专利名称：用于检测染色体易位的寡核苷酸探针和引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过使用核酸探针进行的核酸的检测。
通过使用特定的核酸(RNA或DNA)探针，可检测明显感染的核酸分子和其它疾病状态。某些遗传疾病的特征是存有在正常组织中不应存有的基因。其它病理状态的特征是表达在正常细胞中不表达的RNAs或RNA转译产物(即肽或蛋白)。某些疾病状态的特征是缺少某些基因或基因部份，或者缺少或交替表达基因产物或蛋白。
一种特别重要的细胞是由染色体易位造成的已经成为畸变细胞(可能是癌)的正常细胞。因此希望能够检测具有染色体易位的细胞。标准染色体组型技术能鉴别已发生染色体易位的细胞。然而，通过原位杂交的方法来完成鉴定是有利的，因为这通过流式细胞光度术可使大量细胞得到较快的分析。这种杂交技术需要专用于只有当细胞已经产生易位时才存在的核酸的探针、护增引物或引物组。实际上，核酸技术已经用于检测由染色体易位而产生的核酸(M.J.Embleton等人;上述引证;Fritsch等人，U.S.P.4725536;Stephenson等人U.S.P.4681840)。
当探针靶是DNA时，该靶通常是双链靶一个“反义”链，由该链RNA(如mRNA)被转录，另一个“有意义链”，它在碱基序列中对反义链是互补的。这样就可以假定，对于所给定数量的细胞DNA靶，采用包括针对靶的有意义链和反义链的两个探针，可加倍由靶结合探针产生的信号。
然而一般说来，如果探针群体不仅含有与靶的一个链互补的分子而且还含有与靶的另一个链互补的分子，则存在杂交效率(加到试验体系中每μg探针所得到的靶结合探针量)降低的趋势。在努力于尽可能短时间内达到靶饱和的过程中，一个特别可行的途径是增加总的探针浓度，这种效率降低显然主要是由于存在探针分子相互杂交的倾向，因此产生高分子量聚集体。在本发明中，进行了适当的测量，结果是当探针群体具有针对有意义链探针和针对反义链探针时，杂交效率几乎不或根本不降低。
适用于设计向双链靶杂交的探针群体的一些原则也适用于设计仅向存在于已发生染色体易位的细胞中的RNA或DNA分子杂交的探针分子或引物分子。这类探针利用了由于产生易位接合点而存在的新的碱基序列的优越性，在该接合点处，两个正常染色体片段已连接形成易位染色体。
一方面，本发明涉及专门杂交于RNA或DNA的核酸探针或引物，该RNA或DNA跨越已发生染色体易位的细胞中的核酸易位接合点。
本发明的另一方面，形成一种核酸探针群体，使得尽管某些探针分子能够杂交于双链靶的一个链且其它的探针分子能够杂交于该靶的另一个链，但探针分子不会相互杂交。最佳的是有一系列可在该靶的各链上以端对端方式杂交的探针。通过限制探针分子的大小并限制任意两个探针分子间互补区的长度来避免探针群体的自杂交。
图1标记了Gen Bank序列HUMREPA84核苷酸101-400，且表明核苷酸101位于该序列的5′端而核苷酸400位于3′端。与核苷酸101-400之间的序列互补的序列中的核苷酸示于被补充的那些核苷酸之下。该图给出了五个探针(H18-100L、H18-100R、H18-110R、H18-10和H18-11)的核苷酸序列。
图2为表示用于实施例3中的探针间的关系图。
图3a为用实施例4中探针HYR-7-25所得结果的显微相片。
图3b为用实施例4中探针HYR-7-12所得结果的显微相片。
定义“分析物分子”为设计检测试验的分子。
“扩增分子”为使用扩增方法生成的核酸分子(如，PCR、3SR、TAS)。其或具有与全部或部分RNA分析物分子互补的碱基序列或具有与全部或部分RNA分析分子相同的碱基序列。
