铃铛刺ERF转录因子cDNA序列及其表达载体和应用的制作方法

专利名称：：铃铛刺ERF转录因子cDNA序列及其表达载体和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种与植物抗逆性相关的cDNA序列及其编码的转录因子，尤其涉及从沙生植物铃铛刺(他h'ffloc/朋dronhaJode/Kyron7.)中所分离、克隆的编码ERF转录因子的cDNA序列，本发明还涉及含有该cDNA序列的植物高效表达载体以及它们在提高植物抗逆性中的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术：
：植物的逆境包括非生物逆境(如干旱、盐碱和低温等)和生物逆境(如真菌、细菌、病毒和线虫等引起的病、虫害以及杂草危害)。干旱、盐碱和低温是影响陆生植物生长和限制作物产量的三种主要的非生物胁迫因子。据统计，世界干旱半干旱地区涉及50多个国家和地区，约占全球陆地面积的34.9%。目前全世界用于农业的57亿公顷可耕旱地中，约70%的耕地由于干旱等因素导致土质退化，亚洲受此影响的土地面积最广，近14亿公顷。而我国的干旱、半干旱地区约占国土面积的一半以上，年受旱面积达200-270万公顷。其危害相当于其它自然灾害之和。此外，世界盐碱地占全球陆地面积的7.6%，随着工业化进程加快，我国的土壤盐渍化面积不断扩大，目前盐渍化土壤面积约有2600万公顷，其中盐碱耕地约有670万公顷，严重制约了农业对土地的利用。低温作为经常发生且危害严重的逆境因素之一，它不仅影响着植物的季节性生长，也影响着植物的地理性分布。据统计，我国每年因冻害造成的农业损失高达数十亿元。干旱、盐碱和低温等非生物逆境都会构成对植物的渗透胁迫，致使环境渗透势低于植物细胞渗透势而导致植物细胞失水，严重的可造成细胞膨压完全丧失，甚至导致植物死亡。当然，植物为了适应环境，在长期演化过程中也形成了复杂而精细的调节机制，提高了自身对不良环境胁迫的抵抗或忍耐能力，以适应不良环境。病虫害是造成农作物减产、森林危害的重要生物胁迫因子，如我国每年森林病虫害发生面积约在1.2亿亩左右。2008年的水稻重大病虫害发生面积14.8亿亩次，其中，病害以纹枯病、稻瘟病为主，发生面积4.0亿亩次；虫害以稻纵巻叶螟、稻飞虱和螟虫为主，发生面积10.8亿亩次，基本与2007年持平，此外玉米、棉花等重要经济作物均存在严重的病虫危害，造成巨大的经济损失。而植物在适应病原物侵染的过程中获得了复杂的植物防卫反应(plantdefenseresponses)机制。植物识别病原物后，通过一系列信号传递过程，最终诱导相关植物防卫反应基因的表达。植物防卫反应基因的转录调控(transcriptionregulation)已成为植物防卫反应研究中最具活力的领域之一。然而，单个植物防卫反应基因的超表达能够提高植物对某个病原物的抵抗能力，而一个转录因子的超表达能够激活多个下游抗病基因的表达。因此，利用转录因子来改良植物的综合抗病性，是一种很有潜力的方法。铃挡刺(/feh'fflode/idronJodencfronV.)系豆科铃铛刺属中抗旱、抗病性、抗盐极强的灌木。集中分布于新疆塔克拉玛干沙漠和内蒙古巴丹吉林沙漠和甘肃民勤等地，国外原苏联，蒙古也有。降雨量在130mm以下的干热荒漠区及地下水浅的地方均可生长。铃挡刺系含高蛋白质放牧用豆科植物，是荒漠牲畜骆驼和羊的喜食牧草。可做改良盐碱土和固沙植物，并可栽培做绿篱。铃铛剌具有极强的抗旱耐盐碱、抗病、防风、固沙、改良土壤等能力，能够在极度干旱缺水的环境中生长除了其形态学上部分的特点外，更主要的是由于沙生植物在长期生长进化过程中形成了其特有的基因构成及精密的表达调控方式，能够合成并保持较多的抗旱抗渗透胁迫保护物质，体内存在着丰富的高抗性基因资源。因此，从沙生植物铃铛刺中克隆与抗逆性紧密相关的基因，不仅能为基因工程育种提供优良基因源，而且对于作物抗逆育种显得尤为重要和迫切。AP2/EREBP类转录因子是植物中所特有的一个庞大的转录因子家族，它主要参与干旱、高盐和低温胁迫应答以及病原、激素反应和植物发育。这个基因家族的成员都含有由60个左右氨基酸残基组成的非常保守的DNA结合区(g卩AP2/EREBP结合域)，这类蛋白根据DNA结合区的同源性又可以分为5类ERF(ethyleneresponsivefactor,乙烯反应因子)类、DREB类、AP2类、RAV类以及其它类型。很多研究已经证明，ERF类和DREB类转录因子在逆境抗性中起重要作用。ERF转录因子分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关。从最初拟南芥中ERF转录因子的克隆距今，只短短10年，但却从多种植物中克隆分离到上百种ERF转录因子。ERF转录因子特异识别结合CRT/DRE、GCC-box盒等元件，调控一系列干旱、低温、病程应答基因的表达，这些基因所编码的产物使植物适应或抵御逆境。另外，超表达ERF的拟南芥耐旱耐寒及抗病性增强，其中耐性的提高，不仅与CRT/DRE基因的表达增强有关，还与脯氨酸和糖含量的升高有关，而抗病性的增强是由于其一系列与病程相关基因的表达有关。因此，ERF转录因子的功能，可能不简单局限于对含有CRT/DRE、GCC-box等顺式元件基因的调控，可能还以某种方式、通过某种途径调控其它与耐逆相关的基因表达。目前对ERF转录因子的认识还十分肤浅，对其功能和所参与调控的信号传导途径的准确理解和把握，还需要不懈的努力。到目前为止，已经从多种植物中克隆分离到上百种ERF转录因子，包括单子叶植物和双子叶植物，并且ERF顺式作用元件与反式作用因子相互作用的调控模式已经在草本植物种发现并被证明，如拟南芥、小麦、黑麦草、番茄、玉米、大麦、水稻等。但是目前尚未见到从沙生植物、尤其是野生灌木类沙生植物铃铛刺中克隆到相关基因的报道。目前，植物抗逆基因工程的研究取得了一定进展，但是其重点均在导入个别功能基因来提高某种抗性，从而达不到使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。植物的抗逆性并不是由单个或少数几个基因的表达来体现的，而是由多基因控制的数量性状。虽然目前已陆续从各种植物中克隆出大量的抗逆相关基因，但这些基因大多数只能增加植物的某种单一抗性，并不能从整体上综合提高植物的抗逆性。转录因子作为功能基因表达的调节开关，可以对不同的基因进行精确的调节，在植物逆境信号传递过程中发挥着关键的作用，所以通过增强某个转录因子的作用，可促使多个与抗逆有关的功能基因表达，这是使植物抗逆性状获得综合改良的一条非常有效的途径。ERF正是这一类的转录因子，在胁迫信号'传递过程中起重要作用，它可以调控多个与植物抵抗干旱、高盐、低温及病原菌等有关的功能基因的表达，从整体上增强植物的抗逆性，提高其稳定性，对于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潜在应用价值，并将有巨大的应用前景。因此，克隆新的具有自主知识产权的ERF类转录因子基因，研究其基本的生物学特性和功能，将为整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，为改良作物抗逆性、创造新的抗逆材料提供物质基础。综上所述，对于一个水资源紧缺、盐渍化土壤面积不断扩大、耕地面积有限、病虫害曰益增多、人口众多的农业大国来说，克隆在植物抗逆过程中起重要作用的调控基因，对于农业的可持续发展具有重要意义。
发明内容本发明目的之一是提供一类从沙生植物铃铛刺(/feh'ffloctendronteJodendronV.)中所分离、克隆的与植物抗逆性紧密相关的ERF转录因子cDNA序列。本发明目的之一是通过以下技术方案来实现的一类从沙生植物铃铛刺中所分离、克隆的与其抗逆性紧密相关的ERF转录因子cDNA序列，该cDNA序列为以下(a)或(b)所示的碱基序列(a)SEQIDNO:1所示的碱基序列；或(b)将SEQIDNO:1所示的碱基序列一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的碱基序列，该碱基序列所编码的蛋白仍具有ERF转录因子的功能。本发明根据植物中SF基因DNA结合域保守区设计简并引物，利用RT-PCR方法从沙生植物铃铛刺中分离到fiF2基因的同源片段，然后通过RACE-PCR技术克隆得到新的ERF2转录因子基因他SF2(SEQIDNO:1)，并对其进行了序列分析和蛋白的三维结构预测，结果显示该基因具有ERF转录因子所特有的三个功能结构域，即核定位信号、DNA结合域和转录激活域。序列比对表明该基因和其它已知的ERF基因除了在保守的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性外，在其它区域的序列同源性不高。