专利名称：抑制小鼠tlr9表达的rna干扰序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，是关于一种能抑制小鼠TLR9表达的SiRNA干扰序列及其应用。
背景技术：
Toll样受体9(TLR9)是Toll样受体家族中重要的一员，作为先天免疫中重要的模 式识别受体(PRR)，它可特异性识别细菌或病毒DNA中未甲基化的CpG基序，介导对病毒和 细菌的清除。TLR9识别CpG后，激活NF- κ B信号通路，启动下游基因的转录，引起Thl样炎 症反应，包括诱导B细胞和DCs功能性成熟，以及刺激各种免疫细胞产生细胞因子和趋化因 子。TLR9不仅在介导外源CpG激活先天免疫过程中有重要的生物学意义，也参与免疫系统 “自己”与“非己”的识别，另外还与自身免疫紊乱、和恶性肿瘤发生相关。对TLR9的研究有 助于明了相关疾病的发病机理，便于对症下药，也有助于阐明DNA疫苗的作用机制，为开发 高效的疫苗提供理论基础。目前，TLR9信号途径中有很多步骤的细节都有争议，TLR9与CpG如何作用，TLR9 在细胞中的运输，还有其下游的信号转导机制也不是完全清楚，这些都有待进一步研究阐 明。此外，对TLR9介导CpG的信号途径在小鼠的研究，其细胞主要来源于TLR9缺失小鼠或 MyD88缺失小鼠的树突状细胞确证的。然而，TLR9缺失小鼠的树突状细胞在发育过程中可 能受到微环境中缺失TLR9表达细胞的影响而功能已发生改变，去除MyD88研究CpG_TLR9 无法反映TLR9通路的实际情况，而且目前国内难以获取TLR9缺失小鼠或其他研究TLR9通 路的材料。RNAi是由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，具有普遍的生物学意义。双链RNA 经DICER酶切割为21 23核苷酸长的小分子干扰RNA片段，可以高效特异地阻断体内特 定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。由于能够迅速而简单 地制备某个基因功能缺失表型，RNAi实验技术的发展将为基因或蛋白功能研究、药物筛选、 信号通路分析和基因治疗等提供新的重要研究手段和技术平台。
发明内容
本发明的目的在于提供干扰小鼠TLR9表达的SiRNA序列(以下简称siRNA9. 1)， 序列为5' -UGUAAGAACUUCAAGUUCA-3 ‘。所述的siRNA9. 1作用的靶点位于小鼠TLR9mRNA 第1517 1535位。该干扰序列可有效地降低小鼠TLR9的表达。本发明的另一目的在于提供一种针对小鼠TLR9的SiRNA片段构建的表达载体。本发明的上述siRNA序列，是由Invitrogen公司提供的在线合成软件筛选得到 (Block-iT RNAi Designer online software)。
图1为构建siRNA9. 1序列对应的两条Oligo单链。
图 2 为 pSilencerTM4. I-CMV neo 质粒图谱。图3为重组载体pSilencerTM4. l_siRNA9. 1酶切电泳图。M代表Maker，1泳道为 pSilencerTM4. l_siRNA9. 1 酶切后产物。图4为重组载体pSilencerTM4. l_siRNA9. 1测序图，97bp 145bp为插入的序列， 两端为酶切位点。图5为RT-PCR检测干扰效果图。图6为Western blot检测干扰效果图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，以下实例仅用于说明本发明，而不 用于限定本发明的范围。实施例1 SiRNA序列的设计根据Invitrogen公司的在线合成软件，依照小鼠TLR9 [Gene Bank号NM_031178] 序列，选择开放阅读框以后，GC含量在40% 60%，且Blast搜索排除与其他序列同源的 序列为目的 s iRNA 片段。序列为5 ‘ -UGUAAGAACUUCAAGUUCA-3 ‘。实施例2 干扰载体的构建构建siRNA9. 1序列对应的两条Oligo单链(如图1)，两条链各含一个Loop序列， 两端分别含BamH I和Hind III酶切位点，由Invitrogen公司(上海)合成。将合成的两条 链退火所获的双链复合体用T4DNA连接酶连接入载体pSilenCerTM4. I-CMV neo (质粒图 谱如图2，含G418抗性)，克隆转化感受态Ecoli，挑取单克隆菌落，过夜摇菌。提取质粒进 行Hind III和BamH I双酶切，酶切产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果显示条带位置正确 (如图3)。同时将质粒进行测序鉴定。测序结果正确(如图4)，大规模抽取pSilencerTM4. 1 质粒和构建的 pSilencerTM4. l_siRNA9. 1 质粒(简称 pS4. 1 和 pS4. l_siRNA9. 1)，备用。实施例3 细胞培养和转染Raw264. 7细胞(小鼠巨噬细胞系)接种在DMEM完全培养基(含10 %，100U/ml青 霉素、0. lmg/ml链霉素)中，于37°C，5% C02孵箱培养，每隔2 3d传代1次，实验选用对 数生长期细胞。实验分 3 组 control 组，pS4. 1 组，pS4. l_siRNA9. 1 组。按 Lipofectamine 2000操作说明进行，Lipofectamine 2000与质粒的比例为1 μ g 2μ1。