“探针”为一含有寡核苷酸且通常还含有报导物部分的分子，该报导物可被检测，该寡核苷酸可杂交于一扩增RNA分子。报导物部分(也称为可检测标记)可放射性的、荧光的、化学发光的、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、或其它催化比色反应的酶)、或为可专门与直接连接到可检测部分的配体特性结合分子(诸如抗生蛋白链菌素)反应的配体(诸如生物素或半抗原，可与抗体反应的地谷新配基)，该可检测部分例如为放射性的、荧光的、化学发光的，或酶。
如果“Watson-Crick”碱基配对规则限定了两个核苷酸序列间的关系即无论何处，在一个序列中有一鸟嘌呤(G)而在另一序列中有一胞嘧啶(C)，且无论何处，在一个序列中有一腺嘌呤(A)而在另一序列中或有一胸腺嘧啶(T)或有一尿嘧啶(V)，则第一核苷酸序列与第二核苷酸序列“互补”。
“杂种”是由两个核酸分子形成的一个双链的(或部分双链的)分子，其中一个核酸分子具有与另一分子中的序列互补的核苷酸序列。
当由两个因易位会合的染色体片段形成一新的染色体时，这两个片段会合所在点为“染色体易位接合点”。
“核苷酸序列”一词意在包括这样一序列，其中存在有某种非磷原子(如硫)处于核苷间磷通常出现的一些位置。
“易位跨越接合点细胞RNA分子”为含有两个核苷酸序列的细胞RNA分子(诸如hnRNA或mRNA分子)，这两个序列是邻接的且连接在该分子的RNA易位接合点处，一个核苷酸序列由染色体易位接合点一侧的一部分染色体转录，而第二个核苷酸序列由该染色体接合点另一侧的一部分染色体转录。例如，采用易位跨越接合点hnRNA分子的细胞处理便可在细胞中产生易位跨越接合点mRNA分子。
“易位跨越接合点细胞RNA片段”为含有两个核苷酸序列的细胞RNA分子(诸如hnRNA或mRNA分子)片段，这两个序列相邻接且连接在该分子的RNA易位接合点处，一个核苷酸序列由染色体易位接合点一侧的一部分染色体转录，而第二个核苷酸序列由该染色体接合点另一侧的一部分染色体转录。
“易位跨越接合点细胞DNA分子”为含有两个核苷酸序列的细胞DNA分子，这两个序列相互对接以使形成的序列长度等于它们各自的长度之和，一个核苷酸序列位于其易位接合这一侧的部分染色体上，而第二核苷酸序列位于该接合点另一侧的部分染色体上。
“易位跨越接合细胞DNA片段”为细胞DNA分子片段，该片段具有两个核苷酸序列，这两个序列彼此对接以使形成的序列长度等于它们各自的长度之和，一个核苷酸序列位于其易位接合点一侧的部分染色体上，而第二核苷酸序列位于该接合点另一侧的那部分染色体上。
在词组“易位跨越接合点细胞核酸片段或其扩增复本”中，“扩增复本”包括具有与所述核酸片段的碱基序列等同(将U看做RNA，同样将T看做DNA)或互补的碱基序列的片段。
“易位跨越接合点扩增核苷酸分子”为含有一与跨越接合点细胞核酸分子或片段互补的核苷酸序列的扩增核酸分子。
“易位跨越接合点细胞核酸分子”或为“易位跨越接合点细胞RNA分子”或为跨越接合点细胞DNA分子”。
“易位跨越接合点细胞核酸片段”或为“易位跨越接合点细胞RNA片段”或为“跨越接合点细胞DNA片段”的分子片段。
“引物”为被诸如DNA聚合酶的酶(如，在聚合酶链反应中，“RCR”)或逆转录酶(如，3SR法，Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，vol87，pp 1874-1878(1990))扩展成较长分子的寡核苷酸。
“易位跨越接合点引物”为具有与跨越接合点RNA片段互补或相同的核苷酸序列的引物。
“原位”一词用来描述发生在细胞或基本完整的病毒内部的过程(如，诸如PCR或3SR的杂交或扩增);该细胞或病毒常常已经过交联或沉淀固定剂处理，其中许多(而不是全部)在本文中有命名。
“易位跨越接合点探针”为具有与跨越接合点RNA片段互补或相同的核苷酸序列的探针。
用于本文中的“生物实体”或为细胞，或为病毒。
“分子群体”指许多分子。由于探针及引物分子长度可小至20-50个核苷酸，且其加入反应混合物的浓度在100ng-10μg或(若有必要则)更高的范围内，故该分子数量常常很大。
