专利名称：：铃铛刺DREB转录因子cDNA序列及其表达载体和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种与植物抗逆性相关的cDNA序列及其编码的转录因子，尤其涉及从沙生植物铃铛刺(泡"770ofe/3rfro/7力a7oofe/^rw7V.)中所分离、克隆的编码DREB转录因子的cDNA序歹U，本发明还涉及含有该cDNA序列的植物高效表达载体以及它们在提高植物抗逆性中的应用，属于植物基因工程领域。技术背景干旱、盐碱和低温是影响陆生植物生长和限制作物产量的三种主要的非生物胁迫因子。据统计，世界干旱半干旱地区涉及50多个国家和地区，约占全球陆地面积的34.9%。目前全世界用于农业的57亿公顷可耕旱地中，约70%的耕地由于干旱等因素导致土质退化，亚洲受此影响的土地面积最广，近14亿公顷。而我国的干旱、半干旱地区约占国土面积的一半以上，年受旱面积达200-270万公顷。其危害相当于其它自然灾害之和。此外，世界盐碱地占全球陆地面积的7.6%，随着工业化进程加快，我国的土壤盐渍化面积不断扩大，目前盐渍化土壤面积约有2600万公顷，其中盐碱耕地约有670万公顷，严重制约了农业对土地的利用。低温作为经常发生且危害严重的逆境因素之一，它不仅影响着植物的季节性生长，也影响着植物的地理性分布。据统计，我国每年因冻害造成的农业损失高达数十亿元，这些非生物胁迫对农业生产、生态建设、可持续发展战略有着直接或间接的危害作用。干旱、盐碱和低温等非生物逆境都会构成对植物的渗透胁迫，致使环境渗透势低于植物细胞渗透势而导致植物细胞失水，严重的可造成细胞膨压完全丧失，甚至导致植物死亡。当然，植物为了适应环境，在长期演化过程中也形成了复杂而精细的调节机制，提高了自身对不良环境胁迫的抵抗或忍耐能力，以适应不良环境。铃铛刺(Ha//wo￡fe"*ow/2a/0&m/rawV.)系豆科铃铛刺属中抗旱抗盐性极强的灌木。集中分布于新疆塔克拉玛干沙漠和内蒙古巴丹吉林沙漠和甘肃民勤等地，国外原苏联，蒙古也有。降雨量在130mm以下的干热荒漠区及地下水浅的地方均可生长。铃铛刺系含高蛋白质放牧用豆科植物，是荒漠牲畜骆驼和羊的喜食牧草，可做改良盐碱土和固沙植物，并可栽培做绿篱。铃铛刺具有极强的抗旱耐盐碱、防风、固沙、改良土壤等能力，能够在极度干旱缺水的环境中生长除了其形态学上的部分特点外，更主要的是由于沙生植物在长期生长进化过程3中形成了其特有的基因构成及精密的表达调控方式，能够合成并保持较多的抗旱抗渗透胁迫保护物质，体内存在着丰富的高抗性基因资源。因此，从沙生植物铃铛刺中克隆与抗逆性紧密相关的基因，不仅能为基因工程育种提供优良基因源，而且对于作物抗逆育种显得尤为重要和迫切。转录因子(transcriptionfactor,TF)也称反式作用因子，是指能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过他们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录。自从1987年Paz-Ares首次报道玉米转录因子基因的克隆以来，相继从高等植物中分离出的调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种。拟南芥基因组测序已经完成，据推测，至少有1553个编码转录因子的基因，约占其估计基因总数的5.9%。拟南芥中转录因子数量如此之大，种类之多，表明了高等植物转录调控的复杂性，同时也表明转录因子研究的重要性。DREB转录因子(DehydrationResponsiveElementBindingProtein),即干旱应答元件结合蛋白，是一类和植物脱水条件下的抗逆性反应有关的、在信号传递和调控基因表达中起作用的转录因子，能特异结合DRE/CRT顺式作用元件，并激活下游目的基因的转录。到目前为止，已经从多种植物中克隆分离到上百种DREB转录因子，包括单子叶植物和双子叶植物，并且DRE/DREB顺式作用元件与反式作用因子相互作用的调控模式已经在草本植物种发现并被证明，如拟南芥、小麦、黑麦草、番茄、玉米、大麦、水稻等。但是目前尚未见到从沙生植物、尤其是野生灌木类沙生植物铃铛刺中克隆到相关基因的报道。目前，植物抗逆基因工程的研究取得了一定进展，但是其重点均在导入个别功能基因来提高某种抗性，从而达不到使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。植物的抗逆性并不是由单个或少数几个基因的表达来体现的，而是由多基因控制的数量性状。虽然目前己陆续从各种植物中克隆出大量的抗逆相关基因，但这些基因大多数只能增加植物的某种单一抗性，并不能从整体上综合提高植物的抗逆性。转录因子作为功能基因表达的调节开关，可以对不同的基因进行精确的调节，在植物逆境信号传递过程中发挥着关键的作用，所以通过增强某个转录因子的作用，可促使多个与抗逆有关的功能基因表达，这是使植物抗逆性状获得综合改良的一条非常有效的途径。DREB正是这一类的转录因子，在胁迫信号传递过程中起重要作用，它可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达，从整体上增强植物的抗逆性，提高其稳定性，对于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潜在应用价值，并将有巨大的应用前景。因此，克隆新的具有自主知识产权的DREB类转录因子基因，研究其基本的生物学特性和功能，将为整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，为改良作物抗逆性、创造新的抗逆材料提供物质基础。综上所述，对于一个水资源紧缺、盐渍化土壤面积不断扩大、耕地面积有限、人口众多的农业大国来说，克隆在植物抗逆过程中起重要作用的调控基因，对于农业的可持续发展具有重要意义。
发明内容本发明目的之一是提供一类从沙生植物铃铛刺(^fo"mo&"^ow力a/orfewJrawV.)中所分离、克隆的与抗逆性紧密相关的编码DREB转录因子的cDNA序列。本发明目的之一是通过以下技术方案来实现的一种从沙生植物铃铛刺中所分离、克隆的与抗逆性紧密相关的编码DREB转录因子的cDNA序列，该cDNA序列为以下(a)或(b)所示的碱基序列(a)SEQIDNO:1所示的碱基序列；或(b)将SEQIDNO:1所示的碱基序列一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的碱基序列，该碱基序列所编码的蛋白仍具有DREB转录因子的功能或活性。本发明根据植物中基因DNA结合域保守区设计了简并引物，利用RT-PCR方法从沙生植物铃铛刺中分离到Di^石2基因的同源片段，然后通过RACE-PCR技术克隆得到新的DREB2转录因子基因(SEQIDNO:1)，并对其进行了序列分析和蛋白的三维结构预测，结果显示该基因具有DREB转录因子所特有的三个功能结构域，即核定位信号、DNA结合域和转录激活域。序列比对表明该cDNA序列和其它已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性外，在其它区域的序列同源性不高。通过构建植物DREB转录因子的系统进化树分析发现该HhDREB2蛋白主要与DREB2类转录因子聚在一起，并且与双子叶植物的DREB2类转录因子的亲缘关系更近；分别以基因组DNA和cDNA为模板对HhDREB2进行PCR扩增，扩增产物经序列分析表明，该cDNA序列不含内含子；通过半定量RT-PCR对其组织特异性表达进行检测，结果显示该cDNA序列在铃铛刺的根、茎、叶中均有表达；通过半定量RT-PCR对其在不同的胁迫条件下进行胁迫反应检测，结果显示该cDNA序列的表达受干旱、高盐和低温环境逆境的诱导，并且其表达不依赖于ABA的调控。本发明目的之二是提供一类由上述cDNA序列所编码的铃铛刺DREB转录因子。本发明目的之二是通过以下技术方案来实现的5一类由上述cDNA序列所编码的铃铛刺DREB转录因子，为以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有DREB转录因子功能或活性的氨基酸序列。优选的，本发明所述的铃铛刺DREB转录因子为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。上文中所述的"多个"通常意味着28个，优选为24个，这些取决于DREB转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的"替换"是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的"缺失"是指氨基酸序列数量的减少，即分别剔除一个或多个氨基酸残基；所述的"插入"是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。