专利名称：Hbv的rna干扰靶点序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，涉及HBV序列上用于RNA干扰的9个靶点，以及将针对这些靶点的以各种方式获得的siRNA用于制备治疗乙型肝炎的新药物。
背景技术：
乙型病毒性肝炎(hepatitis B，HB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的。HBV的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重型肝炎，而且还与肝硬化(livercirrhosis，LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生、发展密切相关。20％的慢性乙型肝炎患者将发展成为肝硬化，HBV慢性感染的人罹患HCC的危险性是正常人的100倍。全世界共有约3.5亿人为HBsAg慢性携带者，其中3/4在亚洲。HBV感染导致全球每年50～120万人死亡，其中死于HCC的约占32万。我国是HBV感染的高发区，约60％的人群感染过HBV，10％的人群为HBsAg携带者，多达1.2亿。现有乙型肝炎患者约为1200万，年发病率为158/10万。随着HBV疫苗在1982年的问世，HBV感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了一定的进展。但是，乙型肝炎的现状仍然不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险，不幸的是，到目前为止，还没有针对HBV的特效药物。因此，乙型肝炎的治疗至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是医学研究的重大课题。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的序列特异性的基因沉默(gene silencing)，1998年2月由华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸赛大学癌症中心的Mello首次在线虫的研究中提出这一概念。继而发现它与以前在植物中发现的co-suppress和在粗糙脉孢霉菌中发现的quelling现象有共同的分子基础，都是转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)机制的不同表现形式，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNAi现象也存在于真菌、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所有真核生物中，甚至在大肠杆菌中也存在类似RNAi的机制。
RNAi一经发现，迅速成为生物学研究领域中最为活跃的热点之一，对RNAi机制的认识主要来源于果蝇和线虫的研究成果。目前认为RNAi的主要过程为RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseIII Dicer切割成为21-23nt的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA的结构特征是5′端单磷酸，3′端羟基，而且3′端有2～3-nt的碱基突出；siRNA与叫做RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)的蛋白复合体结合，在复合体内，siRNA被解链成为单链RNA；siRNA中的反义链(antisense strand)引导RISC找到目的mRNA，并且按碱基配对原则与之结合；RISC内的RNA内切核酸酶将靶mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5′端10-nt)，从而抑制目的基因的表达。
RNAi能够被迅速应用于多种生物和功能的研究，得益于它的实验方法相对简单，周期短，表型易于观察。RNAi实验中最关键的因素是干扰靶点的选择和基因导入方法。RNAi是在mRNA水平上发挥作用的，针对某一特定基因，并不是任意选择一段序列都可以达到抑制效果，不同的靶点抑制效果差别很大，但至今没有统一的确定最有效靶点的规则。根据siRNA的结构特点和生物学特性，也结合经验，人们提出以下设计和合成siRNA应遵循的原则①应避免选择5′和3′端UTR和起始密码区；②应根据目的基因的mRNA，选择其AUG起始密码子下游50～100nt区域处的编码序列；③GC含量应在30％～50％之间；④尽量避免3个同样的核苷酸连续出现；⑤每条链的3′端要有2个碱基(最好是TT)突出；⑥最后，选择的DNA片段经BLAST查询，应与其它人类基因无同源性，以避免非特异性抑制。通常认为按照以上原则在一个转录子上选择3～5个干扰靶点，至少会有1个有效。但这些规则不是绝对的，靶点是否有效还要靠实验来证实。目前有4种方法可以获得siRNA化学合成、体外转录、siRNA表达盒以及质粒或病毒载体体内表达。
