一种碱性纤维素酶及其dna序列和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种碱性纤维素酶基因及其在纺织或洗涤剂领域的应用，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。该基因是通过宏基因组技术从土壤宏基因组中得到的新的尚未有功能研究的DNA序列，对该DNA序列所编码的蛋白的结构和功能研究结果表明，该DNA序列表达的重组蛋白具有较好的耐碱纤维素酶活性，且部分金属离子和表面活性剂能显著提高该重组蛋白分解纤维素底物的活性。该DNA序列的表达产物可作为一种新的酶源用于纺织或洗涤剂行业，具有广阔的工业应用前景。
【专利说明】一种碱性纤维素酶及其DNA序列和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽【技术领域】。更具体地，涉及一种碱性纤维素酶及其DNA序列和应 用。
【背景技术】
[0002] 纤维素是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富最廉价的可再生资源，每年 的植物通过光合作用产生的植物干质量高达220亿吨，其中纤维素占50%，所以能利用纤维 素的微生物具有物种多样性和分布广泛的特点。在微生物、植物、昆虫甚至哺乳动物中都有 发现纤维素酶，其中来源于真菌、放线菌、细菌的纤维素酶得到了一定研究。据报道，目前为 止，已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了多种纤维素酶基因，其中产纤维素酶的真菌粗 略估计已达68个属。但由于纤维素具有水不溶性的高结晶结构，其外围又被木质素层包围 着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，纤维素的再生利用一直受到限制。
[0003] 内切葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4)又称为羧甲基纤维素酶、Cl酶等，主要作用于纤维素 的非结晶区，随机水解β _1，4糖苷键，将长链的纤维素截短，并通过与外切葡聚糖酶或葡 萄糖苷酶的复配协调作用，可以有效地降解结晶纤维素。在纤维素酶系中，内切葡聚糖苷酶 作为首先作用于纤维素的第一个酶而尤为重要。
[0004] 纤维素酶也属于糖基水解酶类，后者与蛋白酶，脂肪酶组成目前的三大工业酶，其 中洗涤剂用酶占了工业酶的32%，但由于目前的洗涤剂多为碱性，而已报道的内切纤维素酶 却多偏酸性或中性，因此迫切需要从自然界中发现更多新的、耐碱的内切葡聚糖酶，以促进 纺织或洗涤剂领域行业的发展。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有纤维素酶的局限和不足，提供一种在纺织和 洗涤行业具有潜在应用前景的碱性纤维素酶及其DNA序列。该序列是通过宏基因组技术， 从土壤宏基因组中得到的新的尚未有功能研究的DNA序列。
[0006] 本发明的目的是提供一种可应用于纺织和洗涤行业的碱性纤维素酶及其DNA序 列。
[0007] 本发明的另一目的是提供所述碱性纤维素酶及其DNA序列的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 本发明通过宏基因组技术，从河南省南阳市的造纸厂沉积物土壤样品所构建的宏基因 组文库中得到一个新的尚未有功能研究的DNA序列，接着本发明人采用基因工程技术对该 DNA序列进行功能研究，结果发现该DNA序列所表达的重组蛋白具有耐碱内切葡聚糖酶的 特点，而且部分金属离子和表面活性剂能显著提高该重组蛋白分解纤维素底物的活性，因 此可用于纺织或洗涤剂领域。该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，该DNA序列 编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，即碱性纤维素酶。
[0009] 宏基因组学的功能筛选技术可直接从土壤基因组中筛到具有特定功能的DNA序 列，有利于发现新型基因和新型酶，并能通过构建表达载体，使功能基因独立于宿主细胞表 达出相应的功能蛋白。在高通量测序发展迅猛的今天，宏基因功能筛选技术仍有其不可替 代的优势。