本发明还涉及可以在植物中高效表达所述DREB转录因子cDNA序列(SEQIDNO:1)的植物表达载体。将所述DREB转录因子cDNA序列插入到植物表达载体合适的限制性酶切位点之间，可操作的与表达调控序列相连接，就可得到在植物中表达该cDNA序列的植物表达载体。例如，该植物表达载体可以由5'非编码区、SEQIDNO:l所示的cDNA序列以及3'非编码区所组成，其中，所述的5'非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子序列可以是组成型、诱导型、组织或器官特异性诱导子。所述的3'非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等；SEQIDNO:1所示的cDNA序列可通过将其一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的碱基序列所替换，该碱基序列所编码的蛋白仍具有DREB转录因子的功能。作为本发明的一个最优选的实施方案，所述的高效植物表达载体是pC13rd29A-HhDREB2。本发明还涉及包含上述植物表达载体的植物细胞。转录因子通过与下游基因启动子区域的顺式元件结合可以调控一系列相关功能基因的表达，在植物抗性分子育种中，导入转录因子基因能有效地提高转基因植物的抗逆性。因此，可以将本发明DREB转录因子cDNA序列应用于提高植物的抗逆性。例如，可以将含有该cDNA序列的植物表达载体导入到植物细胞中，培育筛选得到对环境胁迫的抗性提高了的转基因植株，其中，所述的环境胁迫可以是干旱、高盐或低温等逆境。为了进一步分析本发明〃力ZVffi^转录因子基因的功能，本发明首先构建得到含有/ftZW^H基因(SEQIDNO:1)的植物高效表达载体pC13rd29A-HhDREB2，利用农杆菌介导将阳性苗，对转基因拟南芥苗进行干旱、高盐及低温等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定，通过测定生理生化指标得出，转基因植株的含水量、丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量高于对照，这些渗透调节物质的大量积累有助于减少渗透胁迫和干旱胁迫对植物的伤害，成为转基因植物抗渗透能力和抗旱能力提高的重要生化证据，也进一步说明过表达本发明说ZW^5i"基因可提高转基因植物的抗旱性和渗透胁迫抗性，以维持植株正常的生理生化功能。本发明DREB转录因子对一系列抗逆功能基因的转录以及对脯氨酸和糖含量的促进作用说明本发明DREB因子在植物抗逆反应中起着重要作用。图1简并PCR扩增结果。图23'RACE-PCR扩增结果。图35'RACE-PCR扩增结果。图4HhDREB2cDNA全长序列得扩增结果。图5HhDREB2蛋白的三维空间结构预测。图6HhDREB2氨基酸序列的系统进化树分析结果图7HhDREB2基因的基因组DNA结构分析。图8HhDREB2基因的组织特异性表达分析结果图9不同胁迫处理下HhDREB2基因的表达模式分析。图10表达载体pC13rd29A-HhDREB2的构建流程图。图ll重组质粒pC13rd29A-HhDREB2菌落PCR扩增结果。图12重组质粒pC13rd29A-HhDREB2的酶切结果；1,质粒pC13rd29A-HhDREB2，2.Ba附i/I单酶切；2，5am/H和5^五n双酶切。图13含有表达载体pC13rd29A-HhDREB2的农杆菌C58C1的菌落PCR;CK+:连接有目的基因的pMD19-T(阳性对照)，CK-:农杆菌C58C1(阴性对照)。图14转基因拟南芥的Hyg抗性筛选图15转基因拟南芥的DNA水平的PCR检测；CK+:连接有目的基因的pMD19-T(阳性对照)，CK-:野生型拟南芥基因组DNA(阴性对照)。图16转基因拟南芥的半定量RT-PCR检测；CK+:连接有目的基因的pMD19-T(阳性对照)，CK-:野生型拟南芥cDNA(阴性对照)。图17转基因拟南芥的抗旱性分析。图18转基因拟南芥的耐盐性分析。图19转基因拟南芥的耐低温分析。图20干旱对植株含水量的影响。图21高盐对植株含水量的影响。图22干旱对丙二醛含量的影响。图23高盐对丙二醛含量的影响。图24干旱对叶片可溶性糖含量的影响。图25高盐对叶片可溶性糖含量的影响。图26干旱对叶片脯氨酸含量的影响。图27高盐对叶片脯氨酸含量的影响。具体实施例方式以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版，j.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒产品说明书进行操作。实施例l铃铛刺DREB转录因子OZ/LDi^万2)基因的分离、克隆1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料培养及胁迫处理铃铛刺(i/a/Zmo^fe"draw/w/o&m/raM)种子采集于新疆塔里木河流域。用250rnM的NaCl将水培4周的铃铛刺幼苗进行浸根处理3h、6h，采集叶片立即用液氮处理，保存于-80'C超低温冰箱中备用。材料的不同胁迫处理分别用250mM的NaCl、20%PEG6000、100pM的ABA溶液、IOO^iM的GA3溶液、lOOpM的BA溶液、lOO)aM的NAA溶液对水培4周的铃铛刺幼苗进行浸根胁迫处理，以及置于4'C培养箱中进行低温处理，分别在处理0、1、3、6、12和24小时取材，将处理后的材料迅速用液氮冷冻，于-8(TC超低温冰箱中保存备用。1.1.2菌株与质粒大肠杆菌CEsc/ie".c/n'aco&):DH5a本室保存pMD19-T克隆载体购自TaKaRa生物公司1.1.3酶与试剂TRIzol总RNA提取试剂购自北京康润诚业生物科技有限公司；SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase及GeneRacerkit购自Invitrogen公司；pMD19-T载体及限制性内切酶、Taq酶等常用酶类购自宝生物公司；EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均购自北京全式金生物技术有限公司。1.1.4溶液1.TE(pH8.0):10mmol/LTris-HCl;lmmol/LEDTA(pH8.0)2.50XTAE(1L):Tris242.0g;冰醋酸57ml;0.5mMEDTA100ml(pH8.0)3.lMTris-HCl(pH8.0，500ml):Tris60.6g;水400ml;浓HCl21.0mll丄5培养基1丄5.1LB液体培养基(1L,pH7.4):蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g,NaC110.0g1丄5.2LB固体培养基(1L，pH7.4):蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g,NaCllO.Og，琼脂粉15.0g1.1.5.3B5培养基(1L,pH5.8)1.B5液体培养基(1L):lt备液I50ml贮备液II5ml贮备液III5ml贮备液IV5mlCa盐50ml铁盐5ml2.贮存液I(IL)NH4N0333000mgKN0338000mgMgS047H207400mgKH2P043400mg3.贮存液II(IL)KI166mgH3B031240mgMnS044H204460mgZnS047H201720mgNa2Mn042H2050mgCuS045H205mgCoCl26H205mg4.贮存液III(IL)FeS047H205560mgNa2-EDTA2H207460mg5.贮存液IV(IL)肌醇20000mg烟酸100mgVB6100mg100mg甘氨酸400mg6.钙盐(IL)CaCl22H208800mg1.2实验方法1.2.1铃铛刺总RNA的提取(TRIzol法)按照TRIzol法提取铃铛刺的总RNA;1.2.2第一链cDNA的合成(按Invitrogen公司反转录试剂盒说明书进行)1.预变性以铃铛刺总RNA为模板，以Oligo-dT为引物(工作浓度为10pmol4d)。反应体系如表2-l，混匀后，65。C变性5min，立即置于冰上l-2min;表1RNA预变性体系成分用量TotalRNAlOng-l昭Oligo-dTPrimer(lOpmo,)1単dNTPs(10mMeach)l単DEPCH20XTotal13(^12.