“分子均质群体”指在群体中的每一分子与其它各分子相同。
短语“含有一核苷酸序列的分子，该核苷酸序列与或为易位跨越接合点细胞核酸片段的或为其扩增复本的核苷酸序列20-50核苷酸但不大于20-50的核苷酸互补”指的是，那些不为跨越接合点序列部分的序列可为该分子的一部分。
跨越接合点探针或引物的设计在本发明中，当跨越接合点引物或探针杂交于细胞中一跨越接合RNA分子时，便在该探针不会与非跨越接合分子杂交的条件下(温度、时间、离子强度等)发生了杂交作用。通过适当选择该引物或探针的长度，并按照下面的规则选择适当的杂交条件，可实现这一选择性杂交过程。该规则为对任意一对单链分子来说，若一个分子自身内部具有与该第二分子内核苷酸序列互补的核苷酸序列，且那两个核苷酸序列都为N核苷酸长(二者分子的总长度可大于N)，则仅当N长于某临界值时，该分子会形成杂种。该临界值部分取决于杂交条件(温度、所选溶剂等)且部分取决于该互补序列的核苷酸组成。
变换杂交条件和/或该探针分子的碱基序列，便可变换N的临界值。采用常规实验，可确定任意杂交条件与靶序列组合态下的临界值，从而实施本发明的方法。
N必须超过一邻界值的事实构成了检测包含结合点的核酸序列的基础。正常细胞的核酸应具有这一序列的双重部分，但这两部分不连接。因此，若该探针与接合点一侧的不大于N-1核苷酸的序列(或者优选不大于N-3核苷酸的序列)互补并与该接合点另一侧的不大于N-1核苷酸的序列(或优选为不大于N-3核苷酸的序列)互补，该探针便不会与正常细胞核苷酸杂交。
优选的是，易位跨越接合点的探针或引物具有与长度为20-50核苷酸(更佳长度为20-35核苷酸)的易位跨越接合点片段的序列互补的核苷酸序列。较佳的是，对采用如下所述的探针L6-26和K28-26的情形而言，与该探针或引物互补的一半跨越接合点片段应在含该片段的易位接合点的一侧(意为其另一半应在该接合点的另一侧)。
重叠探针应用规则来建立能够与分析物分子的双链形成杂种的探针群体。
应考虑到，对任一对单链分子来说，如果在一个分子自身内部具有与第二分子内的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且这两个核苷酸序列均为N核苷酸长(二者分子的总长主工可大于N)，则仅当N大于某一临界值时该分子会形成杂种。该临界值部分取决于杂交条件(温度、溶剂选择等)还部分取决于互补序列的核苷酸组成。
可看出，下面实施例列举的实验中的该临界值介于12-23之间。在这些实施例中，通过使探针分子的长度为约24核苷酸且不使任一对探针分子的N超过12，便获得用于杂交到双链靶上的有效探针群体。该群体所以有效，是因为其可获得双倍于用只向单链杂交的探针所获得的那样大的信号。
变换杂交条件和/或该探针分子的碱基序列，便可变换N的临界值。这可从本文所包括的实施例中证实。然而，采用按照下面给出的规则所做的常规实验，可以确定任意组杂交条件下的临界值，从而实施本发明的方法。
一方面，本发明为一种用于检测双链核酸靶的方法，该方法包括的步骤为(1)使该靶链充分分离以使其各自与互补核苷酸序列的核酸探针杂交;
(2)将充分分离的靶链与一核酸探针群体共培养，该核酸探针群体包含与一个靶链呈核苷酸序列互补的分子和与另一个靶链呈核苷酸序列互补的分子;及(3)检测与靶分子杂交的核酸探针分子进行步骤(2)所处的条件应使得各靶链与与该呈核苷酸序列互补的核酸探针分子形成杂种;
要使得对于每一核酸探针分子的核苷酸序列来说，在靶内存有全部的互补序列;
要使得每一核酸探针分子与至少一个另外的核酸探针分子呈核苷酸序列的部分互补;
要使得不应有两个核酸探针分子彼此的核苷酸序列完全互补;
要使得在一个核酸探针分子的一部分与另一核酸探针分子呈核苷酸序列互补之处，那一部分的长度短到在步骤(2)的条件下不能与其它核酸探针分子杂交。