通过构建植物ERF转录因子的系统进化树分析发现该HhERF2蛋白主要与ERF2类转录因子聚在一起，并且与双子叶植物的ERF2类转录因子的亲缘关系更近；分别以基因组DNA和cDNA为模板对HhERF2进行PCR扩增，扩增产物经序列分析表明，该基因含有1137bp的内含子；通过半定量RT-PCR对其组织^P异性表达进行检测，结果显示该基因在铃铛刺的根、茎、叶中均有表达；通过半定量RT-PCR对其在不同的胁迫条件下进行胁迫反应检测，结果显示该基因的表达受干旱、高盐和低温环境逆境的诱导，此外，该基因的表达还受茉莉酸甲酯的诱导，并且其表达不依赖于ABA的调控。本发明目的之二是提供一类由上述cDNA序列所编码的铃铛刺ERF转录因子。本发明目的之二是通过以下技术方案来实现的一类由上述cDNA序列所编码的铃铛刺ERF转录因子，为以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有ERF转录因子功能或活性的氨基酸序列。优选的，本发明所述的铃铛刺ERF转录因子为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本发明上文中所述的"多个"通常意味着28个，优选为24个，这些取决于ERF转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的"替换"是指分别用不同的碱基或氨基酸残基取代一个或多个碱基或氨基酸残基；所述的"缺失"是指碱基序列或氨基酸数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个碱基或氨基酸残基；所述的"插入"是指碱基序列或氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个碱基或氨基酸残基。本发明还涉及可以在植物中高效表达所述ERF转录因子cDNA序列(SEQIDNO:1)的植物表达载体。将本发明ERF转录因子cDNA序列插入到植物表达载体合适的限制性酶切位点之间，可操作的与表达调控序列相连接，得到可以在植物中表达该cDNA序列的植物表达载体。例如，该植物表达载体可以由5'非编码区，SEQIDNO:l所示的cDNA序列和3'非编码区所组成，其中，所述的5'非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子序列可以是组成型、诱导型、组织或器官特异性诱导子。所述的3'非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等；SEQIDNO:1所示的cDNA序列可以是将其一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的碱基序列所替换，该碱基序列所编码的蛋白仍具有ERF转录因子的功能。作为本发明的一个最优选的实施方案，所述的高效植物表达载体是pC1302-HhERF2。本发明还涉及包含上述植物表达载体的植物细胞。转录因子通过与下游基因启动子区域的顺式元件结合可以调控一系列相关功能基因的表达，因此，在植物抗性分子育种中，导入转录因子基因能有效地提高转基因植物的抗逆性。所以，可以将本发明cDNA序列应用于提高植物的抗逆性。例如，可以将含有本发明cDNA序列的植物表达载体导入到植物细胞中，培育筛选得到对环境胁迫的抗性提高了的转基因植株，其中，所述的环境胁迫可以是干旱、高盐、低温或病害等逆境。为了进一步分析克隆到的他朋F2转录因子基因的功能,本发明首先构建了含有他朋F2基因的植物高效表达载体pC1302-HhERF2，利用农杆菌介导将其转化到拟南芥中；通过Hyg抗性、基因组PCR及RT-PCR筛选鉴定阳性苗，对转基因拟南芥苗进行干旱、高盐、低温及病害等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定，通过测定生理生化指标得出，转基因植株的植株含水量、丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量高于对照，这些渗透调节物质的大量积累有助于减少渗透胁迫和干旱胁迫对植物的伤害，成为转基因植物抗渗透能力和抗旱能力提高的重要生化证据，也进一步说明过表达iftSF2基因能调节渗透调节物质的含量从而提高转基因拟南芥的抗旱性和渗透胁迫抗性，以维持植株正常的生理生化功能。同时转基因植株的抗病相关基因的转录水平也高于对照，相应的转基因植株较野生型植株的抗病性增强，这说明了ERF转录因子也能增强植株的抗病性。ERF转录因子对一系列抗逆功能基因的转录以及对脯氨酸和糖含量的促进作用说明ERF转录因子在植物抗逆反应中起着重要作用。图1简并PCR扩增结果。图23'RACE-PCR扩增结果。图35'RACE-PCR扩增结果。图4HhERF2cDNA全长序列得扩增结果。图5HhERF2蛋白的三维空间结构预测。图6HhERF2氨基酸序列的系统进化树分析结果图7HhERF2基因的基因组DNA结构分析。图8HhERF2基因的组织特异性表达分析结果图9不同胁迫处理下HhERF2基因的表达模式分析。图10表达载体pC1302-HhERF2的构建流程图。图11重组质粒pC1302-HhERF2菌落PCR扩增结果。图12重组质粒pC1302-HhERF2的酶切结果；1，质粒pC1302-HhERF2，2.BgiII单酶切；2，BgiII和SstElI双酶切。图13含有表达载体pC1302-HhERF2的农杆菌C58C1的菌落PCR;CK+:连接有目的基因的pMD19-T(阳性对照)，CK-:农杆菌C58C1(阴性对照)。图14转基因拟南芥的Hyg抗性筛选图15转基因拟南芥的DNA水平的PCR检测；CK+:连接有目的基因的pMD19-T(阳性对照)，CK-:野生型拟南芥基因组DNA(阴性对照)。图16转基因拟南芥的半定量RT-PCR检领ij;CK+:连接有目的基因的pMD19-T(阳性对照)，CK-:野生型拟南芥cDNA(阴性对照)。图17转基因拟南芥的抗旱性分析结果。图18转基因拟南芥的耐盐性分析结果。图19转基因拟南芥的耐低温分析结果。图20转基因拟南芥的抗病性分析结果。图21胁迫处理对拟南芥相关抗性基因表达量影响图22干旱对植株含水量的影响。图23高盐对植株含水量的影响。图24干旱对丙二醛含量的影响。图25高盐对丙二醛含量的影响。图26干早对叶片可溶性糖含量的影响。图27高盐对叶片可溶性糖含量的影响。图28干旱对叶片脯氨酸含量的影响。图29高盐对叶片脯氨酸含量的影响。具体实施例方式以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒产品说明书进行操作。实施例l铃铛剌ERF转录因子(/ftSF2)基因的分离、克隆1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料培养及胁迫处理铃铛刺(/feh'ffloctendro/7haJoctenciron)种子采集于新疆塔里木河流域。用250mM的NaCl将水培4周的铃铛刺幼苗进行浸根处理3h、6h，采集叶片立即用液氮处理，保存于-8(TC超低温冰箱中备用。材料的不同胁迫处理分别用250mM的NaCl、20%PEG6000、100nM的ABA溶液、100uM的GA3溶液、100uM的BA溶液、100uM的NAA溶液对水培4周的铃铛刺幼苗进行浸根胁迫处理，以及置于4'C培养箱中进行低温处理，分别在处理0、1、3、6、12和24小时取材；分别用100ixM的SA溶液、100yMMeJA溶液对水培4周的铃铛刺幼苗进行浸根胁迫处理，分别在处理0、12、24、48、72小时取材，将处理后的材料迅速用液氮冷冻，于-80°C超低温冰箱中保存备用。1.1.2菌株与质粒'大肠杆菌(foc/3eriohiacoh'):DH5本室保存pMD19-T克隆载体购自TaKaRa生物公司1.1.3酶与试剂TRIzol总RNA提取试剂购自北京康润诚业生物科技有限公司；S叩erScript111111ReverseTranscriptase及GeneRacerkit购自Invitrogen公司；限制性内切酶、Taq酶等常用酶类购自宝生物公司;EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均购自北京全式金生物技术有限公司。1.1.4溶液1.TE(pH8.0):10mmol/LTris-HC1;lmmol/LEDTA(pH8.0)2.50XTAE(1L):Tris242.0g;冰醋酸57ml;0.5mMEDTA100ml(pH8.0)3.1MTris-HCl(pH8.0，500ml):Tris60.6g;水400ml;浓HC121.0ml1.1.5培养基1.1.5.1LB液体培养基(1L,pH7.4):蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g1.1.5.2LB固体培养基(1L,pH7.4):蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g,NaCl10.0g，琼脂粉15.0g1.1.5.3B5培养基(1L，pH5.8)1.B5液体培养基(1L):贮备液I50ml贮备液II5ml贮备液m5mlje备液IV5mlCa盐50ml铁盐5ml2.贮存液I(1L)NH巢33000mgKN0338000mgMgS047H207400mgKH2P043400mg3.