专利名称：乙肝病毒hbv荧光定量pcr检测引物与探针的制作方法
技术领域：
本发明是一种用于检测乙肝病毒HBV核苷酸序列的的引物和探针。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)，嗜肝DNA病毒科。全世界有3. 5亿人携带乙肝病毒，每年有近100万人死于乙肝相关并发症，包括肝硬化、肝细胞癌。我国是乙型肝炎高发区，约57. 6% 的人口过去或现在受到过乙型肝炎病毒的感染，他们中仍有约1.2亿人携带乙肝病毒，现 症患者已超过2000万人。乙肝病毒携带者中，50%-75%的人有活动性病毒复制的慢性乙 肝，估计5年中从慢性乙肝进展为肝硬化的发生率为2% -20% ；从代偿性肝硬化到肝脏失 代偿为20% -23%;从代偿肝硬化到肝癌为6% -15%。慢性乙肝是进展为肝硬化、肝衰竭和 肝细胞癌的首要危险因素乙肝病毒携带者中，50%-75%的人有活动性病毒复制的慢性乙 肝，估计5年中从慢性乙肝进展为肝硬化的发生率为2% -20% ；从代偿性肝硬化到肝脏失 代偿为20% -23%;从代偿肝硬化到肝癌为6% -15%。HBV的传染性很强，接种0. 00004ml 含病毒血液足以使人发生感染。而乙肝病毒又常常产生突变，这给乙肝的确诊和治疗带来 极大的麻烦，所以迫切需要一种既准确又快速的实验室检验方法来检测乙肝病毒。乙肝病毒的检测技术包括免疫学检测方法，包括酶联免疫分析法，胶体金免疫层 析测定法，免疫荧光法和固相放射免疫法；分子生物学检测方法，包括核酸探针法，PCR法 和基因芯片法。其中，PCR检测法简便、快速，近年来，在临床检测中备受青睐，但是，普通 PCR检测易产生污染。，实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA较传统定性PCR技术操作简便，检 测时不需打开反应管便可测出定量结果，从而减少污染机会，同时提高了检测灵敏度、特异 性及整个操作的自动化程度。其特异、灵敏且准确等优点，在人类传染病和病原定量上的应 用日益广泛。在实时荧光定量PCR检测方法中，引物和探针的设计尤为重要，决定了检测结 果的有效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测HBV DNA的引物和探针。基于上述目的，本发明采用以下技术方案用于检测HBV DNA的弓丨物和探针序列包括上游引物HBVF 的序列为5 ‘ TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3 ‘，下游引物HBVR 的序列为5 ‘ GCACAGCTTGGAGGCTTGA3，，探针HBVP 的序列为5 ‘ FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3，本发明的原理为在传统的PCR扩增体系中加入一个与靶序列特异互补的双荧光 标记寡核苷酸探针，探针的5 ’端设计了 一个报告荧光基团，3 ’端设计了 一个淬灭荧光基团。 在探针完整的情况下，报告荧光基团发出荧光被淬灭荧光基团吸收，此时检测不到荧光信 号。当有特异PCR产物时，复性时，标记探针与靶序列结合互补，形成局部双链产生适合于 5’ -3’核酸外切酶外切活性的底物，激活Tag聚合酶的5’外切酶活性，将5’的荧光分子切除，这样，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，淬灭作用被解除，产生荧光信号，通过荧光定 量PCR仪检测荧光度，即可测得最终的定量结果。
利用弓I物对HBVF/HBVR和探针HBVP检测HBV DNA阳性样品的荧光定量PCR图。见附图一。
具体实施例方式1，引物和探针的设计通过分别对所有已知的乙肝病毒基因序列比较分析，选择 高保守的区段，设计多对引物和探针，最优的引物和探针如下上游弓丨物HBVF 5 ‘ TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3 ‘下游弓丨物HBVR 5 ‘ GCACAGCTTGGAGGCTTGA3，探针HBVP:5' FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3，2，反应体系的优化利用病人血清作为待检样品，分装后储存于_20°C2. 1引物浓度的优化在反应体系中其他组分相同的情况下，将HBV引物浓度分 别从0. 1 μ M到2. 0 μ M作倍比连续稀释，通过实验结果的分析比较，确定最优引物浓度为 0. 5μΜ。2. 2探针浓度的优化在反应体系中其他组分相同的情况下，将HBV探针浓度分 别从0. 01 μ M到1. (MM作倍比连续稀释，通过实验结果的分析比较，去顶最优探针浓度为 0. 05 μ Mo利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定，HBV DNA荧光定量PCR的最 优体系为40 μ L。3.仪器检测通道的选择选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说 明书进行设置。4，PCR反应条件如下370C 5min, 1 个循环；95°C 2min, 1 个循环；95°C 10sec,59°C 40sec，40 个循环。在 59°C40sec阶段收集荧光。5，检测结果分析如果待检样品中HBV DNA，则显示阳性扩增曲线，检测灵敏度为100拷贝/mL。如 果待检样品中没有HBV DNA，则没有信号。显示上述引物和探针有良好的特异性和检测灵敏度。本发明的优点在于(1)由于我国乙肝病毒多为B和C型，故市场上同类产品基本只针对这两型。而本 发明提供的引物和探针，是选取了乙肝病毒已知的所有亚型的高保守区域，可以达到所有 亚型都能检出的效果。并能避免假阴性结果的出现。(2)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度达到300拷贝/mL，显示了其将具有很 好的检出率。(3)本发明提供的引物和探针检测阴性样品没有信号，显示了其很好的特异性。
权利要求
一种用于检测乙肝病毒基因(HBV DNA)的引物，其特征在于所述的引物序列包括上游引物HBVF5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′，下游引物HBVR5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’。
2.一种用于检测乙肝病毒基因(HBV DNA)的探针，其特征在于所述的探针HBVP序列 为5 ‘ FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。
全文摘要
一种用于检测HBV DNA的引物与探针，引物序列包括上游引物HBVF5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′下游引物HBVR5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’探针序列HBVP5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。
文档编号C12Q1/70GK101812533SQ20091002442
公开日2010年8月25日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者于秀菊, 李杨霞, 符芳芳 申请人:江苏默乐生物科技有限公司