专利名称：天麻特异dna分子标记序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物DNA序列，具体涉及天麻的DNA分子标记序列。
背景技术：
天麻是我国四大名贵中药之一，具有平肝息风、止痉之功效。最新研究发现它还具有增智、健脑、治疗老年性痴呆症、延缓衰老、抗炎、增强免疫功能、调节心血管的作用，而且毒副作用很小，具有重要研究开发和应用价值。近十多年来，科研工作者对天麻进行了广泛的研究。但天麻的分子遗传学背景尚不清楚。经国际互联网查询，在几个国际知名的基因数据库中，均无有关天麻的DNA序列资料，更无任何有关天麻分子遗传学标志序列和与其有效成分天麻素相关的DNA分子标志序列。而研究与天麻有效成分天麻素含量和天麻特性相关的天麻特异DNA分子标志序列及其应用是充分开发天麻药用价值的重要工作。
发明内容
本发明的目的是从天麻基因组中分离出与有效成分天麻素含量和天麻特性相关的DNA分子遗传学标记，并用于天麻品种选育和真伪鉴别。
实现本发明目的的技术方案是本发明是经克隆、测序和鉴定获得的，并被美国基因数据库Genbank登记注册的2个DNA分子标记序列，登录号分别为序列1AY905620，序列2AY905621。DNA序列1为360碱基对，DNA序列2为790碱基对。
特异DNA序列1用于天麻真伪鉴别和相似物种鉴定的方法为根据其两端核苷酸序列设计一对引物，其上游序列为5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′；下游序列为5′-aggataatattggagtgttccc-3′。用该引物扩增各种新鲜或干制天麻基因组DNA样本，得到340bp特异扩增条带，该DNA序列可用作分子遗传学标志，开发检测试剂(如DNA探针)，用于天麻真伪鉴别和相似物种鉴定。
特异DNA序列2用于天麻品种选优与鉴定的方法为根据其两端核苷酸序列设计一对引物，其上游序列是5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′下游序列是5′-tgaacataaattctatgcatag-3′。用该引物扩增各种天麻样本，天麻素含量高的天麻品种有770bp特异扩增条带。该DNA序列及其引物可用于天麻品种选优与鉴定下面结合附图进一步详述本发明。
图1、用DNA序列1设计合成的一对引物扩增9种天麻基因组DNA样本得到的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
M为DNA分子标记1、2、3、4、5、6、7、8、9为9种天麻基因组DNA样本扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2、用DNA序列1设计合成的一对引物扩增马铃薯、菊科羊角天麻、紫茉莉、大丽菊、羽裂蟹甲草、芭蕉芋、泽兰和大九腹牛的基因组DNA样本的琼脂糖凝胶电泳图。
M为DNA分子标记10、11、12、13、14、15、16、17依次为上述8种植物的基因组DNA样本扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。、本发明克隆天麻特异DNA分子标记序列及其应用的具体方法与步骤如下1、测定不同天麻品种样本的有效成分天麻素含量应用索氏提取器、超声波处理器和无水乙醇∶异丙醇(1∶1)混合液从天麻中萃取天麻素。采用高效液相色谱仪，以水∶乙腈(91∶9)为流动相，以天麻素标准品作对照；以221和270nm波长紫外光为检测光源，测定不同天麻品种样本的有效成分天麻素含量。
2、应用FLORACLEANTMPlant Genomic DNA Isolation kit从天麻块茎中提取基因组DNA；3、构建天麻DNA指纹图谱运用PCR仪、优化的RAPD扩增条件(预变性温度94℃3分钟，PCR循环中的变性温度94℃1分钟，退火温度38℃1分钟，延伸温度72℃1.5分钟，循环40次，最后72℃延伸10分钟)和优化的参数[模板DNA浓度2mg/L、TaqDNA聚合酶2U，引物浓度0.4μmol/L，dNTP各0.2mmol/L，10×缓冲液(Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl215mM)2.5μl，无菌双蒸水补足至25μl]，以及2种随机引物(非针对性引物)对9种天麻样本基因组DNA进行扩增，扩增产物用1.4％琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙锭染色，凝胶成像系统照相。
4、运用DNA凝胶回收试剂盒，选择回收天麻各品种共有的DNA序列和各品种特有的DNA序列；5、应用DNA重组技术克隆和鉴定回收的DNA序列(1)按照T载体试剂盒说明将回收DNA序列与T载体连接，其方法与步骤为在含3μl DNA溶液的0.5ml离心管中，按顺序加入5μl 2×快速连接缓冲液[Tris-HCl(pH7.8)60mM，MgCl220mM，DTT20mM，ATP2mM，10％聚乙二醇]，以及1μl T载体，1μlT4 DNA连接酶，混匀，20℃左右室温过夜。