[0010] 另外，在严格条件下与本发明所述SEQ ID NO: 1所不序列杂交或与本发明所述SEQ ID NO: 1所示序列具有90%以上同源性，且编码与纤维素降解相关蛋白的DNA分子，也应在 本发明的保护范围之内。
[0011] 本发明还提供了一种由上述碱性纤维素酶基因编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。该多肽具有耐碱内切葡聚糖酶活性。
[0012] 在本发明公开的基础上，由出发载体的多克隆位点插入SEQ ID NO: 1所示序列构 建而成的重组表达载体、含有SEQ ID NO: 1所示序列的转基因细胞系、含有SEQ ID NO: 1所 示序列的重组菌，也都在本发明的保护范围之内。
[0013] 另外，本发明还提供了一种碱性纤维素酶的制备方法，包括以下步骤： 51. 获得权利要求书1所述SEQ ID NO: 1所示序列； 52. 将SEQ ID NO: 1所示序列克隆到表达载体； 53. 将S2构建的表达载体转入宿主细胞，得到可生产碱性纤维素酶的基因工程菌； 54. 培养基因工程菌，得到碱性纤维素酶。
[0014] 其中，S2所述表达载体为本领域常用的表达载体，不做严格控制，如pyeS2载体 等；S3所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或 分支杆菌；真核细胞包括酵母细胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各种动植物细胞。
[0015] 本发明人将SEQ ID NO: 1所示DNA序列克隆到pyeS2载体上，然后电击转化酿酒 酵母INVScl感受态细胞，通过对阳性转化子的诱导表达得到重组蛋白。接着对该重组蛋白 进行了酶学性质研究，结果如下： (1) 该重组蛋白在酿酒酵母中具有高度可溶性表达的特点，无包涵体形成； (2) 该重组蛋白在羧甲基纤维素钠（CMC)平板上有明显的透明圈； (3) 该重组蛋白的分子量约为13. 4KDa ; (4) 该重组蛋白在对CMC底物进行酶解反应时，最适反应pH为9. 2,且在pH 6. 0时有 93%的相对酶活，而在pH KX 0?12. 0保留60%以上的酶活，且在pH 9. 0, KX 0和IL 0处 理6 h后分别保留89%，73%，64%的相对酶活(如附图4所示）； (5) 该重组蛋白最适温度为50°C，且在70°C处理6 h后仍保留51%的相对酶活，该重组 蛋白在50°C、60°C和70°C的半衰期分别为12. 6、7. 6和6. I h (如附图5所示)。
[0016] (6)该重组蛋白在加入高浓度（10 mM)的金属离子后，可显著提高酶活。加入Fe2+ 和Mn2+分别提高了酶活约43倍和19倍，相对于中低浓度，加入高浓度的金属离子后酶活 提高的倍数更多，而Na+、Mg 2+和Zn2+在不同浓度下则均能抑制重组蛋白降解底物的活性。
[0017] (7)该重组蛋白在添加高浓度的有机溶剂后几乎都能明显提高重组蛋白降解底物 的活性，特别是添加表面活性剂Tritonx-100和Tween 20至浓度为10%时，能分别提高重 组蛋白分解底物的活性约16倍和13倍。而EDTA在不同浓度下都能抑制该重组蛋白分解 纤维素底物的活性。
[0018] 通过以上研究结果可以看出，SEQ ID NO: 1所示序列所表达的重组蛋白具有较好 的耐碱纤维素酶活性，同时具有良好的高浓度金属离子和有机溶剂耐受性，因此该DNA序 列的表达产物可作为一种新的酶源用于纺织或洗涤剂领域。
[0019] 最后，SEQ ID NO:2所示多肽在纤维素分解方面的应用也在本发明的保护范围之 内。更近一步地，在纺织或洗涤剂领域的应用也在本发明的保护范围之内。
[0020] 本发明具有以下有益效果： 本发明人通过宏基因组技术，从土壤宏基因组中得到一种新的尚未有功能研究的DNA 序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0021 ] 对该DNA序列所编码的蛋白的结构和功能研究结果表明，该DNA序列表达的重组 蛋白具有很好的耐碱纤维素酶活性，可作为一种新的酶源用于纺织或洗涤剂领域，具有广 阔的工业应用前景。
