专利名称：6条寡核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及溶藻弧菌的识别检测，尤其是涉及6条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。
背景技术：
在养殖业中，每年约有10%的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体。由于制备技术要求较高、周期较长，因此其应用受到限制。指数富集配体进化技术(SystemicEvolution of Ligands by ExponentialEnrichment),简称SELEX技术,是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子一适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。SELEX技术的出现为微 生物的快速检测提供了新的研究思路，其应用也将越来越广泛。在SELEX筛选中，以灭活菌为靶目标进行筛选，不仅具有较好的安全性，而且使目标菌的形态相对稳定和固定，从而有效提高了筛选的效率和效果。同时，以灭活菌为靶目标，还能有效避免环境因子对活菌的影响，使筛选的稳定性得到较好的改善。因此，开展以灭活菌为靶目标的SELEX筛选，具有重要意义。溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX技术筛选灭活溶藻弧菌适配子，并将其应用于灭活溶藻弧菌的识别鉴定，能大大提高溶藻弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本发明的重点。本申请人在中国专利201110090419. 7中已公开了 4条适配子序列，分别如下8 号适配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGTGAACGGAGGGGGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,10 号适配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAAGGACTGTGTCGAGTGTTGGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,
37 号适配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGGACTGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,46 号适配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCTGGGGTCTC-3'。本申请人在中国专利201110259244.8中已公开了 3条适配子序列，分别如下序列1:5, -GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGGAGACGGCGAAGCGACTGA-3'；序列2:5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCTGGGGTCTCCC TCTTGTGC-3'；序列3:5' -GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGCGACTGGAAGGAGACGGCGAA GCGACTGA-3'。
发明内容
本发明的目的在于提供可用于灭活溶藻弧菌识别检测的6条寡核苷酸序列及其制备方法。该寡核苷酸序列不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短。本发明的另一目的在于提供6条寡核苷酸序列的应用。所述6 条寡核苷酸序列，包括 SEQ ID No.1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ IDNo. 4,SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6共6条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成灭活溶藻弧菌的识别检测；
所述SEQ ID No.1可记为“#7适配子”，所述SEQ ID No. 2可记为“#14适配子”，所述SEQ ID No. 3可记为“#23适配子”，所述SEQ ID No. 4可记为“#4适配子”，所述SEQ IDNo. 5可记为“#8适配子”，所述SEQ IDNo. 6可记为“#9适配子”。所述SEQ ID 吣.1为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAG GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGAGGG-3,；所述SEQ ID 吣.2为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGACGAGATGGGCGGGAAACGAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID 吣.3为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGTAGGAGGTAGTCGGAGAGGCGAATGAGAGGGGAAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAGGGA GAC CCC AGA GGG-3'；所述SEQ ID No. 4 为5 ' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCA GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'；所述SEQ ID 吣.5为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID 吣.6为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'；所述6条寡核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤I)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——N35——GCACAAGAG GGAGAC CCCAGAGGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；2)将寡核苷酸文库与灭活溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，直到亲和力不再明显上升为止；3) SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA进行亲和特异性的验证和亲和常数的测定，获得相应适配子。在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体步骤可为2.1灭活溶藻弧菌菌液的制备用生理盐水将培养24h的溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心5min，弃上清液，再加入含6%甲醛的生理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用2 X结合缓冲液悬浮灭火的菌沉淀，4°C保存。2. 2与弧菌结合取合成好的浓度为100 ii M的ssDNA寡核苷酸文库4 ii L，用2 X结合缓冲液稀释至IOOiI L，95°C变性5min，冰浴IOmin后加入到100 y L灭活的溶藻弧菌菌悬液中，30摇床结合2小时,再6000rpm离心5min,弃上清,然后用I X结合缓冲液洗沉淀I次,弃上清，则沉淀部分为灭活溶藻弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA ；在步骤2. 2中，所述2 X结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20 X结合缓冲液配方为 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。2. 3分离结合的ssDNA在步骤2. 2所得的沉淀部分中加入IX结合缓冲液IOOii L，95°C加热5min，使与弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心lOmin，取上清液，则可分离得到与弧菌结合的ssDNA。2. 4 不对称 PCR 扩增 ssDNA总体积为25 ii L的不对称PCR的扩增体系如表I所示。表I