4h后，细胞培养 液换成DMEM完全培养基，48h后，培养基内添加G418 (终浓度为400ng/ml)进行筛选，质粒 未能转染进的细胞将逐步死亡，维持G418浓度一直到筛选出稳定生长的细胞，即获得含有 质粒的阳性细胞株。 实施例4 =RT-PCR检测干扰效果 用Trizol提取各组Raw264. 7总RNA，先逆转录成cDNA，再进行PCR扩增。PCR条 件为94°C变性458，481退火458，721延伸lmin30s，共33个循环。TLR9全长引物序列 为正义链 5 ‘ -CAACCTGTCCTTCAATTACCG-3 ‘；反义链 5 ‘ -CCACACTTCACACCATTAGC-3 ‘， 扩增片段1300bp ；内参GAPDH引物序列为正义链5' -AACGACCCCTTCATTGAC-3‘；反义链 5 ‘ -TCCACGACATACTCAGCAC-3 ‘，扩增片段250bp。每组取PCR产物3ul，用1 %琼脂糖凝胶 进行电泳，用凝胶成像分析系统拍照分析，依据TLR9PCR产物与GAPDH PCR产物灰度比，判 断TLR9的mRNA沉默程度。结果发现，干扰载体可有效地降低TLR9mRNA的表达，抑制率达到 79. 6%0实施例5 =Western blot检测干扰效果各组细胞去除培养基上清，加入细胞裂解液作用几秒钟，收集裂解后液体于EP管 中，冰上放置30min，之后IOOOOrcf离心5分钟，吸取上清液体-70°C冻存，备用。使用前， 先用BCA法测蛋白浓度，读取OD562值，从标准曲线查出蛋白浓度，调节蛋白浓度使每个样品 的上样总蛋白量为100 μ g。样品加loading buffer煮5 IOmin后，跑10% SDS-PAGE电 泳，电泳结束后，100V恒压转印90min到0. 45 μ m PVDF膜上。转印结束后，按照下述的程序 进行Westernblot检测①把含有样品的PVDF膜用TBS配制的3 %脱脂奶粉室温封闭2h ；②按说明书使用量分别加入1 400稀释兔抗鼠TLR9多克隆抗体和1 500稀 释β-actin鼠单抗，4°C孵育一抗过夜；③TBS 洗 3 次，每次 5min ；④分别加入1 1000稀释的HRP-羊抗兔二抗和1 3000羊抗鼠二抗，37°C反应 1小时；⑤TBS洗5次，每次5分钟；⑥化学发光，显影，定影，拍照。用Quantity One软件对Western blot检测图进行检测，结果发现，干扰载体可有 效地降低TLR9蛋白的表达，抑制率达到75. 6%。序列表<110>南京大学<120>抑制小鼠TLR9表达的RNA干扰序列及其应用<140)2009100248129<141>2009-02-27<160>5<210>1<211>19<212>RNA<213> 小鼠(Mus Musculus)<400>1uguaagaacu ucaaguuca 19<210>2<211 >21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2caacctgtcc ttcaattacc g 21<210>3
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3ccacacttca caccattagc 20<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4aacgacccct tcattgac 18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220><223><400>5tccacgacat actcagcac 19
权利要求
利用RNAi技术抑制小鼠Raw264.7细胞TLR9表达的siRNA序列，其特征在于5′-UGUAAGAACUUCAAGUUCA-3′。
2.根据权利要求书1所述的siRNA序列，设计构建得到的干扰质粒 pSilencerTM4. l_siRNA9. 1，其特征为利用该质粒载体可以特异性的抑制小鼠Raw264. 7细 胞TLR9的表达，体外干扰得到TLR9低表达的小鼠Raw264. 7细胞可用于阻断TLR9的信号 通路的研究。
3.—种RNAi抑制小鼠所有细胞TLR9的表达方法，其特征在于方法是基于权利要求书 1和/或权利要求书2所述的。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种能抑制小鼠TLR9表达的siRNA片段以及基于该片段构建的载体，序列为5′-UGUAAGAACUUCAAGUUCA-3′。根据该序列合成对应的两端带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的两条Oligo单链，并将其连退火并接入载体构建得到干扰载体pSilencerTM4.1-siRNA9.1。经过RT-PCR、免疫印记等具体实例验证，运用该干扰载体可以成功特异性抑制小鼠Raw264.7细胞TLR9的表达，阻断TLR9引起的信号通路。因此，所述的siRNA序列及其获得的干扰载体可以用于经济快捷地得到大量的小鼠TLR9低表达的细胞并阻断TLR9信号通路。
文档编号C12N15/85GK101818144SQ20091002481
公开日2010年9月1日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者侯亚义, 李晓曦, 马玲 申请人:南京大学