“核苷酸序列”一词意在包括有在核苷间磷通常出现的一些位置存在一些非磷原子(如硫)的部分的序列。在这一状况下，与核苷酸序列互补的两个分子可替换为与核苷序列互补或与核苷酸序列互补。
通常用可检测标记(如放射性32P、诸如荧光素的染料分子、或可进入化学发光反应的部分)来标记探针分子。
在本方法的一个总实施方案中，两个靶链位于或为细胞或为病毒的生物实体中。该细胞或病毒可悬浮于溶液中但不固定在固体承载物上。另一方面，该细胞或病毒可固定在固体承载物上。该细胞或病毒可为部分组织切片。
含有靶核酸分子的细胞可为真核细胞(如人体细胞)、原核细胞(如细菌)、植物细胞、或其它类型细胞。它们可为诸如酵母的简单真核生物或可衍生物复杂真核生物(诸如人体)。
核酸的靶链可在无包被病毒或包被病毒(具有诸如脂质蛋白膜的无包被膜)中。
在本发明的一个实施方案中，探针群中的多个分子或直接地或通过交联剂分子各个共价连接到一荧光染料分子上。
在该方法中，两个靶链可为纯化核酸。他们可能取自病毒、细胞或多细胞机体。
在该方法的步骤(2)中可将两靶链固定在固体承载物(诸如硝化纤维素纸或尼龙片)上。任选地，该靶链也可在溶液中而不固定在固体承载物上。
在该方法中，靶链可为DNA。靶链也可为RNA，如对其中在一个单细胞内可同时存在互补RNA链的病毒(如人体免疫缺乏病毒)的情形即是如此。
病毒核酸靶可为部分病毒，在此情形下该病毒可在或可不在细胞内部。任选地，病毒核酸靶可不为病毒部分，但可在细胞内部。
在本方法的一个优选实施方案中，探针分子具有核苷酸序列，以使得若该靶链的一个链为探针分子所饱和，则在探针分子之间不含有形成缺隙的未杂交的靶链序列。
优选的是，每一探针分子与存在于至少一个另外的探针分子中的长度不小于约12核苷酸而不大于约100核苷酸的一个序列互补。
更佳的是，每一探针分子与存在于至少一个其它的探针分子中的长度不小于约12核苷酸而不多于约20核苷酸的一个序列互补。
在一优选实施方案中，每一探针分子与存在于至少一个其它探针分子中的约12核苷酸长度的序列互补。
优选每一探针的长度介于约15-100核苷酸。更佳的是，每一探针的长度介于约15-40核苷酸。
该方法中，与另一探针分子互补的探针分子部分的长度优选不少于约12核苷酸而不大于约100核苷酸。更佳的是，与另一探针分子互补的探针分子部分的长度不少于约12核苷酸而不多于约20核苷酸。在本方法的一个最为优选的实施方案中，该与另一探针分子互补的探针分子部分约为12核苷酸长。
在上述方法的具体实施方案中，该双链靶具有第一靶链和第二靶链，且其中在核苷酸序列中与第一靶链互补的探针分子具有结构不同于与第二靶链互补的探针分子上的可检测标记的可检测标记。例如，在于核苷酸序列中与第一靶链互补的探针分子上的可检测标记可为荧光染料，而在与第二链互补的探针分子上的可检测标记也可为荧光染料。在一特殊的实施方案中，其中双链靶为DNA靶，在核苷酸序列中与第一靶链互补的探针分子也在核苷酸序列中与细胞的RNA分子互补。表明后一特殊实施方案有效的实施例中，在所关心的靶细胞内可能有一双链DNA病毒染色体组(或-RNA病毒染色体组的逆转录酶DNA复制)，且若确实存在有这样一染色体组，则可能有或可能没有从这一染色体组转录的RNA。从临床的观点看，不仅了解DNA染色体组是否存在具有意义，而且了解该染色体组是否被表达为mRNA或染色体组的其它RNA复制也具有临床意义。若没有病毒mRNA(或其它RNA)存在，则由作用于反意义链的探针检测的核酸的量应等于由作用于意义链的探针检测的核酸量。若还存在有病毒mRNA，则由作用于DNA意义链的探针检测的核酸量超过由作用于DNA反意义链的探针检测的核酸量。这种超额是因为有mRNA的存在。确实，通过标定作用于已知量的病毒RNA及病毒DNA的探针，便可得知由给定量的杂交探针放出的荧光量，便可用这一结果计算存在于试验样品中的病毒RNA及病毒DNA的量(总质量)，且还可根据RNA及DNA靶的分子量计算每一试验样品继而每一细胞的RNA分子复制数目及病毒DNA的复制数目。
