专利名称：马铃薯金线虫检测用引物及探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，具体地说涉及马铃薯金线虫检 测用引物、探针及其检测方法。
背景技术：
马铃薯金线虫(G/oZ)ocfera mstoc/n'e似^ )和马铃薯白线虫(G 戸肌&)合称马铃薯孢嚢线虫，是马铃薯上毁灭性的有害生物之一， 也是国际上公认的重要检疫性有害生物，据估计在欧洲每年造成的 经济损失达数亿欧元，目前已经随带土的马铃薯种薯传播到几乎所 有的马铃薯生产国家。由于我国采取了严格的植物检疫措施，禁止 从疫区国家输入种用马铃薯种薯，目前马铃薯孢嚢线虫我国未尚有 发生。但是，在中国入世谈判过程中，分别与加拿大和荷兰签署了 有关进口种用马铃薯的植物检疫议定书，其后又与美国、英国签署 了类似的议定书，因此，该线虫随进口马铃薯种薯传入我国的风险 日益增大。
本研究选择马铃薯金线虫ITS序列设计一条荧光标记探针和一 对引物，建立了马铃薯金线虫的荧光PCR检测方法，可快速准确地 检测马铃薯金线虫。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了用于马铃薯金线虫实时荧光PCR检测的引物、4笨针及其检测方法。
本发明通过分析已报道马铃薯金线虫ITS序列的基础上，分别 设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核 苷,列分别为正向引物SEQ ID No. l( FP )和反向51物SEQ ID No.2 (RP)，所述探针核苷酸序列为SEQIDNo.3 ( LP )。
本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方 法，其以样品总DNA为模板，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
具体地说本发明以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反 应，即在25^L反应体系中力口入2.5 fiL 10x反应緩冲液(1 mM Tris-HCl pH 9.0, 5 mM KC1, 0.01% Triton X-100), 2 mM Mg2+， 50 |LiM dNTP, 1U r叫DNA聚合酶，上下游引物FP和RP各400 nM, 200 nM TaqMan探针，lng才莫板DNA，最终用灭菌水补足25 ptL。
其中TaqMan 4笨针是4笨针SEQ ID No.3的5，端标记有FAM荧光 染料，3'端标记淬灭基团TAMRA。
其中，上述反应条件可以是反应程序为第一步95。C 3 min， 第二步95°C 15s, 60。C25s, 40个循环。
当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计 其他类型的^^笨针，以适用不同方法的荧光PCRJ全测。
进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂 盒，以方便使用。
更具体地，本发明的技术方案为
本发明提供了 一种马铃薯金线虫检测用引物，其核苷酸序列为
SEQIDNo.l (正向)5，-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3， SEQIDNo.2 (反向)5'-CACGGCCACGGACGTAG-3，
本发明还提供了一种与权利要求1所述引物配合使用的探针， 该探针的核苷酸序列为
SEQ ID No.3: 5 ，-TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG画3'
该探针一端标记有报告荧光染料，另 一端采用了淬灭基团。
更具体地，上述探针的5，端标记有FAM荧光染料，3'端标记淬 灭基团TAMRA。
本发明还提供了 一种检测马铃薯金线虫的检测方法，该方法以 样品总DNA为模板，利用上述引物以及探针进行实时荧光PCR扩 增，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
上述实时荧光PCR的反应过程程序为第一步95°C 3 min,第二 步95。C15s， 6CTC25s, 40个循环后观察反应结果。
本发明还提供了 一种含有上述引物FP和RP的试剂盒，该试剂 盒还可以包括上述的LP探针。
本发明的根据马铃薯金线虫ITS序列设计上述引物及探针具有 优异的特性，探针的特异性好，用于荧光PCR检测灵敏性高。其能 够快速筒单地判断样品是否有马铃薯金线虫，为进出口安全提供了 保证。
图1是本发明特异性引物和探针专化性检测；GR1至GR8为马铃薯金线虫；GP1至GP6为马铃薯白线虫；BCN为甜菜孢嚢线虫； CCN燕麦3包嚢线虫；CN为Ozcto^ra sp.; CK1至CK3为对照。
图2马铃薯金线虫混合体系及未知孢嚢线虫的检测，MX1至 MX6为马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的混合样品，CK1为没有模板 的对照；CK2为纯水的对照。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明
的范围。 实施例
引物及探针的设计和合成
根据马铃薯金线虫ITS序列，采用探针设计软件Express 2.0设 计出引物及探针，引物序列为
FP (正向)5，-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3， RP(反向)5，-CACGGCCACGGACGTAG-3， 所述探针的序列为
LP: 5, -TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG-3 ，，