[0022] 另外，通过研究发现，部分金属离子和表面活性剂能显著提高该重组蛋白分解纤 维素底物的活性，因此本发明提供的该耐碱纤维素酶的活性可调，对其广泛推广应用具有 很大的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为实施例3中的SDS-PAGE电泳图；其中，M为标准蛋白分子量标记，1为重组 蛋白粗提物，2为纯化后的重组蛋白。
[0024] 图2为重组蛋白分解羧甲基纤维素钠（CMC)后，用刚果红染色并用NaCl脱色的结 果，黑色圆圈代表接种区域。
[0025] 图3为重组蛋白作用于不同底物的酶活，以CMC为底物时的酶活作为100%。
[0026] 图4为重组蛋白降解CMC底物时pH对酶活的影响。
[0027] 图5为重组蛋白在不同碱性条件（pH 8. 0-12. 0)下处理不同时间后，残余的对CMC 底物的酶活的情况。
[0028] 图6为重组蛋白降解CMC底物时温度对酶活的影响。
[0029] 图7为重组蛋白在不同温度条件（4°C -70°C)下处理不同时间后，残余的对CMC底 物的活性的情况。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试 齐U、方法和设备。
[0031] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0032] 实施例1 土壤样品中宏基因组DNA的获得 造纸废水沉积物样品采集自河南省许昌市造纸厂排污口。
[0033] 取两个50 mL的离心管，称取造纸废水沉积物样品，每管6 g，各加 DNA extraction buffer 13.5 mL (含有 100 mM EDTA、100 mM 磷酸钠、1.5 M NaCl、l%CTAB 和 100 mM Tris-HcUpH 8.0)，涡旋震荡混匀，放摇床220 rpm，37°C活化30 min，再向各管加1.5 mL 20%的SDS，使其终浓度达到2% (w/v)。接着在65°C水浴锅中水浴2 h，每隔15 min上下 轻轻颠倒几次混匀。室温6, 000 g离心10 min，收集上清后，转移至干净离心管，加入等体 积的氯仿：异戊醇（24:1，V/V)，上下轻轻颠倒混匀。接着室温11，000 g离心25 min收集 上清，加入0. 6倍体积的异丙醇上下颠倒混匀，室温静置3. 5 h后，室温11，OOO g离心25 min，收集沉淀，用4°C预冷的75%乙醇洗涤1次，重悬于65°C预热的CldH2O，并65°C温浴5 min，得到终体积为400 μ L的造纸废水沉积物宏基因组DNA。
[0034] 实施例2造纸废水沉积物宏基因组文库的构建和DNA序列的获得 1、造纸废水沉积物宏基因组文库的构建 用feoRI酶部分酶切实施例1所提取的造纸废水沉积物宏基因组DNA，并电泳回收 2. 5?7. 5 kb的酶切片段。将回收到的DNA片段与经feoRI酶切和去磷酸化处理的pUC118 载体（Takara公司）连接，电击转化凡co/i DH5 α感受态细胞，并涂布含有100 μ g/mL氨 苄青霉素（Amp)、40 yg/mL X-gal和0. 5 mM IPTG的LB固体平板，由此构建了一个库容 量达IO7个转化子、多样性好的宏基因文库。
[0035] 2、目的基因的筛选和序列分析 随机挑取平板上的克隆并分别平行转接到含100 μ g/mL Amp和10 yg/mL IPTG的 CMC平板上，37°C培养2?3天后，用刚果红染色30 min，再用IM NaCl脱色，观察菌落周围 是否有水解圈。最终得到阳性克隆子，送交测序。
[0036] 测序结果显示该阳性克隆子含有长度为1696 bp的插入片段，使用NCBI网站上 Sequence Analysis中的ORF Finder发现一个纤维素酶基因的ORF序列（384 bp)，其核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示，即本发明所述的碱性纤维素酶基因；该基因编码127个氨基 酸，命名为Endol8,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0037] 实施例3 DNA序列表达的重组蛋白的获得 1、将实施例2得到的阳性克隆子接种于5 mL LB培养基（100 μ g/mL Amp)，37 °C 220 rpm摇床培养12 h，提取质粒。