作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，尤其是发现在哺乳动物细胞也存在这一机制后，RNAi被广泛用于基因功能的研究以及肿瘤和病毒性疾病的治疗研究。本发明通过构建小发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)质粒表达载体和化学合成siRNA，在HBV基因组上筛选到9个干扰靶序列，能有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制，为RNAi用于乙型肝炎的临床治疗奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供针对HBV有效的RNAi作用靶点，利用这些靶点进行RNAi作用，可明显抑制HBV的蛋白表达和病毒复制，并可以此制备治疗乙型肝炎的药物。
本发明获得的针对HBV有效的RNAi作用靶点，来源于两条途径1.构建shRNA表达载体，插入靶序列，转化大肠杆菌后提取质粒，转染2.2.15细胞和HBV转基因小鼠，通过对HBV蛋白表达和DNA的检测筛选有效的靶序列；2.化学合成siRNA，转染2.2.15细胞，通过对HBV蛋白表达的检测筛选有效的靶序列。
本发明提出的构建shRNA表达载体的方法如下以129Sv/Ev小鼠基因组DNA为模板进行PCR，扩增出276bp的U6启动子序列。PCR产物经EcoRI和XbaI双酶切，与经同样双酶切的pBluescript载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒进行测序，以证实插入序列的正确性。
本发明提出了构建针对HBV的shRNA表达载体的方法合成包括靶序列的正义链、loop序列、反义链以及终止密码在内的寡核苷酸，克隆到shRNA表达载体pU6P内，转化大肠杆菌并测序证实。
本发明提出了两种质粒转染2.2.15细胞的方法，一种是瞬时转染，另一种是稳定转染。瞬时转染用的是Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine 2000；稳定转染是在质粒转染2.2.15细胞后用嘌呤霉素筛选，得到稳定表达shRNA并持续抑制HBV蛋白表达和病毒复制的细胞株。瞬时转染和稳定转染的细胞株用ELISA方法检测HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表达，并用Real-time PCR的方法检测细胞培养上清HBV DNA的含量。
本发明将质粒转染HBV转基因小鼠的方法是“hydrodynamic transfection”，即将质粒溶解于PBS溶液，经小鼠的尾静脉快速(5秒钟内)大量(小鼠体重的10％)地注入小鼠体内。
本发明提出了合成siRNA选择有效靶序列的依据①用RNA structure软件预测HBV 4条mRNA的二级结构，选择其中不形成发夹的片段，或者保证有十几个碱基不形成发夹。②在其中挑选AA开头的21个碱基，同时GC含量在30～50％(不少于7个)，尽量避免GGG或CCC。③检查序列的保守性，选择保守性高的。④与人类基因组比对，确保无同源性(配对少于15个碱基)。用瞬时转染2.2.15细胞的方法筛选到4条有效抑制HBV蛋白表达的靶序列。
图1针对HBV的干扰靶点位置和pU6-siHBV载体的构建(图1A)各靶点在HBV基因组及4条转录子上的位置。其中Core、S1、S2、S、X和Pol分别代表HBV的C、preS1、preS2、X和P基因。(图1B)针对HBV的shRNA表达载体pU6-siHBV的构建(以pU6-siHBV4为例)。(图1C)表达载体pU6-siHBV4在细胞内的转录产物。