反转录向上述离心管中加入表2中所列成分后混匀，42°Clh;70。C下15min灭活反转录酶；表2反转录体系10成分3.RNaseH消化向反应液中加入lpl(2U4U)的RNaseH，37。C20min，消化与cDNA结合的单链RNA,-20'(3冰箱保存反转录产物。1.2.3DREB转录因子家族基因同源片段的克隆1.2.3.1引物的设计与合成利用DNAMAN软件对GENBANK中已公布的相关科属植物Z>i^52类基因的氨基酸和核苷酸序列进行同源分析，然后，根据Oi^S基因DNA结合域保守区设计合成一对简并引物(表3)。表3简并PCR中使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1.2.3.2RT-PCR根据植物中DifE万2基因DNA结合域保守区设计的一对简并引物SP1和ASP2，以用250mMNaCl处理3h和6h的叶片为材料提取总RNA进行RT-PCR，PCR条件为94°C5min;94°C30sec,50°C30sec,72°C30sec,30个循环；72°C10min。反应结束后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。1.2.3.3PCR产物的回收采用北京全式金生物技术有限公司的EasypurePCRPurificationkit回收目的片段，按照试剂盒说明书的方法进行操作。1.2.3.4目的片段与克隆载体的连接将回收的PCR产物连接至pMD19-T载体上，连接反应体系如表4，16'C连接过夜。_表4连接反应体系_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>LigationMixTotal1.2.3.5大肠杆菌感受态的制备参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。1.2.3.6大肠杆菌的转化(热激法)参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。1.2.3.7菌落PCR鉴定以含有Amp的LB平板上挑取的白色单菌落，转入lmlLB(Amp+)液体培养基中，37°C，200rpm摇菌2h，分别吸取1^1菌液作为模板，进行菌落PCR鉴定，弓l物为SPl和ASP2，扩增条件为94°C5min;94°C30sec,50°C30sec，72°C30sec,30个循环；72°C10min。反应结束后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。1.2.3.8重组质粒的核苷酸序列测定将菌落PCR阳性的菌落转入含Amp的LB液体培养基，37'C下200ipm过夜培养，制备成甘油菌，送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序。1.2.4铃铛刺Zyffi)9基因的3'cDNA的克隆1.2.4.1引物的设计与合成根据已获得的Di^5基因的同源片段，设计1对3、RACE的巢式基因特异引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成，见表5。_表53'RACE反应中使用的引物_引物编号引物序列3HDGSP15，-TATTCTACCTCAGAGGTCCTTCGGC-3'3HDGSP25'-TACCTCAGAGGTCCTTCGGCTC-3,QT5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24-3'Ql5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'_^_5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'_1.2.4.2铃铛刺总RNA的提取以铃铛刺叶片为材料提取总RNA，提取方法同1.2.1。1.2.4.3第一链cDNA的合成方法同1.2.2。1.2.4.4巢式PCR扩增3'-端cDNA1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，用基因特异引物3HDGSP1与通用5,0^110nl°C5min;94°C45sec,60°C45sec,72°Clmin,30个循环；72°ClOmin;4。C保存。2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，用基因特异引物3HDGSP2与通用引物Q2进行第二轮巢式PCR，反应参数94°C5min;94。C45sec,63。C45sec,72°Clmin,30个循环；72°C10min;4"C保存。3.0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5cc，利用a互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.5巢式PCR扩增5'端cDNA1.2.5.1引物的设计与合成根据已获得的3'-端cDNA序列设计1对巢式基因特异引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成，见表6。表65'RACE反应中使用的引物引物编号引物序列5HDGSP15'-GAACCCAACCAAATCCTTGACCT-3'5HDGSP25'國AAATTGAGGCGAGCCGAAGGAC-3'GensRac6r5'primer5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'GeneRacer5"Nestedprimer5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3"1.2.5.2第一链cDNA的合成(按照Invitrogen公司GeneRacerkit试剂盒说明进行)1.去磷酸在PCR管中加入下表所列成分混匀，离心，50'C条件下处理lh后，离心，置于冰上l-2min。_表7去磷酸化反应体系_成分TotalRNA(l-5ng)IOXCIPBufferRNaseOut(40U/(il)CIP(10U/pl)Total7|oll牟l牟l.Onl10nl2.RNA纯化参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。3.去帽在PCR管中加入下表所列成分混匀，瞬间离心，37'C条件下处理lh后，瞬间离心，置于冰上l-2min。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4.RNA纯化方法同步骤2。5.RNA接头序列的连接1)将经去磷酸化和去帽处理的RNA转入另一PCR管中，加入RNA接头片段，轻轻混匀，离心；2)65°C,5min，冰浴2min，离心；3)在PCR管中加入表9所列成分混匀，离心，37'C条件下处理lhr后，离心，置于冰上l-2min。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>6.RNA纯化方法同步骤27.反转录方法同1.2.2。1.2.5.3巢式PCR扩增5'-端cDNA1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，分别用基因特异引物5HDGSP1与GeneRacer5'primer进行第一轮PCR，反应参数94°C5min;94°C30sec,60°C30sec，72°Clmin,30个循环；72°C10min;4。C保存。2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，用基因特异引物5HDGSP2与GeneRacer5'Nestedprimer进行第二轮巢式PCR，反应参数94°C5min;94°C30sec,62。C30sec,72°Clmin,30个循环；72°C10min;4'C保存。3.0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5oc，利用a互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.6Di五5基因cDNA全长扩增1.2.6.1引物的设计与合成拼接已知的3'-端和5'-端cDNA序列，获得cDNA全长序列，据此，设计基因特异引物，扩增D/^S基因的cDNA全长序列，所用引物见表IO。1.2.6.2第一链cDNA的合成方法同1.2.2。