[0038] 2、设计引物Pl和P2,引物两端分别引入能插入酿酒酵母表达载体pyeS2的feoR I和沿ο I酶切位点。
[0039] 引物Pl (上游引物）的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示： 引物P2 (下游引物）的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示： 3、以提取的质粒为模板，采用引物Pl和P2进行PCR扩增。
[0040] PCR 体系总体积 50 μ L，含 Prime STAR?Max Premix 25 μ? (2. 5 U)、两种引物各 2 4 1^(10以1{)、灭菌蒸馈水2〇4 1^和模板0嫩14 1^(1叩）。
[0041] PCR 扩增条件：98°C 预变性 I min ;98°C 5 sec，55 °C 5 sec，72°C 5 sec，反应 30个循环。
[0042] 4、所得PCR产物长度为380 bp左右，采用常规方法回收目的片段，feoR I和通ο I双酶切后连接入pyes2质粒中，继而转化宿主菌酿酒酵母INVScl，转化液涂布SC培养基 平板，该培养基含2%葡糖糖、0. 67%YNB和2%氨基酸混合液(尿嘧啶缺陷型)，30°C培养48 h，提取阳性菌落质粒，利用引物Pl和P2进行PCR鉴定。
[0043] 5、对鉴定过的、含有SEQ ID NO: 1所示DNA序列的重组菌进行诱导表达研究。将 该重组菌种接种到150 mL三角瓶中，瓶中含有30 mL SC液体培养基（用2%半乳糖替代2% 葡萄糖)，30°C 200 rpm发酵72 h，诱导靶蛋白表达。4°C下5000 g离心10 min收获细胞。
[0044] 细胞沉淀根据pyes2 (Invitrogen公司）说明书用breaking buffer洗漆，裂解 菌体，得到粗酶液，然后根据His-Bind Purification Kit (Novagen公司）说明书进行纯化 操作，得到纯化后的重组蛋白，即为SEQ ID N0:1所示DNA序列表达的重组蛋白。
[0045] 将纯化操作中的粗酶液和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如附图1所 示。从附图1可以看出，在对应靶蛋白位置处均有一条较明显的目的蛋白条带。由此可见 该重组蛋白在酿酒酵母INVScl中得到了高效表达。
[0046] 6、另外，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化后的重组蛋白进行了分子量的研 究。
[0047] SDS-PAGE电泳结果显示该重组蛋白的分子量约为30 KDa，考虑到该重组蛋白带 有约17 KDa的氨基酸组成的融合片段(对应于pyes2载体上的N-His，N-Xpress，C-His, C-V5)，因此根据SDS-PAGE电泳结果，推断该重组蛋白不带融合片段的分子量应该为13 KDa，这与我们根据靶蛋白的氨基酸序列计算的理论分子量13.4 KDa是一致的。
[0048] 实施例4用CMC平板验证纯化后的重组蛋白分解底物的活性 在只含有?ο μ g/mL CMC和10 ug/ml Agar的平板上分别接10 μ L无菌水，10 μ L 纤维素酶液（lU/mL)，10 yLpyes2载体蛋白溶液，和10 yLEndol8酶液（即重组蛋白酶 液，18. 2 U/mL)，37°C孵育24 h后，用0. 2%的刚果红溶液染色30 min，再用I M的NaCl溶 液脱色，结果如附图2所示。
[0049] 研究结果表明，该重组蛋白能分解CMC产生明显的透明圈。
[0050] 实施例OTNA序列所表达的重组蛋白的性质研究 本实施例选择了三种多糖底物（CMC、淀粉和琼脂）和三种寡糖底物(蔗糖、麦芽糖和纤 维二塘)，对实施例3所得的重组蛋白进行了相关的酶学性质研究。
[0051] 本实施例选择CMCA-DNS法测定重组蛋白的酶活，定义1个活力单位（U/mL)为在 50°C，pH 7.4时，I mL酶液每分钟水解底物产生相当于1 μ g葡萄糖的还原糖量，以CMC为 底物的酶学活性作为100%，测得的各底物酶活结果如附图3所示。