(2)转化DH5a大肠杆菌，其方法与步骤在含有300μl感受态细胞的1.5ml离心管中，加入10μl DNA连接物，置冰上20分钟，置42℃水浴中45-50秒钟，移至冰上2分钟后加入LB(-)培养基700μl，于37℃中振摇培养1小时，离心浓缩细菌至100μl)；
(3)、运用蓝白筛选法鉴定阳性重组子克隆，方法与步骤将100μl细菌涂布于含X-gal和IPTG的琼脂培养基(+)平板上，置37℃培养箱中倒置培养14-18小时，挑1个白色菌落接种于5ml LB(+)液体培养基中，于37℃振摇培养过夜；(4)应用PCR技术对阳性重组子克隆作进一步鉴定，方法与步骤阳性菌液置沸水中水浴处理5分钟。在0.5ml离心管中按顺序加入双蒸无菌水19.8μl、10×缓冲液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、T7引物(根据T载体上游T7启动子序列设计的引物，其序列为5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′)0.5μl、Sp6引物(根据T载体下游Sp6启动子序列设计的引物，其序列为5′-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3′)0.5μl、TaqDNA聚合酶1U、菌液1μl，混匀，置PCR仪中扩增94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟，循环35次，最后，延伸10分钟。琼脂糖凝胶分离检测，根据扩增的DNA片段长度与回收的DNA长度相一致的确定为阳性克隆。
6、运用DNA自动测序仪测定阳性克隆DNA片段的核苷酸序列，根据T载体克隆位点两恻的核苷酸序列，剪切与拼接成完整的DNA序列；根据克隆DNA片段两端的头10个核苷酸序列与原扩增引物是否相同，进一步确定阳性克隆的真实性。
7、将DNA序列数据输入美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库作BLASTN搜索，确定为新发现DNA序列，并申请美国NCBI基因数据库登记注册。
8、DNA序列标记用于天麻真伪鉴别与品种选育。
根据新发现的DNA序列两端核苷酸顺序设计合成引物(为了减少原随机扩增引物可能错配引起的误差，设计引物从DNA序列两端的第10个核苷酸开始)，并用于扩增天麻不同品种基因组DNA，其方法是根据引物的TM值确定退火温度，即退火温度比TM值低5℃左右，在0.5ml离心管中按顺序加入双蒸无菌水18.8μl、10×缓冲液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、模板DNA2μl，混匀，置PCR仪中扩增94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟、退火1分钟(退火温度依引物TM值下降5℃)、72℃延伸1.5分钟，循环35次，最后，延伸10分钟。然后用琼脂糖凝胶分离检测。根据各个天麻品种有无特异DNA条带，确定DNA序列为天麻共有的特异DNA分子标记或某一品种的特异DNA分子标记。根据天麻DNA分子标记与天麻素含量高的相关性，确定该DNA分子标记为含天麻素高的优良天麻品种的特异分子标记。这些DNA序列标记可用于天麻真伪鉴别、品种选育、基因分型、品种鉴定和系统分类。
本发明的DNA分子标记序列是利用下列随机引物扩增3个天麻品种9个样本的基因组DNA，构建天麻DNA指纹图谱，然后，回收不同天麻品种的共有DNA序列和特有DNA序列，加以克隆、鉴定和筛选得到的。与天麻真伪鉴别和品种选育有关的两个序列的随机引物如下DNA序列1来自乌杆天麻2，它的随机引物序列是5′-gtttcgctcc-3′；DNA序列2来自乌杆天麻1，其随机引物序列是5′-tgctctgccc-3′。
对克隆和鉴定的DNA序列加以测序和拼接，构成完整的DNA序列，然后，检索美国NCBI基因数据库，确定为新发现的DNA序列。根据新发现DNA序列的两端核苷酸序列设计两对引物，对3个天麻品种9个样本基因组DNA进行PCR扩增分析。
2对引物的序列构成和扩增结果分别是1、根据DNA序列1设计的一对引物为上游引物序列是5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′；下游引物序列是5′-aggataatattggagtgttccc-3′。