贮存液II(IL)KI166mg貼031240mgMnS044H204460mgZnS047H201720mgNa2Mn042H2050mgCuS045H205mgCoCl26H205mg4.贮存液III(1L)FeS047H20Na2-EDTA2H205.贮存液IV(IL)肌醇烟酸VB6VB!甘氨酸6.转盐(IL)7460mg20000mg100mg100mg100mg400mgCaCl22H208800mg1.2实验方法1.2.1铃铛刺总RNA的提取(TRIzol法)按照TRIzol法提取铃铛刺总RNA;1.2.2第一链cDNA的合成(按Invitrogen公司反转录试剂盒说明书进行)1.预变性以铃铛刺总RNA为模板，以01igo-dT为引物(工作浓度为lOpmol/ul)反应体系如表l，混匀后，65。C变性5rain，立即置于冰上卜2min;_表1RNA预变性体系_成分总RNA-Oligo-dTPrimer(lOpmol/ii1)dNTPs(10mMeach)DEPCftO总计lOng-1ygl.Oull.Ou1X13u12.反转录向上述离心管中加入表2中所列成分后混匀，42°Clh;70。C下15min灭活反转录酶；表2反转录体系成分5X缓冲液DTT(O.1M)RNaseOUT(10mMeach)ReverseTranscriptase(20011/ii1)总计4u1l.Oyll.Ou1l.On17ul3.RNaseH消化向反应液中加入1u1(2U/u1)的RNaseH，37。C20min，消化与cDNA结合的单链RNA,-2(TC冰箱保存反转录产物。1.2.3ERF转录因子家族基因同源片段的克隆1.2.3.1引物的设计与合成利用DNAMAN软件对GENBANK中已公布的相关科属植物S^类基因的氨基酸和核苷酸序列进行同源分析，然后，根据^F基因DNA结合域保守区设计合成一对简并引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成(表3)。_表3简并PCR中使用的引物_引物编号引物序列SP15'-C(A/C)(G/A)(A/T/C)GG(A/C/G)ATMGGATG(A/C)GGMGTC-3，ASP25'-(G/A)(T/C)(T/C)TGGAG(C/A)GCGTCGACT-3'QT_5'-GCTGTCMCGATACGCTACGTMCGGCATGACAGTG(T)24-3'_1.2.3.2RT-PCR根据植物中朋F2基因DNA结合域保守区设计的一对简并引物SP1和ASP2，以用250mMNaCl处理3h和6h的叶片为材料提取总RNA进行RT-PCR，PCR条件为94°C5min;94。C30sec,50°C30sec,72°C30sec,30个循环；72°C10min。反应结束后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。1.2.3.3PCR产物的回收采用北京全式金生物技术有限公司的EasypurePCRPurificationkit回收目的片段，按照试剂盒说明书的方法进行操作。'1.2.3.4目的片段与克隆载体的连接将回收的PCR产物连接至pMD19-T载体上，连接反应体系如表4，16'C连接过夜。表4连接反应体系成分用量回收的PCR产物(200-300ng/u1)4ti1pMD19-T载体(50ng/n1)l.On1LigationMix5.On1总计10u11.2.3.5大肠杆菌感受态的制备参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。1.2.3.6大肠杆菌的转化(热激法)参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。1.2.3.7菌落PCR鉴定以含有Amp的LB平板上挑取的白色单菌落，转入lmlLB(Amp+)液体培养基中，37°C，200rpm摇菌2h,分别吸取1U1菌液作为模板，进行菌落PCR鉴定，引物为SP1和ASP2，扩增条件为94°C5min;94°C30sec，50。C30sec，72°C30sec，30个循环;72°C10min。反应结束后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。1.2.3.8重组质粒的核苷酸序列测定将菌落PCR阳性的菌落转入含Amp的LB液体培养基，37。C下200rpm过夜培养，制备成甘油菌，送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序。1.2.4铃铛刺0F基因的3'cDNA的克隆1.2.4.1引物的设计与合成根据已获得的SF基因的同源片段，设计1对3'RACE的巢式基因特异引物，见表5。_表53'RACE反应中使用的引物_引物编号引物序列3HEGSP15'-CTCTCCGCCAACAGAGCACATCT-3'-3HEGSP25'-ATCAGACTAGCTCCCAGGACAGC-3'QT5'-GCTGTCMCGATACGCTACGTMCGGCATGACAGTG(T)24-3'Ql5'-GCTGTCMCGATACGCTACGTAACG-3'__5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'_1.2.4.2铃铛刺总RNA的提取以铃铛刺叶片为材料采用TRIzol法提取总RNA。1.2.4.3第一链cDNA的合成方法同1.2.2。1.2.4.4巢式PCR扩增3'-端cDNA1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，用基因特异引物3HEGSP1与通用引物Q1进行第一轮PCR，反应参数94°C5min;94°C45sec，60°C45sec,72°Clmin，30个循环；72°C10min;4。C保存。2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，用基因特异引物3HEGSP2与通用引物Q2进行第二轮巢式PCR，反应参数94°C5min;94°C45sec，63°C45sec,72。Clmin，30个循环；72°C10min;4。C保存。3.0.8。/。的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5ot，利用a互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放13实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.5巢式PCR扩增5'端cDNA1.2.5.1引物的设计与合成根据己获得的3'-端cDNA序列设计1对巢式基因特异引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成，见表6。_表65'RACE反应中使用的引物_引物编号引物序列5HEGSP15'-GTTGAAAGTTCCGAGCCAGACACGA-3'5HEGSP25'-GAGCCAGACACGMCACCCTTG-3'GeneRacer5'pri匿5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'GeneRacer5'Nestedprimer5'-GGACACTGACATGGACTGMGGAGTA-3'1.2.5.2第一链cDNA的合成(按照Invitrogen公司GeneRacerkit试剂盒说明进行)1.去磷酸在PCR管中加入表7所列成分混匀，离心，5CTC条件下处理lh后，离心，置于冰上l-2min。_表7去磷酸化反应体系_成分总RNA(l-5吗)10XCIP缓冲液RNaseOut(40U/nl)ClP(丽4d)总计7[ill単i.owl単lOpl2.RNA纯化参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。3.去帽在PCR管中加入表8所列成分混匀，瞬间离心，37。C条件下处理lh后，瞬间离心，置于冰上l-2min。'表8去帽反应体系成分用量去磷酸化的RNAIOXTAP缓冲液1.0^1RNaseOut(40U/nl)l単TAP(0.5U/nl)l単总计10|ol4.RNA纯化5.RNA接头序列的连接1)将经去磷酸化和去帽处理的RNA转入另一PCR管中，加入RNA接头片段，轻轻混匀，离心；2)65°C,5min，冰浴2min，离心；3)在PCR管中加入表9所列成分混匀，离心，37'C条件下处理lhr后，离心，置于冰上l-2min。表9RNA片段连接反应体系成分用量去磷酸化和去帽的RNA和RNAOligo7.On110XLigase缓冲液l.Oy1RNaseOut(40U,/u1)1.OulATP(10腸1/L)l,Ou1TAP(O.5U/u1)l.Oy1总计llu16.RNA纯化7.反转录—方法同1.2.2。