表10cDNA全长序列扩增所使用的引物引物编号引物序列HDREB15'-GTTTTGAAGAAAGATTATCAC-3'HDREB25'-AGTTTAGCGACTCAGGTGGA-3'1.2.6.3Di^S基因cDNA全长序列的克隆及生物信息学分析1.以QT引物反转录获得cDNA为模板，利用基因特异引物HDREB1与通用引物Ql配对,进行第一轮PCR，反应参数94°C5min;94。C30sec,64°C30sec，72'C2min,30个循环；72。C10min;4。C保存。2.将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，利用基因特异引物HDREB2和与通用引物Q2配对，进行第二轮巢式PCR，反应参数94°C5min;94'C30sec,60°C30sec，72。C2min,30个循环；72'C10min;4'C保存。3.0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5a，利用cc互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。4.利用DNAMAN软件进行序列比对和分析；利用SMART(http:〃coot.embl-heidelberg.de/SMARTZ)分析///D/^S2基因的结构域；利用CPHmodels-2.0服务器分析预测HhDREB2蛋白的三维空间结构0ittD:〃ge加me.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0Server-3D.htm);禾i」用ScanProsite月艮务器(http:〃www,expasY.org/cgi-bin/prosite)分析///tD及五52基因的结构功能位点。1.2.7DNA序列的扩增及分析1.2.7.1引物的设计与合成根据已获得的m"i^W基因的cDNA序列，分别在基因5'-端和3'-端设计基因特异引物，所用引物见表ll。表llDi^5基因的基因组扩增所使用的引物引物编号引物序列GnHD(F)5'-AGTTTAGCGACTCAGGTGGA-3'GnHD(R)5'-CGATTATCTAGGCTCAGGCA-3'1.2.7.2铃铛刺基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法提取铃铛刺基因组DNA。1.2.7.3PCR扩增以铃铛刺基因组DNA为模板，以基因特异引物GnHD(F)和GnHD(R)进行PCR扩增，反应参数分别为94。C5min;94。C30sec，60。C30sec,72。Clmin，30个循环；72。C10min;0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH-5ot，利用oc互补及菌落PCR筛选阳性克隆，测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.8Di^5基因的组织特异性表达1.2.8.1总RNA提取分别提取水培4周铃铛刺幼苗的根、茎、叶的总RNA，提取方法同1.2.1。1.2.8.2引物的设计与合成利用DNAMAN软件对GENBANK中已公布的豆科植物肌动蛋白基因的保守区进行同源性分析，以大豆Actin(U60506)为内标基因，设计肌动蛋白基因特异引物Actin-F和Actin-R;根据已得到的i)i^基因cDNA序列，在基因的非保守区设计基因特异引物，所用引物见表12。表12i)i^5基因在胁迫下的表达分析所使用的引物引物编号引物序列HDRT(F)5'-GGCGGTTATGATGGAAGAAGA-3'HDRT(R)5'-GAAGAGCGGTTTGGATAGCAT-3'Actin-F5'-CAACCTTAATCTTCATGCTG-3'Actin-R5'-AGCAACTGGGATGACATGGAG-3'1.2.9Di^5基因在不同胁迫条件下的表达谱分析1.2.9.1引物的设计与合成16同1.2.8.2。1.2.9.2DREB转录因子基因对不同激素条件胁迫的应答将水培4周的铃铛刺幼苗分别插入含有IOOpM的生长素/萘乙酸/NAA溶液、100uM的细胞分裂素/6—苄基氨基嘌呤(BA)溶液、100UM的赤霉素(GA3)溶液以及lOOuM的脱落酸(ABA)溶液中进行不同激素胁迫处理；分别提取处理0、1、3、6、12和24小时的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以肌动蛋白基因为内标基因，利用基因的特异引物HDRT(F)和HDRT(R)进行RT-PCR扩增，Actin扩增参数94。C5min;94°C30sec，60'C30sec,72'C45sec，28个循环；72°C10min;基因非特异片段扩增参数94°C5min;94°C30sec，58°C30sec,72°C30sec,28个循环；72°ClOmin;检测基因的表达变化。1.2.9.3DREB转录因子基因对干旱、高盐及低温胁迫条件的应答将水培4周的铃铛刺幼苗分别插入含有250mM的NaCl溶液、20%PEG6000溶液以及置于4t培养箱中进行高盐、干旱以及低温胁迫处理。分别提取处理O、1、3、6、12和24小时的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以肌动蛋白基因为内标基因，利用基因特异引物HDRT(F)和HDRT(F)进行RT-PCR扩增，反应参数同1.2.9.2;检测i7/LD/^52基因的表达变化。2实验结果与分析2.1/^￡5基因同源片段的获得对己报道的DREB2蛋白序列进行了同源比对分析，发现DREB2蛋白的DNA结合域的氨基酸序列在不同植物、不同DREB2家族中都呈现出高度保守的特性，因此利用该保守区域进行了简并引物的设计，以叶片总RNA反转录获得的cDNA为模板，通过简并PCR扩增出约280bp的目标带(图l)，与预期大小一致。将回收的PCR产物连接至pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH-5a，利用oc互补及菌落PCR筛选出6个阳性克隆，测序后得到1条282bp的序列。序列检索结果显示，与大豆、陆地棉及拟南芥的/^fi^基因核苷酸序列具有较高的一致性，初步判断该片段为铃铛刺"7ffiS基因保守区。2.2Z必59基因cDNA3'序列和5'序列的获得经序列比对，利用已获得的ZW^^基因同源片段，设计基因特异引物；利用基因特异引物3HDGSP1和3HDGSP2分别与3'通用引物Ql、Q2进行3'RACE扩增，电泳检测，得到1条约530bp扩增产物(图2)，测序结果表明，该片段为532bp,且5'端序列有149bp与原同源片段部分重叠，判断为目标WffiS基因的3'端序列。利用特异引物5HDGSP1和5HDGSP2分别与GeneRacer5'Primer和5'NestedPrimer进行5'RACE扩增，电泳检测得到1条约450bp的扩增产物(图3)，测序结果表明，该片段为373bp,且3'端序列有165bp与原同源片段部分重叠，判断为目标2W^9基因的5'端序列。2.3M，朋基因cDNA全长序列的获得利用基因全长特异引物HDREB1和HDREB2分别与3'通用引物Ql、Q2，巢式PCR获得1条约800bp扩增产物条带(图4)。测序结果表明，其全长序列为873bp，序列比对结果显示，与多种植物Di五5家族的基因有较高相似性,推断为新的Z)ii^基因，命名为//W)i^5入2.4铃铛刺Z)iEScDNA全长序列分析2.4.1Di^B基因的序列特征分析及编码蛋白的结构功能预测利用DNAMAN软件对ZfADi五S2基因的全长cDNA序列进行分析，结果表明i/ZzZ^五52基因序列全长为873bp，完整开放阅读框519bp，编码172个氨基酸。该蛋白含有一个典型的AP2/EREBP结构域，该结构域由59个氨基酸组成，其中第14位为保守的缬氨酸，而第19位为谷氨酸，属于DREB基因家族。经PSORT分析预测该蛋白定位于细胞核，判断为典型的DREB转录因子。2.4.2DREB蛋白的三维空间结构预测利用CHPmodels-2.0(http:〃genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0server)服务器来预测DREB2蛋白的三维空间结构(图5)，结果显示DREB2蛋白的空间结构中具有1个ot-螺旋，3个P-折叠组成，这是一个典型的DREB转录因子所具有的空间结构，这从蛋白所具有的空间结构的角度证明了该基因所编码的蛋白是DREB类转录因子。2.4.3HhDREB2蛋白与其它DREB2类蛋白的同源性比对及系统进化树分析植物中的DREB类基因可以分为两大类，一类是由低温诱导的DREB1类转录因子；另一类是由干旱、高盐环境胁迫诱导的DREB2类转录因子。