用这对引物和PCR技术扩增各种天麻基因组DNA样本和天麻伪品的结果为所测天麻不同品种DNA样本(无论新鲜还是干制天麻)都有340bp(碱基对)特异扩增条带，而天麻伪品没有该特异条带。因此，DNA序列1可作为分子遗传学标记和检测试剂(如DNA探针)，用于天麻真伪鉴别和类似物种鉴定。
2、根据DNA序列2设计的一对引物为上游引物序列是 5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′下游引物序列是 5′-tgaacataaattctatgcatag-3′用这对引物和PCR技术扩增各种天麻基因组DNA样本的结果为只有天麻素含量最高的红杆天麻3和乌杆天麻1有770bp特异扩增条带。DNA序列2及其引物可用于天麻品种选育与鉴定。
本发明利用2个特异DNA分子标记序列开发相关产品，如DNA探针、PCR扩增引物，用于天麻真伪鉴别和发现天麻优良品种，为充分开发名贵中药资源—天麻的药用价值提供了有广阔前景的技术。
具体实施例实施例1、采用植物基因组DNA提取试剂盒，按说明从天麻及其伪品中提取基因组DNA；根据本专利DNA序列1的核苷酸序列，从其两端的第10个核苷酸开始设计和合成引物，上游引物是5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′，下游引物是5′-aggataatattggagtgttccc-3′，(由于引物设计是从第10个核苷酸开始的，该引物扩增的条带长度比原序列要少20个核苷酸)，然后，以天麻及其伪品基因组DNA为模板，用这对引物进行PCR扩增。扩增方法是在0.5ml离心管中按顺序加入双蒸无菌水18.8μl、10×缓冲液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶0.3μl(1.5U)、模板DNA2μl，混匀，置PCR仪中扩增94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟、54℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟，循环35次，最后，延伸10分钟。然后用1.4％琼脂糖凝胶分离检测，根据扩增结果有无特异条带，以鉴别天麻样本真伪。如图1和图2所示，扩增的9种天麻基因组DNA样本都有340bp的特异条带；而马铃薯、菊科羊角天麻、紫茉莉、大丽菊、羽裂蟹甲草、芭蕉芋、泽兰、大九腹牛等天麻伪品都没有340bp的特异扩增条带。因此，可以鉴别天麻真伪。
应用该引物扩增不同天麻品种得到340bp特异DNA片段，然后，测定该DNA片段的核苷酸序列；再比较分析不同天麻品种该DNA片段的单核苷酸序列差异，可从单核苷酸水平对天麻进行系统分类。
实施例2、用DNA序列2设计合成DNA引物，上游引物序列是5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′，下游引物序列是5′-tgaacataaattctatgcatag-3′，用该引物扩增不同品种天麻基因组DNA。具体方法在0.5ml离心管中按顺序加入双蒸无菌水18.8μl、10×缓冲液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶0.3μl(1.5U)、模板DNA2μl，混匀，置PCR仪中扩增94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟、40℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟，循环35次，最后，延伸10分钟。然后用1.4％琼脂糖凝胶分离检测，根据扩增结果有无770bp特异DNA条带，确定样本是否为天麻素含量高的天麻品种。有770bp特异DNA条带的为天麻素含量高的天麻品种，天麻素含量高达0.318～0.385％，比其他天麻品种高15～36％。还可以用DNA回收试剂盒回收该DNA片段，再以该DNA片段为模板，制成地高辛标记DNA探针。具体方法是在反应管中，加入1μg模板DNA，加无菌双蒸水至15μl，沸水浴5～10分钟，冰浴骤冷。然后，加1μl合成引物和4μl地高辛标记试剂，混匀后离心数秒钟，37℃水浴10小时左右，65℃加热10分钟终止反应。该DNA探针，可作为生化检验试剂，通过与样本DNA进行点杂交和根据有无杂交斑点，可检测优良天麻遗传类型。
<210>1<211>360<212>DNA<213>天麻特异DNA分子标记序列<220>
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权利要求
