寡核苷酸序列及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】寡核苷酸序列及其制备方法与应用，涉及哈维氏弧菌的识别检测。提供可用于灭活哈维氏弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用方法。该寡核苷酸序列不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短。所述寡核苷酸序列为SEQ ID No.1，采用该序列就能完成灭活哈维氏弧菌的识别检测。合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库；将寡核苷酸文库与灭活哈维氏弧菌混合后进行SELEX筛选，直到亲和力不再明显上升为止，再克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA进行亲和特异性的验证和亲和常数的测定，得相应适配子。可用于各类样品中灭活哈维氏弧菌的识别检测。
【专利说明】寡核苷酸序列及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及哈维氏弧菌的识别检测，尤其是涉及可用于灭活哈维氏弧菌识别检测 的寡核苷酸序列及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 在养殖业中，每年约有10%的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致 的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生 不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建 立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。
[0003] 目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生 化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。 16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐， 且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能 实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴 性，即使采用单克隆抗体。由于制备技术要求较高、周期较长，因此其应用受到限制。
[0004] 指数富集配体进化技术（Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷 酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目 标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子--适配子，其分子识别能力可达到 甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已 筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。
[0005] SELEX技术的出现为微生物的快速检测提供了新的研究思路，其应用也将越来越 广泛。在SELEX筛选中，以灭活菌为靶目标进行筛选，不仅具有较好的安全性，而且使目标 菌的形态相对稳定和固定，从而有效提高了筛选的效率和效果。同时，以灭活菌为靶目标， 还能有效避免环境因子对活菌的影响，使筛选的稳定性得到较好的改善。因此，开展以灭活 菌为靶目标的SELEX筛选，具有重要意义。
[0006] 哈维氏弧菌（Vibrio harveyi)是水产养殖中的重要条件致病菌，它不仅能引发多 种水产动物发病，还可以通过食物链引起食物中毒，威胁到人类的健康。因此，运用SELEX 技术筛选灭活哈维氏弧菌适配子，并将其应用于灭活哈维氏弧菌的识别鉴定，能大大提高 哈维氏弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本发明的重点。
[0007] 本 申请人:在中国专利201110259244. 8中已公开了 3条适配子序列，分别如下：
[0008] 序列 I :5 , -GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3;；
[0009] 序列 2 :5 ' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTCCC TCTTGTGC-3;；
[0010] 序列 3 :5 ， -GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-Si 。
[0011] 本 申请人:在中国专利201110090419. 7中已公开了 4条适配子序列，分别如下：
[0012] 8 号适配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGT GAACGGAGGG GGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,
[0013] 10号适配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAA GGACTGTGTC GAGTGTTG GC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3^
[0014] 37号适配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTA GGAGGGCCAC AGTGGACT GCACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,
[0015] 46号适配子：5，-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTC-3^ 。
[0016] 本 申请人:在中国专利201210079530. 0中已公开了 4条适配子序列，分别如下：