该探针的5，端用报告荧光染料FAM标记，3'端采用淬灭基团
TAMRA作标记，获得的探针命名为TaqMan探针。
Real-time PCR扩增方法的建立
1、实时荧光PCR反应体系
采用25-jllL反应体系，具体的反应体系包括2.5 lOx反应緩沖 液(1 mM Tris-HCl pH 9.0, 5 mM KC.l， 0.01% Triton X-100 ) , 2 mM Mg2+, 50 (iM dNTP, 1U TaqMan聚合酶，上下游上述引物FP和RP各400nM， 200nMTaqMan探针，lng模板DNA，最终用灭菌水补 足25/xL。反应程序为第一步95。C3min，第二阶段95°C 15s， 60°C 25s, 40个循环。
2、反应体系M优化
实时焚光PCR进行两步反应，对复性-延伸温度进行了优化； 确定能得到最大的ARn值时的最低引物浓度和镁离子浓度，以使用 最小循环阈(CV)和最大AR。值来作这一优化。研究结果表明，在 本焚光PCR反应体系中，最佳反应条件为正反向引物浓度配比 1200nM/1200nM， Mg"浓度为3.0 mM,探针浓度为600nM，复性 -延伸温度为60°C。
马铃薯金线虫引物FP和RP特异性和LP探针专化性检测 用上述引物和TaqMan探针对14个马铃薯孢嚢线虫群体和其 它几个孢嚢线虫进行的荧光PCR检测结果表明，来自马铃薯金线虫 的8个群体都检测到荧光，而其它孢嚢线虫均不产生荧光，因此特 异性引物和探针能有效地将马铃薯金线虫和马铃薯白线虫及其它孢 嚢线虫区分开来，说明上述引物和探针的专化性。(结果参见图l)
检测灵^t度
将马铃薯金线虫的DNA在紫外分光光度计上测其DNA的量， 然后进行10倍梯度稀释和测量，结果表明线虫DNA浓度越大Cr值 越小，同时能够检测的最低DNA浓度为10fg。
ABI Prism荧光冲企测系统记录的Cr值与DNA模板浓度呈线形关 系(Y=-2.428X+28.03， R2=0.993 ),表明检测结果的有效性，并可 以用于目标DNA的定量分析。同时，对单个干孢嚢进行的灵敏度检测试验，结果表明从单个孢嚢中提取的DNA量足以荧光PCR检观'J， 并且效果很好。
未知孢嚢线虫及马铃薯金线虫混合样品的检测
使用上述特异性引物和TaqMan探针对1个来自俄罗斯的马铃 薯孢嚢线虫样品和6个马铃薯金线虫与马铃薯白线虫的混合样品进 行检测，在混合样品中也都可检测到马铃薯金线虫的存在；未知样 品产生荧光，证明该未知样品为马铃薯金线虫。(结果参见图2)序 列 表 <110> 中国检验检疫科学研究院 <120> 马铃薯金线虫检测用引物及探针 <160> 3
< 170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 1
actccatgtt gtacgtgccg <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 cacggccacg gacgtag <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3
tgcggcatgt ctgcgcttgt g
权利要求
1、一对马铃薯金线虫检测用引物，其核苷酸序列为SEQ ID No.15’-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3’SEQ ID No.25’-CACGGCCACGGACGTAG-3’
2、 一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其核苦酸序列 为SEQIDNo.3: 5，-TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG-3',该探针一 端标记有报告荧光染料，另一端标记淬灭基团。
3、 如权利要求2所述的探针，其特征在于，该探针5，端标记有 FAM荧光染料，3，端标记淬灭基团TAMRA。
4、 一种检测马铃薯金线虫的检测方法，该方法以样品总DNA 为模板，利用权利要求1所述的引物以及权利要求2或3所述的探 针进行实时荧光PCR扩增，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR扩 增的反应程序为第一步95°C 3 min，第二步95°C 15s, 60°C 25s, 40 个循环后观察反应结果。
6、 一种试剂盒，其含有权利要求1所述引物。
7、 如权利要求6所述的试剂盒，其还包括权利要求2或3所述 的探针。
全文摘要
本发明提供了一种马铃薯金线虫检测用引物和探针，本发明还进一步提供了检测马铃薯金线虫的检测方法。本发明通过分析已报道马铃薯金线虫ITS序列的基础上，分别设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列分别为正向引物SEQ ID No.1(FP)和反向引物SEQ ID No.2(RP)，所述探针核苷酸序列为SEQ ID No.3(LP)。本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方法，其以样品总DNA为模板，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明探针特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为进口马铃薯种薯安全提供了保证。
文档编号C12N15/11GK101545008SQ200910079368
公开日2009年9月30日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者曹爱新, 朱水芳, 葛建军, 赵文军, 陈洪俊 申请人:中国检验检疫科学研究院