1.一种与天麻特性及天麻素含量相关的天麻特异DNA分子标记序列，其特征在于该天麻特异DNA分子的核苷酸序列为序列1gtttcgctcc catagccatc caaatctgca aaccagctca acctttcaat ttttaatcag 60cccaaactat acatacagct tgccagatcg ttacaatacc ttatcatcac ctatctaggc 120cttagcctca caattaacaa aatacgacaa tatatgaata atcctacaca agctcatttt 180gatcggctaa agtgcatctt gtggtatgtc aagggaaccc ttcacaatgg acttcactca 240ccacggacaa cctacatcta tgggcctatg cagattttga ttgggccaga gacactgatg 300gccgcaagtt cactactgca tccttctggg aacactccaa tattatcctg gagcgaaaca 360序列2tgctctgccc ctaaaatatg cattggtcaa ttgagtggat caactgccac ccaactaact 60aactgatcag tcggtgccaa ttatagtttt aaactgaatt aaagagcatg tgttaaatac 120taacacatga ttaaagccat ccacctctat agttggagag atctagggaa aagttactgg 180taaaaccatg ttgcctcgtg ggttcgagtc catcatgtaa tccacatatt ttcattttcc 240atgtccgctc ccctccacac ttctactaga agacaattag ttttcaaatt catacgcgtg 300caataagctt gtggaaagga gaagggaaat atgcacgtga gttaccatat ttttgtgatc 360cacaacatct agtaaatatt tttcctccaa tggaagcaaa gaagttgcaa acatttttta 420tccaaccaat atgattgagg gaaaggagtg caaatctgac aacaatttgc aaattctgct 480tagcatttga tatgtgcata atgccctaga gttgtatcac gcctccgcat attatggata 540attgtcatcc acatccatta aactaatatt tacaaaaaat attcaaatta cttgatttta 600catatccaat atttcgtata tttttttaat atcaaatact tttagtaatg ttttgtaatt 660atcctaattt taataggaat gaatcataaa tcaagacatc tgatgaacat tgtcacaaat 720ctaagcactc tatataactc aaacccaccc tagcatacta tgcatagaat ttatgttcag 780ggcagagcaa790。
2.一种如权利要求1所述的与天麻特性及天麻素含量相关的特异DNA分子标记序列的应用，其特征在于该特异DNA序列1用于天麻真伪鉴别和相似物种鉴定的方法为根据其两端核苷酸序列设计的一对引物上游序列 5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′下游序列 5′-aggataatattggagtgttccc-3′用该引物扩增各种新鲜或干制天麻基因组DNA样本，得到340bp特异扩增条带，有该特异扩增条带的为真天麻样本；特异DNA序列2用于天麻品种选优与鉴定的方法为根据其两端核苷酸序列设计的一对引物上游序列是 5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′下游序列是 5′-tgaacataaattctatgcatag-3′用该引物扩增各种天麻样本，有770bp特异扩增条带的为天麻素含量高的天麻品种。
全文摘要
本发明涉及天麻的特异DNA序列。它们的长度DNA序列1为360bp，DNA序列2为790bp；根据DNA序列的两端核苷酸序列设计的引物扩增各种天麻样本，以特异扩增条带鉴别各种天麻样本。本发明应用随机引物和PCR技术从不同天麻品种扩增得到天麻共有和特有DNA序列；应用DNA重组技术对得到的DNA序列进行克隆和鉴定，测序与拼接，基因库搜索，确定为新发现的DNA序列，根据该序列的两端核苷酸设计引物，运用PCR技术扩增不同天麻样本基因组DNA，验证为特异DNA分子标记。基于不同天麻品种共有的特异DNA分子标记和与天麻素含量相关的DNA分子标记，用于天麻真伪鉴别、品种选育、基因分型与品种鉴定等，为充分开发天麻资源提供了技术。
文档编号C12N15/29GK1657623SQ20051003134
公开日2005年8月24日 申请日期2005年3月21日 优先权日2005年3月21日
发明者陶钧, 罗志勇, 陶垚, 胡维新, 刘水平 申请人:长沙理工大学