1.2.5.3巢式PCR扩增5'端cDNA1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，分别用基因特异引物5HEGSP1与GeneRacer5'primer进行第一轮PCR，反应参数94°C5min;94°C30sec，60°C30sec,72。Clmin,30个循环；72°C10min;4"C保存。2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，用基因特异引物5HEGSP2与GeneRacer5，Nestedprimer进行第二轮巢式PCR，反应参数94°C5min;94°C30sec,62°C30sec，72°Clmin，30个循环;72°C10min;4。C保存。3.0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5oc，利用a互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.6E/F基因cDNA全长扩增1.2.6.1引物的设计与合成拼接已知的3'-端和5'-端cDNA序列，获得cDNA全长序列，据此，设计基因特异引物，扩增S^基因的cDNA全长序列，所用引物见表IO。1.2.6.2第一链cDNA的合成方法同1.2.2。15表IOcDNA全长序列扩增所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>1.2.6.3SF基因cDNA全长序列的克隆及生物信息学分析1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，利用基因特异引物HERF1与HERF2配对，进行PCR扩增，反应参数94°C5min;94°C30sec,60。C30sec，72°C2min,30个循环；72°C10min。2.0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5oc，利用oc互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。3.利用DNAMAN软件进行序列比对和分析；利用SMART(http:〃coot.embl-heidelberg,de/SMART/)分析油EiK2基因的结构域；利用CPHmodels-2.0服务器分析预测HhERF2蛋白的三维空间结构(http://genome,cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0Server-3D.htm);利用ScanProsite服务器(111^口//丽界.expasy.org/cgi—bin/prosite)分析ZftSF2基因的结构功能位点。1.2.7DNA序列的扩增及分析1.2.7.1引物的设计与合成同表10。1.2.7.2铃铛刺基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法提取铃铛刺基因组DNA。.1.2.7.3PCR扩增以铃铛刺基因组DNA为模板，以基因特异引物HERF1与HERF2进行PCR扩增，反应参数分别为94°C5min;94°C30sec，60°C30sec，72°Clmin,30个循环;72°C10min;0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5oc，利用oc互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.8HF基因的组织特异性表达1.2.8.1总RNA提取分别提取水培铃铛刺幼苗的根、茎、叶的总RNA，提取方法为TP、lzol法。I.2.8.2引物的设计与合成利用DNAMAN软件对GENBANK中已公布的豆科植物肌动蛋白基因的保守区进行同源性分析，以大豆Actin(U60506)为内标基因，设计肌动蛋白基因特异引物Actin-F和Actin-R;根据已得到的朋F基因cDNA序列，在基因的非保守区设计基因特异引物，所用引物见表II。表11SF基因组织特异性表达分析所使用的引物引物编号引物序列HE-RT(F)5'-CGCTACTTCC嵐CAGTCACC_3'HE-RT(R)5'-GCTGAGGCAACGCTTCTTAG--3'Actin-F5'-CMCCTTAATCTTCATGCTG--3'Actin_R5'-AGCMCTGGGATGACATGGAG-3'1.2.9ERF基因在不同胁迫条件下的表达谱分析1.2.9.1引物的设计与合成同1.2.8.2。1.2.9.2ERF转录因子基因对不同激素条件胁迫的应答将水培4周的铃铛刺幼苗分别插入含有100uM的生长素萘乙酸(NAA)溶液、lOOuM的细胞分裂素6—苄基氨基嘌呤(BA)溶液、lOOuM的赤霉素(GA3)溶液以及100uM的脱落酸(ABA)溶液中进行不同激素胁迫处理；分别提取处理0、1、3、6、12和24小时的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以肌动蛋白基因为内标基因，利用基因的特异引物HE-RT(F)和HE-RT(R)进行RT-PCR扩增，Actin扩增参数94°C5min;94°C30sec，60°C30sec,72°C45sec，28个循环；72°ClOmin;基因非特异片段扩增参数94°C5min;94°C30sec，58°C30sec，72°C30see,28个循环；72°ClOmin;检测/ftSF2基因的表达量变化。1.2.9.3ERF转录因子基因对干旱、高盐及低温胁迫条件的应答将水培4周的铃铛刺幼苗分别插入含有250mM的NaCl溶液、20%PEG6000溶液以及置于4'C培养箱中进行高盐、干旱以及低温胁迫处理。分别提取处理0、1、3、6、12和24小时的叶片总RNA,反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以肌动蛋白基因为内标基因，利用基因特异引物HE-RT(F)和HE-RT(F)进行RT-PCR扩增，反应参数同1.2.9.2;检测池SF2基因的表达量变化。1.2.9.4ERF转录因子基因对不同激素条件模拟病害胁迫的应答将水培4周的铃铛刺幼苗分别插入含有100iiM水杨酸(SA)、100pM的茉莉酸甲酯(MeJA)溶液进行不同的胁迫处理；分别提取处理0、12、24、48、和72小时的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以肌动蛋白基因为内标基因，利用基因特异引物HE-RT(F)和HE-RT(R)进行RT-PCR扩增，反应参数同1.2.9.2,检测他朋F2基因的表达量变化。2实验结果与分析2.1SF基因同源片段的获得对己报道的ERF蛋白序列进行了同源比对分析，发现ERF蛋白的DNA结合域的氨基酸序列在不同植物、不同ERF家族中都呈现出高度保守的特性，因此利用该保守区域进行了简并引物的设计，以叶片总RNA反转录获得的cDNA为模板，通过简并PCR扩增出约280bp的目标带(图1)，与预期大小一致。将回收的PCR产物连接至pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5oc，利用oc互补及菌落PCR筛选出6个阳性克隆，测序后得到1条282bp的序列。序列检索结果显示，与大豆、陆地棉及拟南芥的SF基因核苷酸序列具有较高的一致性，初步判断该片段为铃铛刺fiF基因保守区。2.2iiF基因cDNA3'序列和5'序列的获得经序列比对，利用已获得的SF基因同源片段，设计基因特异引物；利用基因特异引物3HEGSP1和3HEGSP2分别与3，通用引物Ql、Q2进行3'RACE扩增，电泳检测，得到1条约300bp扩增产物(图2)，测序结果表明，该片段为276bp,且5'端序列分别有52bp与原同源片段部分重叠，判断为目标^F基因的3'端序列。利用特异引物5HEGSP1和5HEGSP2分别与GeneRacer5'Primer和5'NestedPrimer进行5'RACE扩增，电泳检测得到l条约400bp的扩增产物(图3)，测序结果表明，该片段为416bp，且3'端序列有67bp与原同源片段部分重叠，判断为目标HF基因的5'端序列。2.3SF基因cDNA全长序列的获得利用基因全长特异引物HERF1和HERF2分别与3'通用引物Q1、Q2，巢式PCR获得1条约800bp扩增产物条带(图4)。测序结果表明，其全长序列为855bp，序列比对结果显示，与多种植物KF家族的基因有较高相似性，推断为新的HF基因，命名为他KF2(GenebankAccessionnumber:FJ032362)。2.4铃铛刺cDNA全长序列分析2.4.10F基因的序列特征分析及编码蛋白的结构功能预测利用DNAMAN软件对油朋F2基因的全长cDNA序列进行分析，结果表明他朋F2基因序列全长为855bp，完整开放阅读框738bp，编码245个氨基酸。