如果实施例4和7的计划接续使用各带四个氟的30链节，且如果在载玻片上与细胞杂交，并且如果用足够的30链节覆盖靶的双链，则应该能够检测单细胞中靶的单复制，即使该靶短至750碱基对，可用眼睛通过显微镜观察到荧光，或当靶短至75-150碱基对时用象分析装置观测到。
该双链靶可为细胞DNA、细胞RNA、病毒DNA、或病毒RNA。
本发明除具有多种方法外，在此还涉及核酸探针群体，包括所有具体的及优选的实施方案，均公开在这些方法的使用当中。
相关的发明为用于本发明上述方法中的探针群体。此处的核酸探针群体为一例，其中
1)每一探针分子长度在约15核苷酸至约100核苷酸之间。
2)在核苷酸序列中没有完全与其它探针分子互补的探针分子，以及3)在核苷酸序列中每个探针分子与至少1个其它探针分子是部份互补的。
使用跨越接合点的探针可检测的疾病和易位实例表A是可使用本发明检测的疾病类型的说明。但这并不是试图限制能用本发明检测的疾病和易位的类型。
易位的跨越接合点的核苷酸序列或是已公开，或是可通过使用用于已公开序列的技术而被确定。
表A公知易位的实例t(2;8)(p11;q24)Burkitt淋巴瘤(Fujino et al.,Jpn. J. CancerRes.,vol 77,pp 24-77(1986)t(11;14)(q13;q32) 慢性淋巴细胞白血病(Y.Tsujimoto et al.,NAture,vol 315,pp 340-343(1985)t(7;9)(q34;q34.3)急性T细胞淋巴母细胞白血病(T.C.Reynoldset al.,Cell,vol 50,107-117(1987)t(14;14)(q11;q32) T细胞慢性淋巴细胞白血病(M.P.Davey etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol 85,pp9287-9291(1988)t(8;14)(q24;q32)Burkitt 淋巴瘤(F.G.Haluska et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.,USA,vol 84,pp 6835-6839(1987))t(10;14)(q24;q11) T细胞急性淋巴细胞白血病(M.Zutter etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol 87,pp 3161-3165(1990)
t(9;14)(p13;q32) 扩散大细胞淋巴瘤(H.Ohmo et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,vol 87,pp 628-632(1990))t(1;14)(p33;q11) 白血病细胞(8)(C.G.Begley et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,vol 86,pp 2031-2035(1989))t(X;18)(p11.2;q11.2) 滑膜肉瘤(X-Y易位) X连锁的隐性软骨发育异常点(punctata)(47,XY,+del(s)(q12,q34),t(15;21)(q21;q22) 急性成髓细胞白血病(AML)47,XY,+del(s)(q12,q34) 急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)t(8;14)(q24;q11) 急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)t(8;14)(q24;q11) 白血病/淋巴瘤13(q11) 