图2shRNA表达质粒的瞬时转染对2.2.15细胞HBsAg表达的影响图3shRNA表达质粒的瞬时转染对2.2.15细胞HBeAg表达的影响图4shRNA表达载体的瞬时转染对2.2.15细胞HBV复制的影响图5pGK-siHBV载体构建流程6稳定转染细胞株的HBsAg检测图7稳定转染细胞株的HBeAg检测图8Northern Blot检测细胞mRNA水平的变化图9稳定株细胞上清HBV DNA的测定图10质粒注射前后HBV转基因小鼠血清ALT的变化图11质粒注射前后HBV转基因小鼠血清AST的变化图12质粒注射前后HBV转基因小鼠血清HBsAg的检测图13化学合成的siRNA对2.2.15细胞HBsAg表达的影响图14化学合成的siRNA对2.2.15细胞HBeAg表达的影响具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例一shRNA表达载体pU6P的构建以129Sv/Ev小鼠基因组DNA为模板进行PCR，扩增出276bp的U6启动子序列。PCR产物经EcoRI和XbaI双酶切，与经同样双酶切的pBluescript载体(Stratagene)连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒进行测序，以证实插入序列的正确性。扩增引物如下MU6p55′-GCgaattc(EcoRI)gcggccgc(NotI)(-276)ACAGACTTGTGGGAGAAGCT-3′MU6p35′-GGCtctaga(XbaI)g(+1)atatc(EcoRV)AAACAAGGCTTTTCTCCAAGG-3′实施例二pU6-siHBV载体的构建从GenBank中搜索不同基因型HBV基因组序列(共23条)，用CLUSTERX软件进行比对，找出保守区段。根据siRNA靶点选择的原则，以2.2.15细胞中HBV的序列为基准(GenBank accession number U95551)，在保守区域选出21～24nt的序列作为候选靶点，再将这些序列与基因组数据库比对，确证与人类基因组没有同源性，一共选择了12条靶序列(表1，图1A)。靶序列确定以后，根据载体构建的要求，合成2条互补的寡核苷酸链。每一条链包括目的序列的正义序列、loop序列(TTCAAGAGA)、目的序列的反义序列、转录终止信号(TTTTT)以及XbaI酶切后的粘端序列。载体pU6P用EcoRV-XbaI双酶切，胶回收，灭菌的去离子水溶解备用。合成的寡核苷酸链用灭菌的去离子水溶解，退火后与载体连接，连接产物转化感受态DH5α，37℃培养过夜，挑克隆提取质粒进行酶切鉴定，阳性克隆利用载体的T7和T3引物进行测序，确证插入序列的正确性(图1B，图1C)。
测序引物T7 5′-CCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′T3 5′-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′实施例三shRNA表达质粒对2.2.15细胞内HBV的瞬时抑制2.2.15细胞培养在含5％CO2的37℃培养箱内，RPMI 1640培养液含有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和氨苄青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml以及200μg/ml的G418。根据优化实验的结果选择转染参数，主要转染步骤如下在转染的前一天，消化和计数细胞，用含血清不含抗生素的培养液稀释细胞，铺96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，使细胞数约为1×104个，转染时细胞汇合率(confluency)达到40～50％；对于每一孔细胞，用25μl不含血清的opti-MEM稀释240ng质粒DNA；并稀释1μl LF2000，室温放置5min；将稀释好的LF2000和质粒DNA混在一起，轻轻混匀，室温放置20min，使DNA和转染试剂形成复合物；将DNA-LF2000复合物(50μl)加到每孔细胞里，轻轻混匀。37℃继续孵育。
转染后2、4、6、8天分别检测细胞培养上清的蛋白。其中4、5、6、11、12号质粒对HBsAg的抑制比较明显，与空白对照pU6P相比，转染后4天，抑制率最高的是pU6-siHBV5和pU6-siHBV11，分别达到72.8±5.4％(P＝0.00003)和68.0±11.1％(P＝0.0001)(图2)。质粒转染后HBeAg的变化趋势与HBsAg一致，只是抑制效率略有降低，而且pU6-siHBV6对HBeAg没有明显抑制。转染后4天，pU6-siHBV5的抑制率最高为55.8±6.2％(P＝0.000026)，pU6-siHBV11、pU6-siHBV12和pU6-siHBV4也有不同程度的抑制。pU6-siGFP对HBeAg的表达没有影响(P＝0.13)(图3)。