通过DNAMAN软件对铃铛刺//M)i五52基因与其它已经克隆的DREB基因进行系统进化树分析，结果表明i/Z^及五B2基因主要与DREB2类转录因子聚在一起，并且与双子叶植物的大豆DREB2类转录因子的亲缘关系更近。因此，将克隆到的DREB转录因子基因丑/tDJ^S2与植物中的DREB2类转录因子进行同源性比对分析，序列比对结果(图6)显示该转录因子基因全序列在蛋白水平上与其它植物DREB2类蛋白的同源性不高，一致性约为26.23%，仅在AP2/EREBP结合域中有高度保守性。并且发现DREB类转录因子第14位的缬氨酸(V14)非常保守，而第19位的氨基酸并不保守，有的为谷氨酸(E19)，有的为亮氨酸(L19)。进一步证明在DREB相关蛋白中决定DNA结合特异性方面，V14的作用明显要比El9和L19重要。2.5铃铛刺ZfM)i五52基因的基因组DNA结构分析以铃铛剌基因组cDNA和DNA为模板，以GnHD(F)与GnHD(R)为引物进行PCR扩增，得到2条约750bp的扩增产物；经回收测序表明，这2个条带均为762bp、762bp。测序结果分析显示，///LDi^S2基因无内含子(图7)。2.6Z)i^B基因的组织特异性表达分析分别提取铃铛刺的根、茎、叶的总RNA，提取方法同1.2.1。利用半定量RT-PCR对//M)i^52基因在不同组织中的表达情况进行了检测，结果该基因在根、茎、叶中均有表达，在叶中的表达量较根和茎中高，由此可见该基因的表达均无明显的组织特异性。(图8)。2.7Z)i^5基因在不同胁迫条件下的表达模式分析对H/LDi^万2基因在不同胁迫条件下进行表达模式分析(图9)，结果显示i7/LDi^52对高盐、干旱和低温均有应答。用250mMNaCl高盐溶液处理后在1小时///lD7^B2基因表达开始积累，3h后达到峰值，随后又逐渐减弱；干旱处理lhi/AZ)i^52基因开始表达，6h后表达量达最大；由实验结果可以明显看出，该基因对低温也具有应答反应，并且低温处理6h时达到峰值，而用激素处理时发现，NAA、GA3和BA对iZ/i)i^52基因的表达无明显影响，此基因对外源ABA无应答反应。综上所述，W/ld/^52基因能被高盐、干旱和低温所诱导表达，并且这种诱导作用并不依赖于ABA信号调节途径。禾拥生物学软件对说i)i^52基因进行分析，发现该基因的AP2/EREBP结构域中的第14位存在着已被证实与DRE顺式作用元件具有特异性结合机制的功能性氨基酸，即缬氨酸(14V)。而第19位均为亮氨酸，并非谷氨酰胺，这也充分说明19位氨基酸的非保守性，进一步证明在DREB相关蛋白中决定DNA结合特异性方面，V14的作用明显要比E19和L19重要。此外，根据植物DREB受不同条件的诱导表达，植物中的DREB类转录因子可分为DREB1和DREB2两种类型。对不同植物DREB转录因子亲缘关系的分析表明，HhDREB2被归类在双子叶植物的DREB2转录因子类中，与大豆的GmDREB2关系最近。研究表明，在DREB转录因子的C-端一般存在一个转录激活域，它们以富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸或丝氨酸和苏氨酸为特征，此结构域是激活目标基因转录所必须的。在i7/^i^52转录因子基因C-端具有明显的转录激活域，说明该转录因子蛋白具有转录激活功能。同时说明HhDREB2蛋白中的丝氨酸富集区通过位点的磷酸化作用分别调控蛋白的DNA结合域对DRE元件的结合能力和酸性激活域的转录激活能力。19试验例1含有铃铛刺//力/W^Si"基因的植物高效表达载体的构建及在拟南芥中的相关功能验证2材料与方法2.1材料2.1植物材料拟南芥哥伦比亚生态型(Columia-0)，由中国农业科学院生物技术研究所梁华老师赠送。2.1.2菌种及载体大肠杆菌CB.co/!')DH5a，由本实验室保存；农杆菌Ugra6a"en'wm^me/ade/w)菌株C58C1，由中国农业科学院作物科学研究所马有志研究员赠送；双子叶植物表达载体pCAMBIA-1302(说明双子叶植物表达载体pCAMBIA-1302为常用植物表达载体，在NCBI上可以査到其全序列)，由中国科学院植物研究所沈世华研究员赠送；rd29A启动子序列参见文献(杨春霞.拟南芥逆境诱导型启动子rd29A的克隆及活性检测[J].2008年；南京林业大学学报)。pMD19-T克隆载体，购自TaKaRa。2丄3酶及化学试剂各种限制性内切酶、ExTaq酶购自Takara公司；T4DNALigase购自Promega;EasyTaq酶购自购自北京全式金生物技术有限公司；TRIzol总RNA提取试剂购自北京康润诚业生物科技有限公司；GentamicinSulfate、SilwetL-77购自Amresco;磺基水杨酸购自国药集团化学试剂有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)及三氯乙酸(TCA)购自北京化学试剂公司，其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。2丄4试剂盒EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均购自北京全式金生物技术有限公司；SUPERSCRIPTIIlReverseTranscriptase购自Invitrogen公司。2.1.5培养液l.YEB培养基参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；2丄B细菌培养基参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；3.MS培养基参见实用植物组织培养技术教程(甘肃科学技术出版社)曹孜义主编所列的具体方法；4.MS选择培养基MS基本培养基中加入潮霉素(30mg/L)2.2方法2.2.1引物设计与合成分别设计合成含有酶切位点《/wI和5flw/n的引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)、分别含有酶切位点5am/ZI禾卩5W五II的弓|物pC13rd29A-HhDREB2(F)和pC13rd29A-HhDREB2(R)，序列见表13。表13构建植物表达载体所用引物引物编号引物序列pC13rd29A(F)5'-CGGGGTACCACAAACTTACGAAAT-3'pC13rd29A(R)5'-CGCGGATCCCCAATAGAAGTAATC-3'pC13rd29A-HhDREB2(F)5'-ATAGGATCCACCATGATGGAAGAAGA-3'pC13rd29A-HhDREB2(R)5'-AGGGTCACCCATTATGAGAGGTATCT-3'2.2.2植物表达载体的构建2.2.2.1植物高效表达载体pC13rd29A-HhDREB2的构建参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法提取野生型拟南芥基因组DNA，以野生型拟南芥基因组DNA为模板，利用引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)进行PCR扩增，反应参数分别为94°C5min;94°C30sec,55°C30sec,72。Clmin,30个循环；72°C10min;0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMD19-T载体，反应体系同1.2.3.4，转化大肠杆菌DH-5cc，利用oc互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。利用引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)从连接有诱导型启动子rd29A的pMD19-T载体扩增出启动子全长，利用引物pC13rd29A-HhDREB2(F)和pC13rd29A-HhDREB2(R)从连接有全长///lD/^52cDNA的pMD19-T载体上扩增出完整的开放阅读框。扩增产物和载体均经相应的酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶，构建中间载体pC13rd29A与植物高效表达载体pC13rd29A-HKDREB2。2.2.2.2重组质粒转化大肠杆菌DH5a及菌落PCR鉴定参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法；2.2.2.3重组质粒的小量提取及酶切鉴定21参照北京全式金生物技术有限公司EasyPureMiniPlasmidPurificationKit所列的具体方法；2.2.3拟南芥的遗传转化2.2.3.1农杆菌C58C1电击感受态细胞的制备1.