[0017] 序列 I :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC GGGGGCGCGGTGAGGGGCTG CACAAGAGGGAG GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0018] 序列 2 :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGG GGAAGGCACAAGAGGGA GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0019] 序列 3 :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC GGGGGCGCGGTGAGGGGCT GCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAG GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0020] 序列 4 :5 ' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAG GCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAG GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3,;
[0021] 本 申请人:在中国专利201210552569. X中已公开了 6条适配子序列，分别如下：
[0022] 序列 1 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAG GGAG GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGAGGG-3,;
[0023] 序列 2 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGACGAGATGGGCGGGAAACGAGGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,;
[0024] 序列 3 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGTAGGAGGTAGTCGGAGAGGCGAATGAG AGGGGAAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAGGGA GAC CCC AGA GGG-3,;
[0025] 序列 4 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC AGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3,;
[0026] 序列 5 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,;
[0027] 序列 6 :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,;
【发明内容】
[0028] 本发明的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而 且制备方法容易、制备周期较短的寡核苷酸序列及其制备方法。
[0029] 本发明的另一目的在于提供所述寡核苷酸序列的应用。
[0030] 所述寡核苷酸序列，为SEQ ID No. 1，所述SEQ ID No. 1可记为"19适配子";所述 SEQ ID No.1 为：5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGTGGAGGAGGACGAAGTGAGAGCACA AGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,。
[0031] 所述寡核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：
[0032] 1)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库（5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35个随机寡核苷酸；
[0033] 2)将寡核苷酸文库与灭活哈维氏弧菌混合后进行SELEX筛选，直到亲和力不再明 显上升为止；
[0034] 3) SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA 进行亲和特异性的验证和亲和常数的测定，获得相应适配子。
[0035] 在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体步骤可为：
[0036] 2. 1灭活哈维氏弧菌菌液的制备
[0037] 用生理盐水将培养24h的哈维氏弧菌菌落从斜面上洗漆下来，6000rpm离心5min, 弃上清液，再加入含6%甲醛的生理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用 2X结合缓冲液悬浮灭火的菌沉淀，4°C保存。
[0038] 2. 2与弧菌结合
[0039] 取合成好的浓度为100μ M的ssDNA寡核苷酸文库4 μ L，用2X结合缓冲液稀释 至100yL，95°C变性5min，冰浴IOmin后加入到10(^1^灭活的哈维氏弧菌菌悬液中，301： 摇床结合2h，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用I X结合缓冲液洗沉淀1次，弃上清，贝丨J 沉淀部分为灭活哈维氏弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA ;
[0040] 在步骤2. 2中，所述2X结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的 溶液，所述IX结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20X结 合缓冲液配方为 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2, pH 7.4。
[0041] 2· 3分离结合的ssDNA
[0042] 在步骤2. 2所得的沉淀部分中加入IX结合缓冲液100 μ L，95°C加热5min，使与 弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心lOmin，取上清液，则可分离得 到与弧菌结合的ssDNA。
[0043] 2. 4 不对称 PCR 扩增 ssDNA
[0044] 总体积为25 μ L的不对称PCR的扩增体系如表1所示。
[0045] 表 1
[0046]
【权利要求】
1. 寡核苷酸序列，其特征在于为SEQ ID No. 1所示的寡核苷酸序列，所述SEQ ID No. I 记为 "19 适配子";所述 SEQ ID No. 1 为：5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGTGGAG GAGGACGAAGTGAGAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG-3,。