质粒转染后不同时间用Real-time PCR法测定培养上清HBV DNA的含量，结果表明HBV DNA自转染后2天即有下降，6天时下降最明显。与pU6P相比，pU6-siHBV11对HBV DNA的抑制约为1.9倍(P＝0.013)，pU6-siHBV4对HBV DNA的抑制约为1.8倍(P＝0.015)。pU6-siGFP对HBV DNA的含量没有影响(P＝0.76)。说明pU6-siHBV的转染能够抑制2.2.15细胞HBV DNA的复制，且这种抑制有特异性(图4)。
实施例四含有嘌呤霉素抗性基因的shRNA表达载体的构建为构建含有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的shRNA表达质粒，pU6-siHBV用NotI单切，将shRNA表达盒转移到带有嘌呤霉素抗性基因的载体pGK-puro上。
将质粒pU6-siHBV用NotI单切，胶回收约350bp的片断。含有puromycin抗性基因的质粒pGK-puro也用NotI单酶切，并进行电泳胶回收。为防止载体自连，将胶回收产物进行去磷酸化。DNA片断和去磷酸化的载体进行连接反应，转化感受态DH5α，挑取单克隆，提取质粒，用NotI单切鉴定，命名为pGK-siHBV(图5)。
实施例五shRNA表达质粒对2.2.15细胞内HBV的稳定抑制2.2.15细胞消化计数，调整密度为1.8×105/ml，铺24孔板，每孔500μl，细胞汇合度约80％；24小时后，转染pGK-siHBV质粒，每孔加质粒DNA 1μg、LF2000 2μl；空白孔不转染质粒；24小时后，将细胞消化，用培养液稀释10倍，重新铺板(1孔变为10孔)；再过30小时，将培养液换为含puromycin 3.0μg/ml的培养液；筛选后3天，空白对照孔大多数细胞死亡；实验孔存活细胞较多，换液；每3天换液，筛选后8天，对照孔细胞基本死光；筛选后16天，存活的细胞克隆已繁殖成为肉眼可见的一大团，将每团细胞小心地用10μl枪头捡到96孔板的一孔(无需胰酶消化)。尽量吹散细胞，降低筛选液puromycin浓度为1.5μg/ml。细胞继续培养，酌情换液；2周后，取其上清做HBsAg检测，筛选出细胞密度高、生长状态良好，而HBsAg吸光度极低(低于未转染细胞的20％)的孔；吸除孔内培养液，加少量胰酶(约10μl)，培养箱内放置5min，吸出胰酶，加入培养液，尽量将细胞吹散，分别移至24孔板；第二天，各孔细胞换液(怕有胰酶残存)，以后视情况几天换液一次；10天后，细胞生长状况不一。再次取上清检测HBsAg，筛选出细胞密度高、生长状态良好，而HBsAg吸光度极低的孔；将孔内的细胞消化，转移至细胞培养瓶(25cm2)扩大培养；10天后，第3次进行ELISA检测，筛选细胞生长良好，吸光度低的细胞进行换液、换瓶或传代处理；细胞继续培养，并冻存，命名为S11。2周和2月后分别进行第4次和第5次ELISA检测，稳定抑制的细胞株予以保留，否则弃之。
pGK-siHBV11和pGK-U6P空载体转染成功，前者得到8株细胞，命名为S11-1、S11-2、S11-3、S11-4、S11-5、S11-6、S11-8、S11-9；后者得到2株细胞，命名为Su6p-1和Su6p-2。
HBsAg的检测结果表明，与2.2.15细胞相比，转染了空载体得到的稳定株Su6p-1和Su6p-2 HBsAg的分泌没有明显变化，P值分别为0.23和0.37；而转染pGK-siHBV11得到的稳定株S11-1等8个细胞株HBsAg的抑制非常明显，抑制率为93.8～96.1％(图6)。按照ELISA检测试剂盒的说明，8个细胞株的HBsAg均为阴性。
与此相似，Su6p-1和Su6p-2细胞株的HBeAg水平与2.2.15细胞没有明显区别，P值分别为0.43和0.36；其它8个细胞株的HBeAg均有明显降低，为80.2～88.3％。S11-4的抑制率最高88.3％(P＝4.92E-12)，S11-5的抑制率最低80.2％(P＝2.5E-12)(图7)。
提取细胞总RNA，进行Northern Blot检测，与2.2.15细胞相比，转染了空质粒的Su6p-2细胞3.5kb和2.4/2.1kb的mRNA均没有明显变化，而转染了pGK-siHBV11的稳定株细胞S11-4和S11-8mRNA明显减少，尤其是2.4/2.1kb的mRNA几乎检测不到，说明shRNA在细胞内的持续表达有效地切断了相应的mRNA(图8)。
细胞培养上清HBV DNA的检测结果表明，与2.2.15细胞相比，稳定株S11-4的HBVDNA降低了9.6倍(1.85E-07)；S11-5降低了12.5倍(7.81E-07)；S11-8降低了12.8倍(6.81E-07)。Su6p-2没有明显降低(P＝0.20)(图9)。说明pGK-siHBV11转染后得到的稳定株细胞HBV的复制得到了持续的抑制。