用接种针在YEB固体培养基平板上划线培养单菌落；2.挑取单菌落接种于5ml含适当抗生素的YEB液体培养基中，28°C、250rpm振荡培养过夜；3.按1:25-50接种于100ml含适当抗生素的YEB液体培养基中，继续培养4-6小时；4.将菌液冰浴30min，期间不断摇动；5.转入2个50ml离心管，4°C、4000rpm、lOmin;6.去上清，加入10-15ml灭菌蒸馏水，重悬沉淀，4°C、4000rpm、lOmin;7.去上清，加入10mllO。/。灭菌甘油，重悬沉淀，4°C、4000rpm、lOmin;8.重复第7步；9.去上清，用回流的甘油重悬沉淀；10.用0.5ml离心管分装，每管20pl，-80匸保存备用。2.2.3.2电击转化将连接有目的基因的质粒转化到农杆菌C58C1中1.取20nlC58Cl感受态细胞，加入0.5^1质粒混匀；2.340-360V电压电击转化；3.加入lmlLB液体培养基28°C、250rpm恢复培养3h;4.取50^1涂LB抗性平板(50mg/LKan，50mg/LRif，50mg/LGent)28。C培养2-3天。2.2.3.3含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定挑取LB平板上的单菌落，接种于5mlLB液体培养基(含50mg/LKan，50mg/LRif，50mg/LGent)中，28'C培养l-2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR鉴定。2.2.3.4拟南芥的培养1.种子处理取适量种子于1.5ml离心管中用70。/。的乙醇洗3min，无菌水洗3次，0.5%次氯酸钠(NaClO)洗10min，无菌水洗3次，均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用Vortex充分混匀；2.播种后MS平板于4'C春化3天；3.将MS平板放置于22光照培养箱培养；4.待小苗长出四片真叶后移栽至用MS液体培养基浇灌过蛭石中生长，保湿2-3天；2.2.3.5Floral-dip法转化拟南芥植株1.挑鉴定过的农杆菌单菌落，接种于5mlLB液体培养基中28'C、250rpm培养24h;2.按1:50转接，28°C、250rpm继续培养至OD4.53.0;3.室温离心，5000rpm、15min;4.用悬浮液悬浮菌体，180rpm慢慢将菌体摇匀；5.将已经交足水开花的拟南芥倒置，使花蕾朝下侵染液中42s;6.取出转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光照强度下生长24h后置于正常光照条件下直立生长培养；附悬浮液(灭菌蒸馏水，10mMMgCl2，5%蔗糖，0.3%Silwelt-77)。2.2.4转基因拟南芥的筛选2.2.4.1Hyg抗性苗的筛选将T。代收获的种子消毒(参考本实例2.2.3.4)，均匀撒播于含有Hyg抗性的MS平板上进行抗性筛选。2.2.4.2转基因拟南芥的DNA水平鉴定利用CTAB法小量提取在含有Hyg培养基中生长的拟南芥总DNA，通过PCR检测进一步筛选阳性拟南芥植株。若扩增出了目标片段，而阴性对照中没有扩增出片段，即初步证明目的基因整合到拟南芥基因组中。2.2.4.3转基因拟南芥的RT-PCR检测选择PCR确定的阳性转化株，剪取叶片，TRIzol提取总RNA，反转录获得cDNA作为模板，RT-PCR检测筛选阳性转化苗。方法参照实例1中的1.2.6.1-1.2.6.1;PCR反应参数94°C5min;94°C30sec,60°C30sec，72°C2min,30个循环；72°C10min;0.8%的琼脂糖凝胶电泳。2.2.5转基因拟南芥的耐胁迫分析用生长2周左右的的拟南芥植株进行非生物胁迫抗性鉴定，设三个重复l.耐旱鉴定将野生型植株与转基因型植株置于22°C光照培养箱中，控水处理4周；分别在0d、7d、14d取样，液氮处理后，置于-80°C保存；待处理4周之后，复水观察其生长状况。2.耐盐鉴定将250mM的NaCl溶液浇于栽有野生型和转基因型拟南芥的盆中，22°C光照培养箱中处理4周；分别在Od、7d、14d取样，用液氮处理后，置于-80°C保存；待处理4周后复水观察植株的生长情况。3.耐低温鉴定把转基因植株与野生型植株置于-6'C处理12h，转到fC适应2h后，转移到正常的生长条件下继续培养2周，观察植株的生长情况。2.2.6转基因拟南芥在逆境条件下的生理生化指标测定2.2.6.1胁迫处理完毕后，收取整株植株，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分。每个处理取6棵单株，并迅速测其鲜重，之后放入12CTC烘箱中烘烤30min，8(TC烘烤48h至恒重，称量其干重。对上述测得的干、鲜重，采用公式组织含水量(占鲜重％)=(鲜重-干重)/鲜重进行含水量的计算。2.2.6.2丙二醛(MDA)及可溶性糖的测定丙二醛的提取称取经逆境胁迫处理的植株叶片0.5g，加入少量石英砂和10%三氯乙酸4mL，研磨至匀浆，然后以4000ipm离心10min，其上清液即为丙二醛提取液，每个处理取6棵单株。显色反应及测定取若干干净试管并编号，各加入1mL的提取液，对照加lmL蒸馏水；然后再加入2mL0.6%硫代巴比妥酸溶液；摇匀，将混合液在沸水浴中反应15min,迅速冷却后低速离心；然后取上清液分别在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值。可溶性糖及MDA含量的计算C(糖)=11.7"A450(腿ol/L)C(MDA)=6.45*(A532—A600)—0.56*^50(,ol/L)公式中A450—在450nm波长下测得的吸光度值八532—在532nm波长下测得的吸光度值A6()o—在600nm波长下测得的吸光度值C糖、C(MDA)分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。2.2.6.3转基因植株脯氨酸含量分析脯氨酸的提取用液氮迅速研磨经不同处理的待测植株叶片，并转移至大试管中快速称重约0.3g(差量法)，然后向各管分别加入5mL3%的磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，在沸水浴中提取10min，提取过程中要经常摇动，冷却后低速离心，上清即为脯氨酸提取液，将上清转移至干净的试管中待测。脯氨酸含量的测定采用日立835-0200氨基酸自动分析仪对脯氨酸含量进行分析3实验结果与分析3.1植物表达载体的构建3.1.1表达载体pC13rd29A-HhDREB2的构建利用引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)从连接有全长启动子的pMD19-T载体上扩增出其全长。扩增产物和载体均经相应的酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶将W2A4连接至pCAMBIA1302相应的酶切位点，转化大肠杆菌DH5a，PCR扩增筛选重组质粒，并进行相应的酶切鉴定，构建中间载体pC13rd29A。利用引物pC13rd29A-HhDREB2(F)、pC13rd29A-HhDREB2(R)从连接有//M)i^52基因全长的pMD19-T载体上扩增出其的全长。扩增产物和中间载体均经相应的酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶将7/;^i^52连接至pC13rd29A相应的酶切位点，构建植物表达载体pC13rd29A-HhDREB2。构建过程见图10。3丄2重组质粒的菌落PCR鉴定在重组质粒的转化LB(Kan+)平板上，分别挑取三个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果/^Di^52有两个阳性，见图11。3丄3重组质粒的酶切鉴定将PCR检测的阳性菌落转入LB(Kan+)液体培养基，37。C摇菌过夜，EasyPureMiniPlasmidPurificationKit试剂盒小量提取重组质粒，进行酶切鉴定。pC13rd29A-HhDREB2重组质粒均被切出目标带，酶切结果正确，见图12。3.2含有表达载体的农杆菌PCR检测将重组质粒pC13rd29A-HhDREB2转化农杆菌C58C1，以转化后的农杆菌的菌液作模板，未转化的农杆菌作阴性对照，质粒做阳性对照，进行菌落PCR鉴定。检测结果表明，该重组质粒已成功转入农杆菌中，见图13。