其它各ALL(近基的de115q) Prader-Willi综合征t(1;15)(p36.2;p11.2) 扩散性肌肉张力减退(X;5)(p11.2;q35.2) 色素失调症(2q13) 横纹肌肉瘤t(16;21)(q11;p11) 三体性16pt(1;19) 前B细胞急性淋巴母细胞白血病t(15;17) 急性前髓细胞白血病(APL)t(1;7)(p11;p11) 急性骨髓白血病或脊髓发育不良(8q24 14q32) Burkitt's淋巴瘤Bcl-2t(11;14)(q13;q32) Bcl-1t(14;18)(q32;q21) Hodgkin淋巴瘤(NHL)
t(8;14)(q24;q32) 淋巴小结组织学型t(3;22)(q24;q11) 类Burkitt淋巴瘤t(11;14)(q13;q32) 扩散的大细胞淋巴瘤t(9;22)(q34;q11) 慢性骨髓单核细胞白血病W/(Ph)t(4;6)(p15;p12) 慢性骨髓单核细胞白血病W/(Ph)inv(3)(q21;q26) 顽固性贫血t(3;3)(q21;q26) RAEB-Tinv(3)(q21 q26) 伴随骨髓外化生的骨髓纤维变性(MMM)3p上损伤 肾细胞癌(RCC)(3;21)(q26;q22) 继发性白血病t(3;21)(q26.3;q22) 急性骨髓白血病5q35 儿童期Malignant组织细胞增多病t(5;6)(q35;q21)t(2;13)(q37;q14) 横纹肌肉瘤(RMS)(Y;11)(q11.2;q24) Jacobsen综合征t(X;18)(p11;q11) 二阶级和一阶段滑膜肉瘤t(X;15;18)(p11;q15;q11) "t(X;7)(q11-12;q32) "14q32(28%)或14q11(14%) 成人期T-细胞白血病/淋巴瘤t(19;22)(q13.3;p11.2) 远基19q在染色体*11和22之间*易位* 神经上皮瘤+der(1q9p) 骨髓组织增殖紊乱切断点在Xp22和Xq28 平衡的X-常染色体11q23 成人期急性骨髓白血病
13q的畸变或三体性13 7q和1q三体性1 1qt(8;14)(q24;q32) Burkitt型白血病t(9;22)(q34;q11) Philadelphia+All(PhL+ALL)X;6 q15-16 先天性急性淋巴母细胞白血病(ALL)(8;21) 顽固性贫血46,XY,der(5)t(5;11)(p15.2;p14)[11p15]Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)11p15,fus(14p;21p),以及fus(15p;21p)骨巨细胞瘤(GCT)11q13 多发性内分泌腺瘤形成1型(MEN1)t(7;22)(p22;q13) 与inv(16)(p13q22)急性非淋巴细胞性白血病相关(M4)46,XY/46,XY,t(7;19)(q22;p13.3) 急性骨髓单核细胞白血病(FAB M4)46,XY/46,XY,t(7;19)(q11;q13) 儿童期ALL46,XY,t(3q;11q),t(7q;19p),t(15;17)(q26;q22)ANLL(FABM3)'2探针核酸探针可以是DNA，RNA，或寡核苷酸或由DNA或RNA组成的多核苷酸。该DNA或RNA主要成份可为腺苷，尿苷，胸苷，鸟嘌呤，胞嘧啶或其任何天然可人造化学衍生物。该探针能够通过一种或多种化学键，通常通过氢键形式连接到互补的或镜象靶细胞的遗传序列上。