该蛋白含有一个典型的AP2/EREBP结构域，该结构域由58个氨基酸组成，其中第14位为保守的丙氨酸，而第19位为天冬氨酸，属于ERF基因家族，并且发现在其序列中存在一个丝氨酸富集区和一个谷氨酰胺富集区，推测这段区域可能通过磷酸化和去磷酸化的作用调控该蛋白的活性，具有一定的转录激活功能，经PSORT分析预测该蛋白定位于细胞核，判断为典型的ERF转录因子。2.4.2ERF蛋白的三维空间结构预测利用CHPmodels-2.00ittp:〃genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0server)服务器来预测ERF2蛋白的三维空间结构(图5)，结果显示ERF2蛋白的空间结构中具有1个a-螺旋，3个(3-折叠组成，这是一个典型的ERF转录因子所具有的空间结构，这从蛋白所具有的空间结构的角度证明了该基因所编码的蛋白可能是ERF类转录因子。2.4.3HhERF2蛋白与其它ERF2类蛋白的同源性比对及系统进化树分析植物中的ERF类基因可以分为四大类，Tournier等(2003)根据氨基酸序列的同源性和结构特征，将ERFs分成四个class。分析表明ERFclassIV具有典型的特征，即在5'端有一个高度保守的未知功能的氨基酸基序(MCGGAII/L)。ERFclassIV还包括其它的成员，例如Arabidopsis的AtEBP、Ly卿e:rsi，escuJe自ffl的LeERF2禾卩JERF1、0.satira的OsEREBPl、OsEBP-89和Capsic咖anntrnffl的CaERFLPl。通过DNAMAN软件对铃铛刺朋SK2基因与其它已经克隆的SF基因进行系统进化树分析，结果表明///^/F2属于ERFclassIV亚家族，主要与Sf2类转录因子聚在一起，并且与双子叶植物的Sf2类转录因子的亲缘关系更近。因此，将克隆到的ERF转录因子基因朋SF2与植物中的ERF2类转录因子进行同源性比对分析。序列比对结果(见图6)显示该转录因子基因全序列在蛋白水平上与其它植物ERF2类蛋白的同源性不高，一致性约为27.28%，仅在AP2/EREBP结合域中有高度保守性。并且发现^F类转录因子第14位的丙氨酸(A14)和第19位的天冬基酸(D19)非常保守。进一步证明在ERF相关蛋白中决定DNA结合特异性方面，A14与D19都具有非常重要的作用。2.5铃铛刺ffl朋/^基因的基因组DNA结构分析以铃铛刺基因组cDNA和DNA为模板，以HERF1和HERF2为引物进行PCR扩增，分别为约800bp与约2000bp的扩增产物；经回收测序表明，这2个条带均为811bp、1992bp。测序结果分析显示，该基因含有一个1137bp的内含子(图7)。2.6SF基因的组织特异性表达分析分别提取铃铛刺的根、茎、叶的总RNA，提取方法同1.2.1。利用半定量RT-PCR对池fiiF219基因在不同组织中的表达情况进行了检测，结果该基因在根、茎、叶中表达量几乎相同，由此可见该基因的表达无明显的组织特异性(图8)。2.7SF基因在不同胁迫条件下的表达模式分析对他S/^基因在不同胁迫条件下进行表达模式分析(图9)，结果显示他SF2对高盐、干旱和低温均有应答。用250mMNaCl高盐溶液处理后在3小与6小时ZftSF2基因均有较高的表达量，随后又逐渐减弱；模拟干旱处理lh/ftSF2基因开始表达，6h后表达量达到最高，随后逐渐减弱；由实验结果可以明显看出，该基因对低温也具有应答反应，并且低温处理6h时达到峰值，而用激素处理时发现，NAA、GA3、SA和BA对他fiF2基因的表达无明显影响，此基因对外源ABA无明显应答反应，但是MeJA的处理后该基因在12小时表达量已有明显增加，在24小达到最高；综上所述，他EiF2基因能被高盐、干旱和低温所诱导表达，并且这种诱导作用并不依赖于ABA信号调节途径，同时该基因可能还参与了茉莉酸甲酯调控的病程相关基因的信号传导过程。利用生物信息学软件对拙SF2基因进行分析，发现HhERF2蛋白含有一个典型的AP2/EREBP结构域，该结构域由58个氨基酸组成，其中第14位为保守的丙氨酸，而第19位为天冬氨酸，属于ERF基因家族,此区域能与两个顺式作用元件GCC-box特异结合，而绝大多数PR基因的启动子区都含有非常保守的核心序列AGCCGCC，另一个是DRE/CRT基序，该基序与干旱、低温等非生物胁迫诱导的基因表达有关。研究表明，在ERF转录因子的C-端一般存在一个转录激活域，它们以富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸或丝氨酸和苏氨酸为特征，此结构域是激活目标基因转录所必须的。在/ftSF2转录因子基因C-端具有明显的转录激活域，推测该转录因子蛋白应该具有转录激活功能，其生物学功能有待进一步深入研究。同时推测HhERF2蛋白中的丝氨酸富集区可能通过位点的磷酸化作用分别调控蛋白的DNA结合域对DRE元件或GCC-box的结合能力和酸性激活域的转录激活能力。试验例1铃铛刺他朋F2基因植物高效表达载体的构建及在拟南芥中的相关功能验证2材料与方法2.1材料2.1植物材料拟南芥哥伦比亚生态型(Columia-0)，由中国农业科学院生物技术研究所梁华老师赠送。2.1.2菌种及载体大肠杆菌(focheric/n'acoh')DH5a，由本实验室保存；农杆菌G4grobacteriuffltufflefaciens)菌株C58C1，由中国农业科学院作物科学研究所马有志研究员赠送；双子叶植物表达载体pCAMBIA-1302(说明pCAMBIA1302为实验室常用植物表达载体，在NCBI上可以査到其全序列及其说明)由中国科学院植物研究所沈世华研究员赠送。pMD19-T克隆载体，购自TaKaRa。2.1.3试剂盒EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均购自北京全式金生物技术有限公司；SUPERSCRIPTIIlReverseTranscriptase购自Invitrogen公司。2.1.4培养基1.YEB培养基:参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；2.LB细菌培养基参照《分子克隆实验指南》(第三版)丄萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；3.MS培养基:参见实用植物组织培养技术教程(甘肃科学技术出版社)曹孜义主编所列的具体方法；4.MS选择培养基MS基本培养基中加入潮霉素(30mg/L)2.2实验方法2.2.1引物设计与合成设计合成含有酶切位点feiII和￡st￡II的引物pC1302-HhERF2(F)和pC1302-HhERF2(R)，序列见表12。表12构建植物表达载体所用引物引物编号引物序列PC1302-HhERF2(F)5'-嵐GATCTACCATGTGTGGAGGCG-3'pC1302-HhERF2(R)5'_GGGTGACCCTAGT嵐CCMGCGAC-3'2.2.2植物表达载体的构建2.2.2.1植物高效表达载体pC1302-HhERF2的构建利用引物pC1302-HhERF2(F)和pC1302-HhERF2(R)从连接有池欣K2cDNA全长的pMD19-T载体上扩增出完整的开放阅读框。扩增产物和pCAMBIA-1302载体均经相应的酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶连接得到植物高效表达载体pC1302-HhERF2。2.2.2.2重组质粒转化大肠杆菌DH5ot及菌落PCR鉴定参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；2.2.2.3重组质粒的小量提取及酶切鉴定质粒提取参照北京全式金生物技术有限公司EasyPureMiniPlasmidPurificationKit所列的具体方法；酶切鉴定参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法。2.2.3拟南芥的遗传转化2.2.3.1农杆菌C58C1电击感受态细胞的制备2.2.3.2电击转化2.2.3.3含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定挑取LB平板上的单菌落，接种于5mlLB液体培养基(含50mg/LKan，50mg/LRif，50mg/LGent)中，28'C培养l-2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR鉴定。2.2.3.4拟南芥的培养1.种子处理取适量种子于1.5ml离心管中用70。/。的乙醇洗3min，无菌水洗3次，0.5%次氯酸钠(NaClO)洗10min，无菌水洗3次，均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用Vortex充分混匀；2.播种后MS平板于4'C春化3天；3.将MS平板放置于22光照培养箱培养；4.待小苗长出四片真叶后移栽至用MS液体培养基浇灌过蛭石中生长，保湿2-3—天；2.2.3.5Floral-dip法转化拟南芥植株1.