权利要求
1.6条寡核苷酸序列，其特征在于包括SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQIDNo. 4,SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6共6条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成灭活溶藻弧菌的识别检测； 所述SEQ ID No.1可记为“#7适配子”，所述SEQ ID No. 2可记为“#14适配子”，所述SEQ ID No. 3可记为“#23适配子”，所述SEQ ID No. 4可记为“#4适配子”，所述SEQ ID No. 5可记为“#8适配子”，所述SEQ ID No. 6可记为“#9适配子”； 所述 SEQ ID 吣.1为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC GGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAG GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGAGGG-3,； 所述 SEQ ID 吣.2为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGACGAGATGGGCGGGAAACGAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'； 所述 SEQ ID 吣.3为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGTAGGAGGTAGTCGGAGAGGCGAATGAGAGGGGAAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAGGGA GAC CCC AGA GGG-3'； 所述 SEQ ID No.4 为5 ' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCA GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'； 所述 SEQ ID 吣.5为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'； 所述 SEQ ID 吣.6为5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'。
2.如权利要求1所述6条寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——N35——GCACAAGAG GGAGAC CCCAGAGGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸； 2)将寡核苷酸文库与灭活溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，直到亲和力不再明显上升为止； 3)SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA进行亲和特异性的验证和亲和常数的测定，获得相应适配子。
3.如权利要求2所述6条寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体步骤为 . 2.1灭活溶藻弧菌菌液的制备 用生理盐水将培养24h的溶藻弧菌菌落从斜面上洗漆下来,6000rpm离心5min,弃上清液，再加入含6%甲醛的生理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用2X结合缓冲液悬浮灭火的菌沉淀，4°C保存； .2. 2与弧菌结合 取合成好的浓度为IOOii M的ssDNA寡核苷酸文库4 iiL，用2X结合缓冲液稀释至100ii L，95°C变性5min，冰浴IOmin后加入到100 y L灭活的溶藻弧菌菌悬液中，30摇床结合2小时,再6000rpm离心5min,弃上清,然后用I X结合缓冲液洗沉淀I次,弃上清，则沉淀部分为灭活溶藻弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA ； . 2. 3分离结合的ssDNA 在步骤2. 2所得的沉淀部分中加入IX结合缓冲液IOOii L，95°C加热5min，使与弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心lOmin，取上清液，则可分离得到与弧菌结合的ssDNA ； ` 2. 4不对称PCR扩增ssDNA 总体积为25 ii L的不对称PCR的扩增体系如表I所示；
4.如权利要求3所述6条寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2.2中，所述2X结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20X结合缓冲液配方为IM NaCl、50mMKCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。
5.如权利要求3所述6条寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2.5. 2中，所述测定亲和力的具体步骤为 ` 2.5. 2.1将TMB用无水乙醇配成lmg/mL 4°C遮光保存，用前按照下列比例配制TMB 底物缓冲液30%过氧化氢=100 900 1，即配即用； `2.5. 2. 2与菌结合取步骤2. 5.1扩增所得的PCR产物，用超微量分光光度计测定其中的ssDNA浓度；然后取I ii L PCR产物，用2 X结合缓冲液稀释到100 u L，95°C变性5min，冰浴IOmin后,加入灭活菌液IOOii L充分混合,30°C, IOOrpm摇床结合30min,然后离心分离细菌沉淀，弃上清液；同时做一加结合缓冲液的空白； . 2. 5. 2. 3洗涤在上述细菌沉淀中加入I X结合缓冲液500 u L，充分混匀后，将菌悬液转移至新的离心管中，6000rpm离心5min,弃上清,取菌沉淀； .2.5. 2. 4与酶标兔抗地高辛抗体结合在菌沉淀中加入IOOiiL I 900TBS稀释过的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应IOmin,使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合； .2.5. 2. 5洗涤6000rpm离心5min，弃上清，再用I X结合缓冲液500 u L洗涤3次，每次洗涤都将菌悬液转移到新的离心管中，最后弃上清，得菌沉淀； . 2.5. 2. 6TMB显色加入400 u L双蒸水重悬菌沉淀，再加入200 u L TMB显色液，避光显色IOmin后，以2mol/L H2SO4IOO u L终止反应，测定450nm处的吸光值OD45tl,该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2. 5. 2. 3，2. 5. 2. 4，2. 5. 2. 5和.2.5. 2. 6，得到空白相应的吸光度OD空白；. 25 2 7