2. 如权利要求1所述寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库C -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35个随机寡核苷酸； 2) 将寡核苷酸文库与灭活哈维氏弧菌混合后进行SELEX筛选，直到亲和力不再明显上 升为止； 3. SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA进行 亲和特异性的验证和亲和常数的测定，获得相应适配子。
3. 如权利要求2所述寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述SELEX 筛选的具体步骤为： 2. 1灭活哈维氏弧菌菌液的制备 用生理盐水将培养24h的哈维氏弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心5min，弃上 清液，再加入含6 %甲醛的生理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用2 X 结合缓冲液悬浮灭火的菌沉淀，4°C保存； 2. 2与弧菌结合 取合成好的浓度为1〇〇μ M的ssDNA寡核苷酸文库4μ L，用2X结合缓冲液稀释至 100 μ L，95°C变性5min，冰浴IOmin后加入到100 μ L灭活的哈维氏弧菌菌悬液中，30°C摇床 结合2h，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用I X结合缓冲液洗沉淀1次，弃上清，则沉淀 部分为灭活哈维氏弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA ; 2. 3分离结合的ssDNA 在步骤2. 2所得的沉淀部分中加入I X结合缓冲液100 μ L，95°C加热5min，使与弧菌 结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心10min，取上清液，则分离得到与弧 菌结合的ssDNA ; 2. 4不对称PCR扩增ssDNA 总体积为25 μ L的不对称PCR的扩增体系如表1所示； 表1
引物 Pl 序列为：5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-3' ； 引物 P2 序列为：5' -CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTG TGC-3' ； 反应条件为：94°C预变性4min，然后进行40个循环（94°C变性30s，58°C退火30s，72°C 延伸20s)，最后72°C延伸7min ; 2. 5亲和力的测定 2. 5. 1不对称PCR扩增：用带有地高辛标记的引物Pl和引物P2不对称PCR扩增筛选 出来的ssDNA文库，扩增条件和参数与步骤2. 4的不对称PCR相同； 2. 5. 2测定亲和力： TMB显色系统：以四甲基联苯胺为底物，辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体IgG的显 色系统来测定吸附到弧菌表面的适配子量； 2. 6重复筛选 以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2. 1? 2. 5,直到亲和力不再明显上升为止，最终筛选得到适配子的富集文库。
4. 如权利要求3所述寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2. 2中，所述2X结 合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX结合缓冲液为20 X结 合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20X结合缓冲液配方为IM NaCl、50mM KC1、 500mM Tris-HClUOmM MgCl2, pH 7.4。
5. 如权利要求3所述寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2. 5. 2中，所述测定 亲和力的具体步骤为： 2. 5. 2. 1将TMB用无水乙醇配成lmg/mL，4°C遮光保存，用前再进一步按比例配制， TMB :底物缓冲液：30%过氧化氢=100 : 900 : 1，即配即用； 2. 5. 2. 2与菌结合：取步骤2. 5. 1扩增所得的PCR产物，用超微量分光光度计测定其中 的ssDNA浓度，再取1 μ L PCR产物，用2 X结合缓冲液稀释到100 μ L，95°C变性5min，冰浴 IOmin后，加入灭活菌液100 μ L混合，30°C，IOOrpm摇床结合30min，然后离心分离细菌沉 淀，弃上清液；同时做一空白，用结合缓冲液代替ssDNA ; 2. 5. 2. 3洗涤：在上述细菌沉淀中加入I X结合缓冲液500 μ L，混匀后，将菌悬液转移 至新的离心管中，6000rpm离心5min，弃上清，取菌沉淀； 2. 5. 2. 4与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100 μ L I : 900TBS稀释过的 过量的酶标兔抗地高辛抗体，混合后，反应IOmin,使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA 结合； 2. 5. 2. 5洗涤：6000rpm离心5min，弃上清，再用I X结合缓冲液500 μ L洗涤3次，每 次洗涤都将菌悬液转移到新的离心管中，最后弃上清，得菌沉淀； 2. 5. 2. 6ΤΜΒ显色：加入400 μ L双蒸水重悬菌沉淀，再加入200 μ L TMB显色液，避光显 色IOmin后，以2mol/L H2SO4IOO μ L终止反应，测定450nm处的吸光值OD45tl，该值即反映与 菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2. 5. 2. 3, 2. 5. 2. 4, 2. 5. 2. 5和 2. 5. 2. 6,得到空白相应的吸光度ODse ; 2· 5· 2· 7计算相应文库的亲和力：