3.3转基因拟南芥的筛选与鉴定3.3.1Hyg抗性苗的筛选采用Floral-dip法转化拟南芥，收集转基因当代植株的种子(T,代)，在Hyg-MS培养基上筛选(图14)。野生型植株为黄花苗，不能正常生长，转基因植株在Hyg-MS培养基上能正常生长。播种后十三天将绿苗转入蛭石草炭土=3:1的培养土中继续培养。3.3.2转基因拟南芥的DNA水平鉴定25选取正常生长Hyg抗性苗，剪取其叶片，采用CTAB法提取其DNA，以拟南芥DNA为模板，以构建植物表达载体时设计的pC13rd29A-HhDREB2(F)和pC13rd29A-HhDREB2(R)引物为引物，采用PCR技术，对Hyg抗性苗进行DNA水平的检测。结果表明，检测pC13rd29A-HhDREB2转化的Hyg抗性苗26株，22株为阳性，阳性率84.6%，部分植株PCR检测见图15，证明/^i)i^万2已经整合到拟南芥基因组中。3.3.3转基因拟南芥的RT-PCR检测分别选取DNA水平鉴定的22株阳性拟南芥植株叶片为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果表明，22株pC13rd29A-HhDREB2转化的拟南芥植株叶片中，20株检测为阳性，阳性率90.9%，部分植株RT-PCR检测见图16。3.4转基因拟南芥的耐胁迫分析耐旱性分析结果转基因植株和野生型植株在正常生长条件下培养，但不浇水，4周后，发现野生型植株全部死亡，而/f/LDi^52转基因植株有60。/。存活，复水后继续生长，并正常结实，见图17。耐盐性分析结果转基因植株和野生型植株用250mM的NaCl溶液处理，4周后野生型植株全部死亡，统计结果表明H/LDi^52转基因植株，仍有36%存活下来，转移至生长条件下仍能生长，见图18。耐低温分析结果转基因植株和野生型植株在-6'C处理12h，发现野生型植株的叶片多数冻伤萎蔫，而转基因植株大多数仍然正常。转到4'C适应2h后，再转移到正常生长条件下培养，2周后统计成活率，野生型植株仅5%存活下来，然而表型出现生长缓慢，植株矮小；而H/LDi^52转基因植株有3P/。存活下来，并有部分植株正常开花结实，见图19。3.5转基因拟南芥在逆境条件下的生理生化指标测定3.5.1胁迫处理对植株含水量的影响表14转基因植株与对照干旱胁迫下植株含水量差异o天7天14天野生型植株含水量平均值92.3%87.5%82,1%转基因植株含水量平均值92.2%90.1%86.3%表15转基因植株与对照高盐胁迫下植株含水it差异o天7天14天野生型植株含水量平均值92.3%89.2%88.4%转基因植株含水量平均值92.1%90.2%89.6%已有研究表明，干旱和高盐逆境都可造成植物体的渗透胁迫，导致细胞失水，严重的可造成细胞膨压丧失，导致死亡。本实例通过测定胁迫条件下野生型与转基因型植株含水量的26变化，从而在个体水平上获得转基因植株较野生型植株抗逆性有显著提高的直接证据。结果显示，干旱(表14与图20)和高盐(表15与图21)处理后野生型和转基因植株的含水量都呈下降趋势。在胁迫处理前，转基因植株的含水量与野生型植株的含水量没有明显差异；当胁迫处理达到7d和14d时，转基因型植株的叶片含水量明显高于野生型植株的叶片含水量。这表明插入的外源基因^力ZW^H，对干旱和高盐胁迫下的细胞失水有了一定的缓解作用，从而提高了植株在胁迫下的耐逆性。3.5.2胁迫处理对植株MDA含量的影响表16转基因植株与对照干旱胁迫下植株MDA含量的差异(单位ymol/g)0天7天14天野生型植株MDA含量平均值0.0150.0220.025转基因植株MDA含量平均值0.014_0.0150.017表17转基因植株与对照高盐胁迫下植株MDA含量的差异(单位timol/g)0天7天14天野生型植株MDA含量平均值0.0150.0240.037转基因植株MDA含量平均值0.016_0.0210.017植物器官衰老或遭受逆境胁迫伤害时，往往会发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终分解产物，它的含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。表16与图22结果显示，随着干旱处理时间的增加，转基因和野生型植株的MDA含量都呈上升趋势，这表明干旱胁迫对转基因和野生型植株均造成了一定程度的伤害。但随着胁迫处理时间的增加，野生型植株MDA含量增加更为显著。其中干旱胁迫处理14d后，野生型植株的MDA含量比没有经过干旱处理的植株增加66.7%，而转基因型植株的MDA含量仅增加21.4%。T-test统计分析结果表明，干旱处理下转基因型植株的MDA含量显著低于野生型植株的MDA含量(p<0.05)。从表17与图23可以看出，盐胁迫处理可以极显著提高野生型植株的MDA含量(pO.Ol)。转基因型植株经7d盐胁迫处理后，MDA含量有所提高，但14d盐胁迫处理的植株的MDA含量反而要低于7d胁迫处理下植株的MDA含量。这可能是由于DREB转录因子的下游与盐胁迫以及抗氧化有关的信号分子产生了应答，从而降低了MDA含量。野生型和转基因型植株的MDA含量分析结果表明，转录因子在逆境胁迫下能够降低脂膜过氧化作用从而保证细胞内脂膜的完整性。这可能是由于F/LDi￡52下游信号与过氧化自由基抗性分子(如谷胱甘肽，过氧化氢酶，过氧化物酶等)相偶联，从而保护了细胞膜。3.5.3胁迫处理后植株可溶性糖含量的变化表18转基因植株与对照高盐胁迫下植株可溶性糖含量的差异(单位mmol/g)0天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0790.1140.142转基因植株可溶性糖含量平均值0.0760.1260.169表19转基因植株与对照高盐胁迫下植株可溶性糖含量的差异(单位mmol/g)0天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0780.0840.121转基因植株可溶性糖含量平均值0.0770.1050.130在胁迫的环境中，植物为了减缓由胁迫造成的生理代谢不平衡，细胞内大量积累一些小分子有机化合物。可溶性糖便是胁迫诱导的小分子溶质之一，通过渗透调节来降低水势，维持较高的渗透压，保证细胞的正常生理功能。从表18、图24和表19、图25可以看出，干旱胁迫和盐胁迫都能够使植株内可溶性糖含量增加。这说明植株在胁迫条件下会自发的产生相应的应答机制来抵抗逆境胁迫。但随着处理时间的增长，转基因植株可溶性糖含量的增加要高于野生型植株可溶性糖含量的增加。在干旱胁迫处理14d后，野生型植株可溶性糖含量是未经处理的1.79倍，而转基因型可溶性糖含量是未经处理的2.22倍。盐胁迫处理下可溶性糖含量也要显著高于野生型可溶性糖含量(p<0.05)。植株的可溶性糖含量分析结果表明，在逆境胁迫条件下，植物可以自发产生可溶性糖从而保证细胞体内正常的代谢过程。插入/f/^i^52转录因子的转基因植株，可以在逆境条件下产生更多的可溶性糖来抵抗逆境胁迫。3.5.4胁迫处理后脯氨酸含量变化表20转基因植株与对照高盐胁迫下植株脯氨酸含量的差异(单位mmol/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表21转基因植株与对照高盐胁迫下植株脯氨酸含i<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水和能力，其疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，使蛋白质可以借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫下蛋白质的脱水变性。因此，脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用。在正常的条件下，植物体内脯氨酸的含量并不高，但当遭受干旱、盐害等胁迫时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关，在一定程度上反映植物受水分和盐胁迫的情况，可作为植物抗逆性的一项生理指标。从表20、图26可以看出经7d干旱胁迫处理后野生型植株的脯氨酸含量有所上升，但是当14d干旱处理的植株的脯氨酸含量却低于7d处理。这可能是由于14d干旱处理后，野生型植株的代谢调控机制已经紊乱，不能够产生出抵抗干旱胁迫的相应应答。而转基因型植株的脯氨酸含量随着处理时间的增长而提高。这表明转基因型植株对干旱胁迫有更好的适应能力。从表21、图27可以看出，在盐胁迫处理下，野生型植株和转基因植株的脯氨酸含量都有所增加，但是转基因型植株的脯氨酸含量显著高于野生型(p<0.05)。