核酸探针在加入杂交溶液之前可以被可检测地标记。也就是说，可选择连接到杂交产物上的可检测标记。探针可用任何用于实施本发明的可检测基团标记。这种可检测基团可以是任何具有可检测物理或化学特性的物质。这种可检测标记在免疫学领域中已被深入地研究，并且一般说来多数用于这些方法的任何标记均可用于本发明。特别有用的是酶活性基团，例如酶(参看Clin，Chem.，22∶1243(1976))，酶底物(见British Pat.Spec.1548741)，辅酶(见U.S.Patents Nos.4230797和4238565)和酶抑制物(见U.S.Patent No 4134792);荧光剂(见Clin.Chem.，25∶353(1979));发色团;发光剂例如化学发光剂和生物发光剂(见Clin.Chem.，25∶512(1979));特定可连接配体;近端的相互作用对;以及放射性同位素如3H，35S，32P，125I和14C。术语“核酸探针”被认为是包括以任何方式，包括以上述方式被标记的核酸。
生物素标记的核苷酸可通过断口转译，酶解法或化学方法掺入DNA或RNA。生物素化的探针在杂交后使用抗生物素蛋白/链状抗生物素蛋白，荧光的，酶解的或胶态金接合加以检测。核酸还可以用其它荧光化合物，用可免疫检测的荧光衍生物或用生物素的类似物标记。核酸也可借助于连接蛋白质来标记。还可使用交联到放射性或荧光组蛋白HI上，酶(碱性磷酸酶和过氧化物酶)上，或单链结合(ssB)蛋白质上的核酸。为了提高检测胶态金或过氧化物酶产物的敏感性，可使用一些采用银溶液的强化或扩增步骤。
也可利用间接的荧光免疫细胞化学步骤(Rudkin and Stollar(1977)Nature 265∶472;Van Prooijen等人(1982)Exp.Cell.Res.141∶397)。通过向动物注射多(rA)-多(dT)增高了多克隆抗体抗RNA-DNA杂种的能力。将DNA探针原位杂交到细胞上，而杂种通过用抗RNA-DNA杂种的抗体进行培养来检测。
探针的光生物素TM标记对于生物素标记而言是较佳的。
核酸探针可用来针对各种病毒的、原核的和真核的核酸靶子。这些发明的探针群体的靶子通常是DNA靶子，例如基因(如致癌基因)，控制成份(如启动子，阻遏物，或强化因子)，染色体的易位连接点，或对核蛋白体RNA、转移RNA或RN酶P编码的序列。任选地，该靶子可以是任何核酸靶子，或是RNA或是DNA，它包括两个互补的靶核苷酸序列中的一个;它例如在希望用特性序列或其补体检测任何DNA或mRNA分子的场合就是该种情况。如在易位的跨越接合点的分子的情况下，或病毒RNA序列及其RNA补体在同一细胞中存在的情况下，该靶子可以是RNA。
由各实施例可以看出，任何所希望序列的探针均可制作。
当靶子是提纯的核酸时提纯的核酸在本文中被认为是已从细胞提取，或认为是已在异位的无细胞系统中合成。为将探针杂交到该提纯的核酸上，已公开了许多方法。在通常情况下，如果靶子是DNA分子，那么在杂交步骤发生之前通过加热或其它方法将其链分离。杂交可采取良好制定的步骤用固定在固态载体(如DNA用硝化纤维素纸，RNA用尼龙)上的靶子进行。该探针可以以与下述原位实验标记探针相同的方法而被标记;或以其它可检测的方法对它们进行标记。对于实验这些实验而言，标记的方法不限。如果已知一标记步骤适用于针对提纯核酸靶的探针，则可预料该标记步骤适用于打向双链的情况下的探针群。
在细胞，组织和流体中的靶子对于在液态悬浮液中的，在玻片或其它固态载体上的细胞中的，在组织培养细胞中的，以及在组织切片中的生物实体内的靶子可进行杂交试验。当生物实体是细胞时，它可取自固态组织(例如骨髓，神经，肌肉，心脏，皮肤，肺，肾，胰，脾，淋巴结，睾丸，子宫颈，以及脑)或存在于衬在各种道，导管和腔体(例如胃肠道，尿道，输精管，子宫腔，子宫管，阴道，呼吸道，鼻腔，口腔，咽，喉，气管，支气管和肺)的膜内的细胞或有机体流体(例如尿，胃液，痰，血液和淋巴液)或粪便中的细胞。
当靶子在生物实体中时可能的杂交条件的两份很有用的说明记载在
发明者N·普拉沙, M·布里克, M·L·库比治, M·阿斯加里, C·L·里丁, W·D·韦伯, S·-C·祝, J·布里泽 申请人:阿普罗精内斯有限公司, 得克萨斯系统大学评议会