6.如权利要求2所述6条寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述对适配子富集文库进行克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA进行亲和特异性的验证和亲和常数的测定，获得相应适配子，其具体方法为 将步骤2)筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增，扩增条件同步骤2. 4，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序，得到一系列寡核苷酸序列或ssDNA ;然后对获得的一系列ssDNA进行比较分析，发现有些ssDNA是完全相同的，或者说有些ssDNA在测序结果中有2个以上的拷贝；若没有发现这种多拷贝ssDNA，则重复步骤3)，继续克隆测序，直到获得至少一个多拷贝的ssDNA ;然后选择这些多拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，获得相应的适配子，具体过程如下 . 3.1合成需要进行验证的ssDNA序列，并在5’端标记地高辛； . 3.2灭活微生物的准备 选取水产养殖环境常见的病原微生物-哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟纯爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，与溶藻弧菌(V. alginolyticus)—起,在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30°C下IOOrpm摇床培养约8 IOh ;然后取菌液离心，弃上清培养液，再加入含6%甲醛的生理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用2 X结合缓冲液悬浮灭火的菌沉淀，4°C保存； . 3.3亲和力的测定和亲和特异性验证 .3.3.1与菌结合取合成出的ssDNA序列IOpmol用2 X结合缓冲液稀释到100 U 1,95°C变性5min，冰浴IOmin后，分别与上述4种灭活菌的菌液各100 U I混合(菌数量约为3 X IO8个),在28°C、IOOrpm摇床结合40min,然后6000rpm离心5min,分离细菌沉淀与上清液，同时做一加2X结合缓冲液的空白； .3.3. 2洗涤将上述灭活菌的菌沉淀用I X结合缓冲液500 洗涤I次，6000rpm离心5min,弃上清,取菌沉淀；[ 3.3. 3与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合在菌沉淀中加入IOOu 11 900TBS稀释的过量的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应IOmin ； [3.3. 4洗涤10000rpm离心5min，再用IX结合缓冲液500 洗涤3次，弃上清，取菌沉淀； [ 3.3. 5显色加入400 ill双蒸水重悬菌沉淀，再加入200 u I TMB显色液，避光显色IOmin后，以2mol/L H2S04200 u I终止反应，测定450nm处的吸光值OD45tl，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为空白同样进行上述步骤5. 3. 2,5. 3. 3,5. 3. 4和5. 3. 5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力=OD结合-OD空白； [ 3.3. 6数据处理分析 用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p〈0. 05为显著差异，p〈0. 01为极显著的差异，统计分析后获得相应序列对上述四种菌的识别效果，从而确定该序列对灭活溶藻弧菌是否具有亲和特异性，能否用于灭活溶藻弧菌的识别检测。
7.如权利要求1所述6条寡核苷酸序列在灭活溶藻弧菌检测中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于其检测方法如下 [1)待测灭活菌液的制备取样品，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基中，30°C下IOOrpm摇床培养约8 IOh ;然后取菌液离心，弃上清培养液，再加入含6%甲醛的生理盐水于62. 5°C水浴lh，离心后生理盐水洗涤3次，再用2 X结合缓冲液悬浮灭火的菌沉淀，4°C保存； [ 2)取待测灭活菌液，用5/端标记有地高辛的上述6条寡核苷酸序列中的任何一条按步骤3. 3的亲和力测定方法对待测灭活菌液进行检测；同时用灭活溶藻弧菌代替待测菌液，同样按步骤3. 3的亲和力测定方法进行检测，得到阳性对照；用无菌蒸馏水代替待测灭活菌液，同样按步骤3. 3的亲和力测定方法进行检测，得到阴性对照；结果显示阳性对照组颜色为黄色，阴性对照组不显色；如果待测样品检测结果呈现黄色，说明样品中有溶藻弧菌，为阳性，如果待测样品检测结果不显色，则说明样品中没有溶藻弧菌；或 取5 ii L浓度为IOuM的上述6条ssDNA中的任何一条，用2X结合缓冲液稀释至IOOii L，95°C变性5min，冰浴10后，分别加入灭活的待测菌悬液中，菌浓度在IO2个/mL以上，转速IOOrpm摇床结合30min ;然后6000rpm离心5min,弃上清,沉淀部分为菌沉淀和其相结合的ssDNA，用500 ii L IX结合缓冲液洗涤5次；然后向沉淀中加入I X结合缓冲液100ul，95°C加热5min，使其与菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后15000rpm离心IOmin,取上清液，则可分离到可与菌结合的ssDNA，然后取样进行普通PCR扩增，反应体系为25 ii L的普通PCR参数如表3所示 表全文摘要
6条寡核苷酸序列及其应用，涉及溶藻弧菌的识别检测。提供可用于灭活溶藻弧菌识别检测的6条寡核苷酸序列及其制备方法和应用。该寡核苷酸序列不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短。所述6条寡核苷酸序列包括SEQ ID No.1~6共6条寡核苷酸序列且采用其中一条就能完成灭活溶藻弧菌的识别检测。合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库；将寡核苷酸文库与灭活溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，直到亲和力不再明显上升为止，再克隆测序，选择其中的高拷贝ssDNA进行亲和特异性的验证和亲和常数的测定，得相应适配子。可用于各类样品中灭活溶藻弧菌的识别检测。
文档编号C12Q1/04GK103060326SQ201210552569
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者郑江, 汤学敏, 李玉宝 申请人:集美大学