这一结果表明，///LDi^52转录因子在拟南芥体内过量表达后，其下游信号的放大会导致脯氨酸大量合成，从而提高转基因植株对逆境胁迫的耐受性。植物对渗透胁迫和干旱的抗性可以从三方面进行考察:第一，表现在逆境下的形态特征，第二，转录水平胁迫相关基因的表达量变化，第三，植物生理生化的变化也高度适应逆境抗性。胁迫相关基因转录水平的变化可以从分子水平提供植物抗性增强的佐证；脯氨酸的含量作为植物抗旱指标，成为衡量植物是否抗旱的生化依据，可溶性糖作为渗透调节物质，在渗透胁迫下的积累，有助于植物细胞降低渗透势和水势，减少渗透胁迫对植物的危害，这些渗透调节物质的含量也成为植物抗渗透胁迫的重要指标；而丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终分解产物，它的含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。本实例通过测定野生型和转基因型植株在不同时间干旱、盐胁迫处理下的各项生理指标，来研究野生型植株和转基因型植株对干旱和盐胁迫的耐受性。通过生理生化指标研究得出，转基因植株的植株含水量、可溶性糖和脯氨酸含量高于对照，而丙二醛含量低于对照，此四项指标均成为转基因植物抗渗透能力和抗旱能力提高的重要生化证据，也进一步说明过表达基因可能通过调节渗透调节物质的含量提高转基因拟南芥的抗旱性和渗透胁迫抗性，以维持植株正常的生理生化功能。29序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120〉与植物抗逆性相关的cDNA序列及其表达载体和应用<130〉xulie0887<160>2<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>873<212>DNA<213>HalimodendronhalodendronV.<400>1gttttgaagaaagattatcacatatagttagttactaggtatttggttaagtttagcgac60tcaggtggatgatataggtagggagcagaggcggaattaaggcggttatgatggaagaag120aaagagattgttgttcaacgatcacaagaagcagaatcagcaacagccctccagagaagc180ggaaacaacaacagcaagagaagccatacagaggaataaggaggaggaagtgggggaagt240gggtggcagagatcagagaaccaaacaaaaggtcaaggatttggttgggttcttacacca300cccctgtagccgctgcacgtgcctacgacatcgccgtattctacctcagaggtccttcgg360ctcgcctcaatttcccggaattgttattccaagacgacgacgacgaagtcggttccgtcc420aacaagctgcaggcgacatgtccgccgattcaatacgcaaaaaagccacccgagtcggcg480caagagtggatgctatccaaaccgctcttcaggcctcctcccgctccacttccactcgat540tcacctccgacaaaccggatttgaacgagtttccaaagcctgaagattcccttgatgact600ttgaattgttaacagagcgtatatagcaagaactagatacctctcataatgcaactttct660tttaaggtttttttttaagaaagtaccatgaatttaattgttcactttgtgtgtgggttc720tctttgacggagcatgtgtatgagttttatcaggtttggtctgttgcaagttgtacaagg780tgtgtgtctgttgcctgagcctagataatcgaatcaaaataaccaattttcgttggttga840atttttcttcasaaaaaaasaaaaaaaasa3a3873<210>2<211>172<212>PRT<213>HalimodendronhalodendronV.<400>2MetMetGluGluGluArgAspCysCysSerThrlieThrArgSerArg151015lieSerAsnSerProProGluLysArgLysGinGinGinGinGluLys202530ProTyrArgGlylieArgArgArgLysTrpGlyLysTipValAlaGlu354045lieArgGluProAsnLysArgSerArglieTrpLeuGlySerTyrThr505560ThrProValAlaAlaAlaArgAlaTyrAsplieAlaValPheTyrLeu65707580ArgGlyProSerAlaArgLeuAsnPheProGluLeuLeuPheGinAsp859095AspAspAspGluValGlySerValGinGinAlaAlaGlyAspMetSer100105110AlaAspSerlieArgLysLysAlaThrArgValGlyAlaArgValAsp115120125AlalieGinThrAlaLeuGinAlaSerSerArgSerThrSerThrArg130135140PheThrSerAspLysProAspLeuAsnGluPheProLysProGluAsp145150155160SerLeuAspAspPheGluLeuLeuThrGluArglie165170权利要求1、一种从铃铛刺中所分离的编码干旱应答元件结合蛋白的cDNA序列，其特征在于该cDNA序列为以下(a)或(b)所示的碱基序列(a)SEQIDNO1所示的碱基序列；或(b)将SEQIDNO1所示的碱基序列一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的碱基序列，该碱基序列所编码的蛋白仍具有干旱应答元件结合蛋白的功能或活性。2、根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于该cDNA序列的碱基序列为SEQIDNO:1所示。3、一种由权利要求l或2所述cDNA序列编码的干旱应答元件结合蛋白，其特征在于该干旱应答元件结合蛋白的氨基酸序列为(a)或(b)所示(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有干旱应答元件结合蛋白功能或活性的氨基酸序列。4、根据权利要求3所述的干旱应答元件结合蛋白，其特征在于该干旱应答元件结合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。5、一种含有权利要求1或2所述cDNA序列的植物表达载体。6、根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于该植物表达载体是pC13rd29A-HhDREB2。7、一种包含权利要求5所述植物表达载体的植物细胞。8、一种根据权利要求3所述干旱应答元件结合蛋白在提高植物抗逆性中的应用。9、一种根据权利要求1或2所述cDNA序列在提高植物抗逆性中的应用。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括构建含有权利要求l或2所述cDNA序列的植物表达载体；将该植物表达载体转化到植物细胞中，在植物中表达所述cDNA序列。全文摘要本发明公开了铃铛刺DREB转录因子cDNA序列及其表达载体和应用。本发明从沙生植物铃铛刺中分离到与抗逆性紧密相关的DREB转录因子cDNA序列(SEQIDNO1)。该cDNA序列在铃铛刺的根、茎、叶中均有表达，其表达受干旱、高盐和低温环境逆境的诱导，不依赖ABA的调控。本发明构建了含有该cDNA序列的高效植物表达载体并将该植物表达载体转化到拟南芥中，对转基因拟南芥进行了干旱、高盐及低温等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行了测定，结果表明转基因拟南芥植株的含水量、丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量明显高于正常对照，说明本发明cDNA序列可提高植物的抗旱性和渗透胁迫抗性，与植物的抗逆性紧密相关。文档编号C07K14/415GK101671678SQ200910105979公开日2010年3月17日申请日期2009年3月12日优先权日2009年3月12日发明者水刘,吴燕民,阴翠翠,陈阳春,雷江丽,静高,高举明申请人:深圳市铁汉生态环境股份有限公司;中国农业科学院生物技术研究所;深圳市园林科学研究所