[0052] 研究结果表明，重组蛋白对多糖底物有明显的偏好性，以淀粉和琼脂为底物的相 对酶活为86%和54%，而重组蛋白对寡糖的降解活力很低，以麦芽糖，蔗糖和纤维二糖为底 物的相对酶活均低于30%，这样的结果与普遍的内切葡聚糖酶的作用机理是一致的，即该酶 作为分解纤维素大分子的第一个酶而起作用。
[0053] 实施例6温度和pH值对重组蛋白活性及稳定性的影响 1、内切葡聚糖酶底物采用羧甲基纤维素钠（CMC)。
[0054] 2、在重组蛋白的最适pH和pH稳定性研究中，用PBS缓冲液配置反应体系，在pH 5.0?12.0范围内，pH值每增加1为一个梯度，测定重组蛋白在这些pH下的相对活性，检 测结果如附图4和附图5所示。
[0055] 研究结果表明，该重组蛋白降解CMC的最适pH为9. 0。为进一步确定该蛋白的具 体最适pH，在pH 8. 6?9. 4范围内，pH每增加0. 2为一个梯度，测定相对酶活，研究结果 表明，该重组蛋白降解CMC的最适pH为9. 2 (附图4);关于重组蛋白的pH稳定性研究结果 表明，在pH 6.0时重组蛋白有93%的相对酶活，而在pH 10. 0?12. 0仍保留60%以上的酶 活，且在pH 9. 0,10. 0和11. 0处理6 h后仍分别保留89%，73%，64%的相对酶活（附图5)。
[0056] 以上研究结果表明该重组蛋白具有酸碱适应性，且特别适于在碱性环境下对纤维 素底物进行高效降解。
[0057] 3、在重组蛋白的最适温度和温度稳定性研究中，用pH 7. 4的PBS缓冲液配置反应 体系，在温度4?70°C范围内，测定重组蛋白在这些温度下的相对活性。检测结果如附图6 和附图7所示。
[0058] 为了确定重组蛋白的最适温度，在得到最大酶活对应的温度之后，在该温度前后 每2°C为一个梯度，从而得出该重组蛋白降解CMC的最适温度为50°C。关于重组蛋白的温度 稳定性研究结果表明，重组蛋白在70°C处理6 h后仍保留51%的相对酶活，其在50°C、60°C 和70°C的半衰期分别为12. 6、7. 6和6. I h。
[0059] 实施例7部分金属离子对重组蛋白降解CMC活性的影响 在本实施例中，重组蛋白对CMC的降解活性测定方法为： 使用添加了 〇. l%(w/v)CMC底物的50 mM PBS缓冲液（pH 9. 2)，反应起始于添加18. 2 U/mL的重组蛋白溶液，在50°C反应15 min后，用两倍体积的DNS溶液终止，煮沸5 min后， 取200 μ L体积的混合液，测OD54tl，金属离子对重组蛋白降解CMC活性的影响如表1所示。
[0060] 表 1
【权利要求】
1. 一种碱性纤维素酶基因，其特征在于，与SEQ ID NO: 1所示序列杂交或与SEQ ID NO: 1所示序列具有90%以上同源性，且编码与纤维素降解相关蛋白的DNA分子。
2. 权利要求1所述的碱性纤维素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID N0:1所 /_J、1 ο
3. -种根据权利要求1所述的碱性纤维素酶基因编码所获得的多肽。
4. 一种具有耐碱内切葡聚糖酶活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
5. -种重组表达载体，其特征在于，由出发载体的多克隆位点插入权利要求1所述SEQ ID NO: 1所示序列构建而成。
6. -种转基因细胞系，其特征在于，含有权利要求1或2所述碱性纤维素酶基因。
7. -种重组菌，其特征在于，含有权利要求1或2所述碱性纤维素酶基因。
8. -种碱性纤维素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
51. 获得权利要求1或2所述碱性纤维素酶基因的序列；
52. 将S1所述的序列克隆到表达载体；
53. 将S2构建的表达载体转入宿主细胞，得到可生产碱性纤维素酶的基因工程菌；
54. 培养基因工程菌，得到碱性纤维素酶。
9. 权利要求3或4所述多肽在纤维素分解方面的应用。
10. 权利要求3或4所述多肽在纺织或洗涤剂领域的应用。
【文档编号】C12N9/42GK104278045SQ201410451018
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】李刚, 肖月 申请人:中山大学