挑鉴定过的农杆菌单菌落，接种于5mlLB液体培养基中28。C、250rpm培养24h;2.按1:50转接，28°C、250rpm继续培养至0D二1.53.0;3.室温离心，5000rpm、15min;4.用悬浮液悬浮菌体，180rpm慢慢将菌体摇匀；5.将已经交足水开花的拟南芥倒置，使花蕾朝下侵染液中42s;6.取出转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光照强度下生长24h后置于正常光照条件下直立生长培养；附悬浮液(灭菌蒸馏水，10函gCl"5%蔗糖，0.3%Silwelt-77)。222.2.4转基因拟南芥的筛选2.2.4.1Hyg抗性苗的筛选将To代收获的种子消毒(参考本实例2.2.3.4)，均匀撒播于含有Hyg抗性的MS平板上进行抗性筛选。2.2.4.2转基因拟南芥的DNA水平鉴定利用CTAB法小量提取在含有Hyg培养基中生长的拟南芥总DNA，通过PCR检测进一步筛选阳性拟南芥植株。若扩增出了目标片段，而阴性对照中没有扩增出片段，即初步证明目的基因整合到拟南芥基因组中。2.2.4.3转基因拟南芥的RT-PCR检测选择PCR确定的阳性转化株，剪取叶片，TRIzol提取总RNA,反转录获得cDNA作为模板，RT-PCR检测筛选阳性转化苗。方法参照实例1中的1.2.6.1-1.2.6.1,PCR反应参数94°C5min;94°C30sec，60°C30sec,72°C2min,30个循环；72°C10min;0.8%的琼脂糖凝胶电泳。。2.2.5转基因拟南芥的耐胁迫分析2.2.5.1转基因拟南芥的非生物胁迫抗性鉴定用生长2周左右的的拟南芥植株进行非生物胁迫抗性鉴定，设三个重复1.耐旱鉴定将野生型植株与转基因型植株置于22°C光照培养箱中，控水处理4周；分别在0d、7d、14d取样，液氮处理后，置于-8(TC保存；待处理4周之后，复水观察其生长状况。2.耐盐鉴定将250mM的NaCl溶液浇于栽有野生型和转基因型拟南芥的盆中，22°C光照培养箱中处理4周；分别在0d、7d、14d取样，用液氮处理后，置于-80'C保存；待处理4周后复水观察植株的生长情况。3.耐低温鉴定把转基因植株与野生型植株置于-6'C处理12h，转到4'C适应2h后，转移到正常的生长条件下继续培养2周，观察植株的生长情况。4.抗病性鉴定细菌培养假单胞菌(Psueobinnoassyri/Jgae)，离心收集菌体，用lOmMMgCl2重悬，稀释浓度至106colnOy/ml,用悬浮液侵染拟南芥6min，观察拟南芥植株发病情况，具体方法可参见有关文献(ChakravarthyS.,etal,ThetomatotarnscriptionfactorPti4reuglatesdefensed-relatedgeneexperssionviaGCCboxandnonGCC-boxciselements.PlnatCell15:3033-3050.2003.)2.2.5.2转基因拟南芥胁迫相关基因的RT-PCR分析以拟南芥Actin(Accessionnumber:AF494804)为内标基因检测拟南芥胁迫相关基因23表达量变化清况。根据已发表的拟南芥中胁迫相关基因的序列，分别设计拟南芥corl5a(Accessionnumber:1101377)、rd29A(Accessionnumber:NM—124610)、kinl(Accessionnumber:NM—121601)、PDF1.2(Accessionnumber:NM—123809)、PR3(Accessionnumber:NM一112085)等胁迫相关基因的特异引物，见表13。表13转基因拟南芥中胁迫相关基因表达分析所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>选取经过抗性筛选、DNA水平及RNA水平检测为阳性且分别经干旱、MeJA胁迫处理0d、2d、4d、6d、8d的转基因拟南芥植株叶片，TRIzol提取总RNA，反转录获得cDNA作为模板，分别使用表13中配对引物半定量RT-PCR检测胁迫相关基因的表达量变化，反应参数为94°C5min;94°C30sec，53°C30sec,72°C30sec，28个循环；72°C10min;做3个重复。2.2.6转基因拟南芥在干旱和高盐胁迫条件下的生理生化指标测定2.2.6.1胁迫处理后植株含水量的测定胁迫处理完毕后，收取整株植株，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分。每个处理取6棵单株，并迅速测其鲜重，之后放入12(TC烘箱中烘烤30min，80°C烘烤48h至恒重，称量其干重。对上述测得的干、鲜重，采用公式组织含水量(占鲜重％)=(鲜重-干重)/鲜重进行含水量的计算。2.2.6.2丙二醛(MDA)及可溶性糖的测定丙二醛的提取称取经逆境胁迫处理的植株叶片0.5g，加入少量石英砂和10%三氯乙酸4mL，研磨至匀浆，然后以4000rpm离心10min，其上清液即为丙二醛提取液，每个处理取6棵单株。2显色反应及测定取若干干净试管并编号，各加入1mL的提取液，对照加lmL蒸馏水；然后再加入2mL0.6%硫代巴比妥酸溶液；摇匀，将混合液在沸水浴中反应15rnin，迅速冷却后低速离心；然后取上清液分别在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值。可溶性糖及MDA含量的计算C(糖)=11.71*A柳(咖ol/L)C(MDA)=6.45*(A532_A600)—0.56*A450(nmol/L)公式中A顿一在450nm波长下测得的吸光度值A532—在532nm波长下测得的吸光度值A60。一在600nm波长下测得的吸光度值C糖、C(MDA)分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。2.2.6.3转基因植株脯氨酸含量分析脯氨酸的提取用液氮迅速研磨经不同处理的待测植株叶片，并转移至大试管中快速称重约0.3g(差量法)，然后向各管分别加入5mL3%的磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，在沸水浴中提取10min，提取过程中要经常摇动，冷却后低速离心，上清即为脯氨酸提取液，将上清转移至干净的试管中待测。脯氨酸含量的测定采用日立835-0200氨基酸自动分析仪对脯氨酸含量进行分析3实验结果与分析3.1植物表达载体的构建3.1.1表达载体pC1302-HhERF2的构建利用引物pC1302-HhERF2(F)、pC1302-HhERF2(R)从连接有基因全长的pMD19-T载体上扩增出其的全长。扩增产物pCAMBIA-1302空载体均经相应的酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶将/ffiSF2连接至pCAMBIA-1302相应的酶切位点，构建植物表达载体pC1302-HhERF2。构建过程见图10。3.1.2重组质粒的菌落PCR鉴定在重组质粒的转化LB(Kan+)平板上，分别挑取三个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果均为阳性，见图ll。3.1.3重组质粒的酶切鉴定将PCR检测的阳性菌落转入LB(Kan+)液体培养基，37。C摇菌过夜，EasyPureMiniPlasmidPurificationKit试剂盒小量提取重组质粒，进行酶切鉴定。pC1302-HhERF2重组质粒被切出目标带，酶切结果正确，见图12。3.2含有表达载体的农杆菌PCR检测将重组质粒pC1302-HhERF2转化农杆菌C58Cl，以转化后的农杆菌的菌液作模板，未转化的农杆菌作阴性对照，质粒做阳性对照，进行菌落PCR鉴定。检测结果表明，该重组质粒已成功转入农杆菌中，见图13。3.3转基因拟南芥的筛选与鉴定3.3.1Hyg抗性苗的筛选采用Floral-dip法转化拟南芥，收集转基因当代植株的种子(L代)，在Hyg-MS培养基上筛选(如图14)。野生型植株为黄化苗，不能正常生长，转基因植株在Hyg-MS培养基上能正常生长。播种后十三天将绿苗转入蛭石草炭土=3:1的培养土中继续培养。3.3.2转基因拟南芥的DNA水平鉴定选取正常生长Hyg抗性苗，剪取其叶片，采用CTAB法提取其DNA，以拟南芥DNA为模板，以构建植物表达载体时设计的pC1302-HhERF2(F)和pC1302-HhERF2(R)引物为引物，釆用PCR技术，对Hyg抗性苗进行DNA水平的检测。结果表明，检测pC1302-HhERF2转化的Hyg抗性苗22株，18株为阳性，阳性率81.8%，部分植株PCR检测见图15，证明他SF2已经整合到拟南芥基因组中。3.&3转基因拟南芥的RT-PCR检测分别选取DNA水平鉴定的18株阳性拟南芥植株叶片为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果表明，18株pC13rd29A-HhDREB2转化的拟南芥植株叶片中，15株检测为阳性，阳性率83.3%，部分植株RT-PCR检测见图16。