6.如权利要求2所述寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述对适配 子富集文库进行克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA进行亲和特异性的验证和亲和常数的 测定，获得相应适配子，其具体方法为： 将步骤2)筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增，扩增条件同步骤2. 4,扩增产 物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序，得到一系列寡核苷酸序列或 ssDNA ;然后对获得的一系列ssDNA进行比较分析，发现有些ssDNA是完全相同的，或者说有 些ssDNA在测序结果中有2个以上的拷贝；若没有发现这种多拷贝ssDNA，则重复步骤3)， 继续克隆测序，直到获得至少一个多拷贝的ssDNA，然后选择这些多拷贝ssDNA进行亲和特 异性验证，获得相应的适配子，具体过程如下： 3. 1合成需要进行验证的ssDNA序列，并在5'端标记地高辛； 3. 2灭活微生物的准备 选取水产养殖环境常见的病原微生物--溶藻弧菌（V. alginolyticus)、嗜水气单胞 菌（Aeromonas hydrophila)、迟纯爱德华氏菌（Edwardsiella tarda)作为对照菌，与哈 维式弧菌（Vibrio harveyi) -起，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基中， 30°C下IOOrpm摇床培养8?10h，然后取菌液离心，弃上清培养液，再加入含6%甲醛的生 理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用2X结合缓冲液悬浮灭火的菌沉 淀，4°C保存； 3. 3亲和力的测定和亲和特异性验证 3. 3. 1与菌结合：取合成出的ssDNA序列IOpmol用2X结合缓冲液稀释到100 μ 1，95°C 变性5min，冰浴IOmin后，分别与上述4种灭活菌的菌液各100 μ Γ混合，菌数量约为3 X IO8 个，在28-C、100rpm摇床结合40min，然后6000rpm离心5min，分离菌沉淀与上清液，同时做 一不加 ssDNA的空白，用2X结合缓冲液代替； 3. 3. 2洗涤：将上述灭活菌的菌沉淀用I X结合缓冲液500 μ 1洗涤1次，6000rpm离心 5min，弃上清，取菌沉淀； 3. 3. 3与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μ 1用TBS 稀释的过量的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体，TBS的稀释比例为1 : 900,混合反应 IOmin ； 3. 3. 4洗涤：10000rpm离心5min，再用IX结合缓冲液500 μ 1洗涤3次，弃上清，取菌 沉淀； 3. 3. 5显色：加入400 μ 1双蒸水重悬菌沉淀，再加入200 μ I TMB显色液，避光显色 IOmin后，以2mol/L H2S04200 μ 1终止反应，测定450nm处的吸光值OD45tl，该值即反映结合 的酶标抗地高辛的OD值，即为空白同样进行上述步骤5. 3. 2、5. 3. 3、5. 3. 4和5. 3. 5， 得到白相应的吸光度OD空白，相应适配子的未和力=OD结合-OD空白； 3. 3. 6数据处理分析 用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概 率p〈0. 05为显著差异，p〈0. 01为极显著的差异，统计分析后获得相应序列对上述四种菌： 溶藻弧菌（V. alginolyticus)、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)、哈维式弧菌（Vibrio harveyi)的识别效果，从而确定该序列对灭 活溶藻弧菌是否具有亲和特异性，能否用于灭活溶藻弧菌的识别检测； 3. 4亲和常数的测定 亲和特异性验证后，选择亲和特异性较好的这个适配子19进行亲和常数的测定，具体 方法为： 合成这个适配子，并在5'端标记地高辛；用2X结合缓冲液稀释到ssDNA终浓度分别 为10ηΜ，20ηΜ，40ηΜ，60ηΜ，80ηΜ，ΙΟΟηΜ，120nM，140nM，再与灭活哈维氏弧菌结合后，分别按 步骤3. 3中的方法测定亲和力，做亲和力与ssDNA浓度间的关系图，用origin 8软件进行 拟合计算得到相应适配子的亲和常数，相应的亲和常数为Kd = 29. 17±7. 24nM。
7. 如权利要求1所述寡核苷酸序列在各类样品中对灭活哈维氏弧菌识别检测中的应 用，所述应用不用于疾病诊断。
8. 如权利要求7所述应用，其特征在于所述识别检测的具体方法为： 1) 待测灭活菌液的制备：取样品，蒸馏水溶解浸泡后，接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养 基中，30°C下IOOrpm摇床培养约8?10h，然后取菌液离心，弃上清培养液，再加入含6%甲 醛的生理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用2 X结合缓冲液悬浮灭活 的菌沉淀，4°C保存； 2) 应用检测方法1即地高辛法：取待测灭活菌液，用5'端标记有地高辛的上述寡核苷 酸序列（19)按步骤3. 3的亲和力测定方法对待测灭活菌液进行检测；同时用灭活哈维氏弧 菌代替待测菌液，同样按步骤3. 3的亲和力测定方法进行检测，得到阳性对照；用无菌蒸馏 水代替待测灭活菌液，同样按步骤3. 3的亲和力测定方法进行检测，得到阴性对照；结果显 示，阳性对照组颜色为黄色，阴性对照组不显色；若待测样品检测结果呈现黄色，则说明样 品中有哈维氏弧菌，为阳性，若待测样品检测结果不显色，则说明样品中没有哈维氏弧菌； 或 应用检测方法2即基于PCR的定性检测法：具体流程分为结合、洗涤、分离、扩增和电泳 检测，具体如下：取5 μ L浓度为IOuM的上述ssDNA(I9)，用2X结合缓冲液稀释至100 μ L， 95°C变性5min，冰浴IOmin后，分别加入灭活的待测菌悬液中，菌浓度在IO2个/mL以上，转 速IOOrpm摇床结合30min ;然后6000rpm离心5min,弃上清，沉淀部分为菌沉淀和其相结合 的ssDNA，用500 μ L IX结合缓冲液洗涤5次；然后向沉淀中加入IX结合缓冲液IOOul， 95?加热5min,使其与菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心IOmin, 取上清液，则分离到可与菌结合的ssDNA，然后取样进行普通PCR扩增，反应体系为25 μ L的 普通PCR参数如表3所示； 表3
反应条件：94°C预变性4min，然后进行35个循环，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延 伸20s，最后72°C延伸7min，得到与灭活待测菌结合的ssDNA的PCR产物，简称待测菌的PCR 产物； 分别用灭活哈维氏弧菌菌液和无菌水代替待测灭活菌液，同样按上述方法进行结合、 洗涤、分离和扩增，得到3个梯度的阳性对照的PCR产物和阴性对照的PCR产物，最后将灭 活待测菌的PCR产物、阳性对照菌的PCR产物和阴性对照的PCR产物用琼脂糖电泳进行检 测，紫外拍照显示，阴性对照没有亮带、三组阳性对照有亮带，如果待测组有亮带，说明样品 中有哈维氏弧菌，为阳性，若待测组没有亮带，则说明样品中没有哈维氏弧菌；所述灭活哈 维氏弧菌菌液的浓度分别为IO 2UO3UO4个/mL。
【文档编号】C12Q1/68GK104388422SQ201410576464
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】郑江, 鄢庆枇, 郝聚敏, 唐花 申请人:集美大学