实施例六HBV转基因小鼠实验实验动物选择7～8周龄雄性HBV转基因小鼠，体重约20～25g。事先采血检测HBsAg，选择HBsAg吸光度相近的小鼠随机分组，每组6只，重复3次。
质粒注射采用hydrodynamic transfection方法小鼠用戊巴比妥钠(pentobarbital sodium，50mg/kg body weight)麻醉后，用27gauge(外部直径0.41mm)注射针经小鼠尾静脉注射质粒溶液(PBS溶解)。注射时间5秒；注射体积动物体重的10％(2～2.5ml)；质粒的量10μg/只。注射质粒pU6-siHBV5、pU6-siHBV11和pU6-siGFP(阴性对照)。
质粒注射后不同时间测定血清内谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量，小鼠质粒注射后血清转氨酶ALT和AST有一过性升高，注射后1天上升明显，分别是注射前的15～30倍和4～6倍，3天后已基本恢复正常(图10，11)。转氨酶的暂时升高可能是由于大量液体的快速注射造成肝细胞通透性增高所致。
小鼠血清HBsAg检测的结果表明(图12)，血清HBsAg自注射后3天开始下降，一直持续到注射后2周。注射后5天下降最明显，与pU6-siGFP组相比，pU6-siHBV5组降低了48.7±6.8％(P＝0.00056)，pU6-siHBV11组降低了56.7±5.7％(P＝0.00024)。
实施例七化学合成的siRNA对2.2.15细胞内HBV蛋白质表达的抑制根据siRNA靶点选择的原则，在HBV基因组上选择了4条序列(HV-1，HV-2，HV-3，HV-4)，分别针对S、C和P区。并同时合成了2条文献报道的序列HC-1和HC-2作为阳性对照。
将合成的6条siRNA(包括2条阳性对照)经处理后转染2.2.15细胞，不加siRNA，只加转染试剂Oligofectamine的孔(mock transfection)做空白对照。3天后检测上清HBsAg和HBeAg，结果表明(图13)，与空白对照相比，HV-1、HV-2和HC-2对HBsAg的抑制率分别为60.4±4.6％(P＝6E-11)、75.7±2.7％(P＝3.48E-13)和55.5±7.3％(P＝4.66E-09)，HV-2的抑制率高于阳性对照HC-2(P＝3.92E-05)；而HV-3、HV-4和HC-1对HBsAg的表达没有抑制作用。
所有的6个siRNA对HBeAg的表达都有明显的抑制，抑制率最高为68.2±1.8％(HC-2，P＝3.39E-10)，最低为52.2±8.8％(HV-1，P＝2.72E-07)，各序列之间抑制率的差别不大(图14)。
所选择的4条序列均能有效抑制相应蛋白质的表达，有效率为100％。
表1 HBV RNAi靶点序列
表2合成siRNA序列
权利要求
1.HBV的RNA干扰靶点序列5′-GATCCATACTGCGGAACTCCT-3′或5′-GATCCTGCGCGGGACGTCCTT-3′或5′-GATTCCTAGGACCCCTTCTCG-3′或5′-GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT-3′或5′-GCACTTCGCTTCACCTCTGCACGT-3′或5′-AATCACTCACCAACCTCCTGT-3′或5′-AACAATACCTGAACCTTTACC-3′或5′-AAACTACTGTTGTTAGACGAC-3′或5′-AAGAATTTGGAGCTACTGTGG-3′。
2.针对权利要求1所述的HBV的RNA干扰靶点序列获得的siRNA。
3.权利要求1所述的靶点序列在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
4.权利要求2所述的siRNA在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，涉及9个针对HBV进行RNA干扰的靶点，以及依据这些靶序列制备乙型肝炎药物的应用。本发明通过shRNA表达质粒以及化学合成siRNA转染细胞及动物的方法筛选了HBV基因组上16个RNA干扰的靶点，其中的9个靶点能够在细胞水平明显抑制HBV蛋白质的表达(序列见表1和表2)。11号靶点还能稳定抑制细胞内HBV蛋白质的表达和病毒复制，并能抑制HBV转基因小鼠体内病毒蛋白质的表达。依据这些靶序列可以制备治疗乙型肝炎的药物。
文档编号A61P1/00GK1667120SQ200410077788
公开日2005年9月14日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者徐安龙, 任向荣, 周玲君, 罗广彬, 谢珍慧, 林斌, 董美玲 申请人:中山大学