3.4转基因拟南芥的耐胁迫分析3.4.1转基因拟南芥的胁迫抗性鉴定耐旱性分析结果转基因植株和野生型植株在正常生长条件下培养，但不浇水，4周后，发现野生型植株全部死亡，而他SF2转基因植株有72呢存活，复水后继续生长，并正常结实，见图17。耐盐性分析结果转基因植株和野生型植株用250mM的NaCl溶液处理，4周后野生型植株全部死亡，统计结果表明/ftHF2转基因植株，仍有42%存活下来，转移至生长条件下仍能生长，见图18。耐低温分析结果转基因植株和野生型植株在-6r处理12h，发现野生型植株的叶片多数冻伤萎蔫，而转基因植株大多数仍然正常。转到4'C适应2h后，再转移到正常生长条件下培养，2周后统计成活率，野生型植株仍有部分存活下来，然而表型出现生长缓慢，植株矮小；而朋朋F2转基因植株有,37y。存活下来，并有部分植株正常开花结实，见图19。抗病性分析结果用假单胞菌(PsuedoM7oasS3^i/igae)悬浮液侵染拟南芥，结果表明转HhERF2基因的拟南芥植株抗病性明显增强，统计植株的孢子数，在假单胞菌侵染拟南芥7-10天左右抱子数量最多，发病最重，此后孢子数量逐渐减少，20天后发病植株逐渐恢复正常生长，病症减轻，见图20。3.4.2转基因拟南芥胁迫相关基因的RT-PCR分析以拟南芥Actin基因(Acessionnumber:AF494804)为内标引物，半定量RT-PCR检测拟南芥胁迫相关基因coW5a、r必ft4、AiW、2、Pi3的表达量变化。结果(图21)显示corJfe、rd29丄Ai/L三个基因在干旱处理的随后4天内其表达量均有增加但不显著，但第六天时增加比较显著，可能是随处理时间的延长胁迫增强，HhERF2调控了上述三个基因的表达，以此来增强转基因植株抗非生物胁迫的能力。用MeJA喷洒转基因拟南芥植株，随着处理时间增加，已证实的抗病相关基因PDF1.2与PR3的转录表达均增强，以增加转基因植株的抗病性。该实验结果从转录水平解释了转基因拟南芥耐胁迫性增加的原因。3.5转基因拟南芥在逆境条件下的生理生化指标测定3.5.1胁迫处理对植株含水量的影响、/表14转基因植株与对照干旱胁迫下植株含水量差异o天7天14天野生型植株含水量平均值92.5%87.6%82.3%转基因植株含水量平均值92.3%90.5%86.8%表15转基因植株与对照高盐胁迫下植株含水量差异o天7天14天野生型植株含水量平均值92.5%89.4%88.2%转基因植株含水量平均值92.4%90.7%89.8%已有研究表明，干旱和高盐逆境都可造成植物体的渗透胁迫，导致细胞失水，严重的可造成细胞膨压丧失，导致死亡。本实例通过测定胁迫条件下野生型与转基因型植株含水量的变化，从而在个体水平上获得转基因植株较野生型植株抗逆性有显著提高的直接证据。结果显示，干旱(表14、图22)和高盐(表15、图23)处理后野生型和转基因植株27的含水量都呈下降趋势。在胁迫处理前，转基因植株的含水量与野生型植株的含水量没有明显差异；当胁迫处理达到7d和14d时，转基因型植株的叶片含水量明显高于野生型植株的叶片含水量。这表明插入的外源基因/ft^F2,对干旱和高盐胁迫下的细胞失水有了一定的缓解作用，从而提高了转基因拟南芥在胁迫条件下的耐逆性。3.5.2胁迫处理对植株MDA含量的影响表16转基因植株与对照干旱胁迫下植株MDA含量的差异单位^mol/g0天7天14天野生型植株MDA含量平均值0.0130.0210.022转基因植株MDA含量平均值0.0140.0160.018表17转基因植株与对照高盐胁迫下植株MDA含量的差异单位umol/gu乂、<乂^乂乂野生型植株MDA含量平均值0.0150.0230.038转基因植株MDA含量平均值0.0150.0220.021植物器官衰老或遭受逆境胁迫伤害时，往往会发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终分解产物，它的含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。表16、图24结果显示，随着干旱处理时间的增加，转基因和野生型植株的MDA含量都呈上升趋势，这表明干旱胁迫对转基因和野生型植株均造成了一定程虔的伤害。但随着胁迫处理时间的增加，野生型植株MDA含量增加更为显著。其中干旱胁迫处理14d后，野生型植株的MDA含量比没有经过干旱处理的植株增加69.2%，而转基因型植株的MDA含量仅增加28.5%。T-test统计分析结果表明，干旱处理下转基因型植株的MDA含量显著低于野生型植株的MDA含量(p〈0.05)。从表17、图25可以看出，盐胁迫处理可以极显著提高野生型植株的MDA含量(p<0.01)。转基因型植株经7d盐胁迫处理后，MDA含量有所提高，但14d盐胁迫处理的植株的MDA含量反而要低于7d胁迫处理下植株的MDA含量。这可能是由于ERF转录因子的下游与盐胁迫以及抗氧化有关的信号分子产生了应答，从而降低了MDA含量。野生型和转基因型植株的MDA含量分析结果表明，ZftHF2转录因子在逆境胁迫下能够降低脂膜过氧化作用从而保证细胞内脂膜的完整性。这可能是由于fflSF2下游信号与过氧化自由基抗性分子(如谷胱甘肽，过氧化氢酶，过氧化物酶等)相偶联，从而保护了细胞膜。3.5.3胁迫处理后植株可溶性糖含量的变化表18转基因植株与对照高盐胁迫下植株可溶性糖含量的差异单位mol/g0天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0800.1170.141转基因植株可溶性糖含量平均值0.0750.1240.162表19转基因植株与对照高盐胁迫下植株对溶性糖含量的差异单位mmol/go天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0800.0850.123转基因植株可溶性糖含量平均值0.0760.1030.132在胁迫的环境中，植物为了减缓由胁迫造成的生理代谢不平衡，细胞内大量积累一些小分子有机化合物。可溶性糖便是胁迫诱导的小分子溶质之一，通过渗透调节来降低水势，维持较高的渗透压，保证细胞的正常生理功能。从表18、图26和表19、图27可以看出，干旱胁迫和盐胁迫都能够使植株内可溶性糖含量增加。这说明植株在胁迫条件下会自发的产生相应的应答机制来抵抗逆境胁迫。但随着处理时间的增长，转基因植株可溶性糖含量的增加要高于野生型植株可溶性糖含量的增加。在干旱胁迫处理14d后，野生型植株可溶性糖含量是未经处理的1.76倍，而转基因型可溶性糖含量是未经处理的2.12倍。盐胁迫处理下可溶性糖含量也要显著高于野生型可溶性糖含量(p<0.05)。植株的可溶性糖含量分析结果表明，在逆境胁迫条件下，植物可以自发产生可溶性糖从而保证细胞体内正常的代谢过程。插入池SF2转录因子的转基因植株，可以在逆境条件下产生更多的可溶性糖来抵抗逆境胁迫。3.5.4胁迫处理后脯氨酸含量变化表20转基因植株与对照高盐胁迫下植株脯氨酸含量的差异单位mmol/go天7天14天野生型植株脯氨酸含量平均值4.812.26,2转基因植株脯氨酸含量平均值5.216.735.3表21转基因植株与对照高盐胁迫下植株脯氨酸含量的差异单位mmol/go天7天14天舒生型植株脯氨酸含量平均值4.914.120.8转基因植株脯氨酸含量平均值5.320.531.4脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水和能力，其疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，使蛋白质可以借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫下蛋白质的脱水变性。因此，脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用。在正常的条件下，植物体内脯氨酸的含量并不高，但当遭受干旱、盐害等胁迫时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关，在一定程度上反映植物受水分和盐胁迫的情况，可作为植物抗逆性的一项生理指标。从表20、图28可以看出经7d干旱胁迫处理后野生型植株的脯氨酸含量有所上升，29但是当14d干旱处理的植株的脯氨酸含量却低于7d处理。这可能是由于14d干旱处理后，野生型植株的代谢调控机制已经紊乱，不能够产生出抵抗干旱胁迫的相应应答。而转基因型植株的脯氨酸含量随着处理时间的增长而提高。这表明转基因型植株对干旱胁迫有更好的适应能力。从表21、图29可以看出，在盐胁迫处理下，野生型植株和转基因植株的脯氨酸含量都有所增加，但是转基因型植株的脯氨酸含量显著高于野生型(p〈0.05)。这一结果表明，他SF2转录因子在拟南芥体内过量表达后，其下游信号的放大会导致脯氨酸大量合成，从而提高转基因植株对逆境胁迫的耐受性。植物对渗透胁迫、干旱和病菌等的抗性可以从三方面进行考察第一，表现在逆境下的形态特征，第二，转录水平胁迫相关基因的表达量变化，第三，植物生理生化的变化也高度适应逆境抗性。