的目的意在克服上述现有技术的不足，提出快速、可靠、灵敏度高、特异性
3强和成本低的检测北美大豆猝死病菌的SNP等位基因T叫Man MGB探针、引物、试剂盒及分 型检测方法。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案 北美大豆猝死病菌的SNP等位基因T叫Man MGB探针分型检测探针及引物，其特征 在于，所述引物包括F2:5' -AGATAAGCAGGTCGCCATGAG-3';
R2:5' -CACGTCGACTCTGGCAAGT-3';
所述探针包括VIC2:5' -VIC-CCACCGTAAGTCGCCCC-MGB-3';
FAM2:5' -FAM-ACCACCGTAAGTCACCCC-MGB—3'。 采用前述探针和引物制成的北美大豆猝死病菌的SNP等位基因T叫Man MGB探针 分型检测的试剂盒。 采用前述探针和引物的北美大豆猝死病菌的SNP等位基因T叫ManMGB探针分型检 测方法。 优选地，此方法中加入所述探针和引物进行北美大豆猝死病菌实时荧光PCR反 应； 其反应体系为10ii L的反应体系，双蒸水3. 75ii L， Taqman MIX为5 ii L， 40 X SNP 引物探针混合液为0. 25 ii L， DNA 1 ii L ; 其反应条件为5(TC持续2分钟，95t:持续10分钟；92t:持续15秒，65t:持续l分
钟，经过60个循环。 本发明有益的技术效果是 本发明提供了北美大豆猝死病菌及其近似种的多重SNP等位基因T叫Man MGB分 型检测探针、引物、试剂盒及其PCR分型检测方法，采用本发明的探针和引物进行TaqMan MGB探针分型检测，每个实时荧光PCR反应中包括本发明的两个引物和探针对，通过两种 不同荧光物质进行双通道同步检测，实现对每个检测样品的SNP位点的基因型判定，能够 克服现有的形态学鉴定方法检测周期长、需要丰富经验和PCR、 RAPD、 PCR-RFLP、 Southern 杂交等检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点，具有简 便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高的显著优点。
图1为根据本发明的SNP等位基因T叫Man MGB探针分型检测的北美大豆猝死病 菌检测结果示意图； 本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
具体实施例方式
用于北美大豆猝死病菌的SNP等位基因T叫Man MGB探针分型检测探针及引物，
其中引物包括 F2:5' -AGATAAGCAGGTCGCCATGAG-3;
R2:5' -CACGTCGACTCTGGCAAGT-3';
探针则包括分别用FAM、 VIC标记的两种寡核苷酸探针
VIC2:5' -VIC-CCACCGTAAGTCGCCCC-MGB-3';
FAM2:5' -FAM-ACCACCGTAAGTCACCCC-MGB—3'。
具体可按照如下方法获取上述探针及引物 a.采用植物/真菌DNA提取方法获得真菌基因组DNA，作为下游实验的模板；
b.选择合适的分子标记基因和片段，找出北美大豆猝死病菌不同于其它近似种的 独有的SNP碱基位点； c.根据T叫Man MGB探针的设计原理和设计方法，设计北美大豆猝死病菌及其它 近似种的SNP等位基因T叫Man MGB分型探针、引物； d.对所设计的探针、引物进行筛选，从中筛选出优化的特异性探针、引物；并优化
出合适的PCR反应体系和反应条件。 在本发明中，所选定的探针为VIC2:5' -VIC-CCACCGTAAGTCGCCCC-MGB-3';FAM2:5' -FAM-ACCACCGTAAGTCACCCC-MGB—3'; 引物为 F2:5' -AGATAAGCAGGTCGCCATGAG-3 ;
R2:5' -CACGTCGACTCTGGCAAGT-3'; 本发明还提供一种北美大豆猝死病菌的SNP等位基因T叫Man MGB探针分型检测 的试剂盒，采用前述探针和引物制成。 本发明还提供一种北美大豆猝死病菌的SNP等位基因T叫Man MGB探针分型检测 方法，其中，加入前述探针和引物的探针、引物进行北美大豆猝死病菌实时荧光PCR反应。
优选的实施例中，PCR反应体系为10iiL的反应体系，双蒸水3. 75iiL， Taqman MIX为5ii L，40XSNP引物探针混合液0. 25 ii L， DNA1 ii L。 优选的实施例中，PCR反应条件为5(TC持续2分钟，95t:持续10分钟；92。C持续 15秒，65t:持续1分钟，经过60个循环。 图1展示了根据本发明的SNP等位基因T叫Man MGB探针分型检测的北美大豆猝 死病菌检测结果。用北美大豆猝死病菌SNP等位基因T叫ManMGB引物、探针F2/R2/VIC2/ FAM2可特异性地检测出北美大豆猝死病菌，右下部分为VIC探针所检测到F. virguliforme 样品，左上部分显示FAM探针所检测至U的F. brasiliense、 F. c騰irost進、F. t腦maniae 与F.phaseoli样品，左下部分为去离子水对照(NTC)见图1。 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
权利要求
北美大豆猝死病菌的SNP等位基因TaqMan MGB探针分型检测探针及引物，其特征在于，所述引物包括F25′-AGATAAGCAGGTCGCCATGAG-3′；R25′-CACGTCGACTCTGGCAAGT-3′；所述探针包括VIC25′-VIC-CCACCGTAAGTCGCCCC-MGB-3′；FAM25′-FAM-ACCACCGTAAGTCACCCC-MGB-3′。
2. 采用如权利要求1所述的探针和引物制成的北美大豆猝死病菌的SNP等位基因TaqMan MGB探针分型检测的试剂盒。
3. 采用如权利要求1所述的探针和引物的北美大豆猝死病菌的SNP等位基因TaqManMGB探针分型检测方法。
4. 如权利要求3所述的分型检测方法，其特征在于，包括加入所述探针和引物进行北美大豆猝死病菌实时荧光PCR反应；其反应体系为10ii L的反应体系，双蒸水3. 75ii L， Taqman MIX为5 y L， 40 X SNP引物探针混合液O. 25 ii L，DNA 1 ii L ;其反应条件为50。C持续2分钟，95。C持续10分钟；92。C持续15秒，65t:持续1分钟，经过60个循环。
全文摘要
本发明公开了北美大豆猝死病菌的SNP等位基因TaqMan MGB探针分型检测探针及引物，其中引物包括F25′-AGATAAGCAGGTCGCCATGAG-3′；R25′-CACGTCGACTCTGGCAAGT-3′；探针包括VIC25′-VIC-CCACCGTAAGTCGCCCC-MGB-3′；FAM25′-FAM-ACCACCGTAAGTCACCCC-MGB-3′，以及采用所述探针和引物制成的试剂盒。本发明还公开了采用所述探针和引物的北美大豆猝死病菌的SNP等位基因TaqMan MGB探针分型检测方法，较以往的检测方法具有简单、快速、特异性强、灵敏度高的优点。
文档编号C12N15/11GK101787391SQ20091010528
公开日2010年7月28日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者余道坚, 李一农, 王颖, 程颖慧, 章桂明, 赵巍巍, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心