胁迫相关基因转录水平的变化可以从分子水平提供植物抗性增强的佐证；脯氨酸的含量作为植物抗旱指标，成为衡量植物是否抗旱的生化依据，可溶性糖作为渗透调节物质，在渗透胁迫下的积累，有助于植物细胞降低渗透势和水势，减少渗透胁迫对植物的危害，这些渗透调节物质的含量也成为植物抗渗透胁迫的重要指标；而丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终分解产物，它的含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。本试例通过测定野生型和转基因型植株在不同时间干旱、盐胁迫及病害处理下的相关基因表达量变化与各项生理指标，来研究野生型植株和转基因型植株对干旱、盐胁迫及病菌的耐受性。半定量RT-PCR研究结果表明，转基因植株胁迫相关基因CaHfe、rc^a4、ifi/L、P"W.2和Pi3均随胁迫处理时间的增加而增加，这给转基因拟南芥抗性增强提供了转录水平的证据。通过生理生化指标研究得出，转基因植株的植株含水量、可溶性糖和脯氨酸含量高于对照，而丙二醛含量低于对照，此四项指标均成为转基因植物抗渗透能力和抗旱能力提高的重要生化证据，也进一步说明过表达/ftSF2基因可能通过调节渗透调节物质的含量从而提高转基因拟南芥的抗旱性和渗透胁迫抗性，以维持植株正常的生理生化功能。ERF转录因子对一系列抗逆功能基因的转录以及对脯氨酸和糖含量的促进作用说明ERF因子在植物抗逆反应中起着重要作用。.序列表<110>中国.农业科学院生物技术研究所<120>铃铛刺ERF转录因子cDNA序列及其表达载体和应用<130>xuliebiao012<1§0〉2<170〉Patentlnversion3.5<210>1<211>855<212〉DM<213>HalimodendronhalodendronV.<400〉1ggggatgttc"tctctcacttcctcccaat"tattatattttctgtttc"tctaaagaagctg60tg肪aatgtgtggaggcgctatcatttcagacttcattggtgtgaagggtggccgg卿g120ttgCtCCgCELggacttctggtctgagcttgacccttattctgatctccttggctttgatg180taaccaccgctacttccaaacagtcaccaccacccctcccctttgataacaaa幼agtgg240aagcatgtgacaaagcggagaagaaaag犯gcctggtaactgcagagaagaagagtgggg300g聊gggtaagcg鄉tcgaacccgca^g3acgtgtacagaggaatcaggc犯aggccat360ggggcaagtgggccgctgaga/taagggacccacacaagggtgttcgtgtctggctcggaa420ctttcaacacagccgaagaagcagcc卿gcctacgacgccgccgccaagcgcatccgcg480gtgataaggccaaactcaatttccctgtttccaccgccaccgctgctcctccctctccg6540caacagagcacatctctaagaagcgttgcctc'agccctgatcagactagctcccaggaca600gctcg肌gcccatcgggcttgaggagatcgacctgaagcagcaaatctcagaccttgaat660ggtttcttggcttagagaatgagcaggcccaggcccaggccgtgccgctgcctggcgaag720ctgactgggacaac3Eictacatgaacctgtggatgcttgacgacgtcgttatgatgccct780acggtagtcgcttggtttactagggatttgcaaaaaa/tggaacaactttcgtgttttata840ttctcggttaattta855<210>2<211>245.<212>PRT<213>HalimodendronhalodendronV.<柳>2MetCysGlyGlyAlalielieSerAspPhelieGlyValLysGlyGly151015ArgLysValAlaProGinAspPheTrpSerGluLeuAspProTyrSer202530AspLeuLeuGlyPheAspValThrThrAiaThrSerLysGinSerPro354045ProProLeuProPheAspAsnLysl_ysValGluAlaCysAspLysAla505560GluLysLysArgSerLeuValThrAlaGluLysLysSerGlyGlyGlu65707580GlyLysArgGlyArgThrArgLysAsnValTyrArgGlylieArgGin3185ArgProTrpGlyLysTrpAlaAlaGlulieArgAspProHisLysGly100105110ValArgValTrpLeuGlyThrPheAsnThrAlaGluGluAlaAlaArg115120125AlaTyrAspAlaAlaAlaLysArglieArg'GlyAspLysAlaLysLeu130135140AsnPheProValSerThrAlaThrAlaAlaProProSerProProThr145150155160GluHislieSerLysLysArgCysLeuSerProAspGinThrSerSer165'170175GinAspSerSerLysProlieGlyLeuGluGlulieAspLeuLysGin180185190GinlieSerAspLeuGluTrpPheLeuGlyLeuGluAsnGluGinAla195200205GinAlaGinAlaValProLeuProGlyGluAlaAspTrpAspAsnAsn210215220TyrMetAsnLeuTrpMetLeuAspAspValValMetMetProTyrGly225230235240SerArgLeuValTyr2453权利要求1、从铃铛刺(HalimodendronhalodendronV.)中所分离的编码乙烯反应因子的cDNA序列，其特征在于该cDNA序列为以下(a)或(b)所示的碱基序列(a)SEQIDNO1所示的碱基序列；或(b)将SEQIDNO1所示的碱基序列一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的碱基序列，该碱基序列所编码的蛋白仍具有乙烯反应因子的功能或活性。2、按照权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于该cDNA序列的碱基序列为SEQIDNO:l所示。3、由权利要求l或2所述cDNA序列编码的乙烯反应因子，其特征在于该乙烯反应因子的氨基酸序列为(a)或(b)所示-(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有乙烯反应因子功能或活性的氨基酸序列。4、按照权利要求3所述的乙烯反应因子，其特征在于该乙烯反应因子的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。5、含有权利要求1或2所述cDNA序列的植物表达载体。6、按照权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于该植物表达载体是PC1302-HhERF2;其中，所述HhERF2的碱基序列为SEQIDNO:1所示。7、包含权利要求5所述植物表达载体的植物细胞。8、权利要求1或2所述cDNA序列在提高植物抗逆性中的应用。9、按照权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括构建含有权利要求1或2所述cDNA序列的植物表达载体；将该植物表达载体转化到植物细胞中，使所述cDNA序列在植物中表达。10、权利要求3所述的乙烯反应因子在提高植物抗逆性中的应用。全文摘要本发明公开了铃铛刺ERF转录因子cDNA序列及其表达载体和应用，属于植物基因工程领域。本发明通过RACE-PCR技术从沙生植物铃铛刺中分离、克隆到新的ERF2转录因子基因HhERF2(SEQIDNO1)。组织特异性表达结果显示，本发明基因在铃铛刺的根、茎、叶中均有表达；胁迫反应检测结果显示，本发明基因的表达受干旱、高盐和低温环境逆境的诱导，并且其表达不依赖于ABA的调控。将本发明cDNA序列转化到拟南芥进行过表达，对转基因拟南芥进行干旱、高盐、低温及病害等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定，实验结果表明，本发明cDNA序列可有效地提高植物的抗旱性、渗透胁迫抗性和抗病性。文档编号C12N5/10GK101503693SQ20091007903公开日2009年8月12日申请日期2009年3月3日优先权日2009年3月3日发明者吴燕民,唐益雄,阴翠翠申请人:中国农业科学院生物技术研究所