专利名称：利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法
利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用农杆菌介导高效转化体系培养 苹果幼苗的方法。
背景技术：
砧木“M26”是一种矮化砧木，易繁殖，压条生根好，繁殖率高，抗白粉病，与苹果品 种嫁接亲和力强，植株生长矮化、产量高，果实品质好。但由于其根系浅，并且不抗绵蚜和颈 腐病，有“大脚”现象，在一些地区越冬抽条严重，不宜在沙质土和贫瘠干旱地域栽植。其仅 宜作中间砧，在华北地区应用，中间砧段需埋入地下，但不抗寒，要求具有较好的土壤和管 理条件。
在我国针对此问题研究开展较广泛，但主要研究的是栽培及病虫害防治方面，在 组织培养及遗传转化方面研究甚少。国内外有关文献报道不多，且国外的仙客来转化材料 基本上都选用的是黄化子叶节。
农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌 中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片断可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中。农 杆菌介导的转导方法同其它方法相比具有以下优点转化效率高，转化效果好，可转移大片 断DNA ；转移的外源基因成为单拷贝；遗传稳定，并且多数符合孟德尔遗传定律；价格廉价。发明内容
本发明的目的在于提供一种建立苹果矮化砧木“iC6”农杆菌介导高效转化体系的 方法，该方法有效的克服现有的农杆菌介导技术遗传转化效率低的缺陷。
本发明的技术解决方案是
—种利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果转基因幼苗的方法，其特殊之处在 于，该方法包括以下步骤
1)切取组培苗叶片置于包括4. Omg/L 6_苄基氨基嘌呤和0. 2mg/L3-吲哚乙酸的 MS培养基的分化培养基上暗培养作为受体材料；
2)将供体菌株接种到加有100mg/L卡那霉素以及50mg/L链霉素的LB液体培养基 上培养，收集菌液，离心，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释至浓度0D600为0. 4 0. 6 ； 其中LB液体培养基还可以添加利福平，卡那霉素、链霉素和利福平三种成分以利于农杆菌 生长同时抑制其它杂菌生长。
3)将步骤2~)收集的菌液加入稀释后的液体MS中，放入步骤1)培养好的受体材 料进行浸染；取出浸染后的叶片吸去表面附着的菌液，并接种到所述分化培养基上共培养 2 4天，再接种到筛选分化培养基上，24 27°C暗培养直至长出抗性芽，尤其温度在 生长较好；其中共培养就是让含有此基因的菌液和受体材料共同生存在一起两天到四天左 右这样以利于转化转化效率较高时间太长菌液太多不易清除；侵染后的共培养时间和培养 条件对转化都有影响，农杆菌附着外菌株才能诱发肿瘤，因此共培养时间必须长于16h，共培养时间的确定以不对叶片造成伤 害，又能最大限度的提高转化效率为准，确定方法主要采用gus基因瞬时表达测定法，即共 培养后确定外植体的gus基因颜色反应，以瞬时表达率高，表达面积大为优。一般2 4d 较为适宜；
所述筛选分化培养基包括200mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L6_苄基氨 基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基；
4)将步骤幻得到的抗性芽移植到继代培养基上进行进一步的筛选培养，3 5周 后，事实上4周较合适，进行生根培养，而后进行移栽，培养苹果幼苗完成；
所述继代培养基包括200mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L 6-苄基氨基 嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基。
上述步骤1)的组培苗叶片通过以下步骤获取
1)取苹果芽，用体积百分比为70%的酒精浸泡30 40s后，再用体积百分比为 0. 1 %的升汞浸泡7 8min，再用无菌水冲洗5 6遍，最后浸没于无菌水中；其中升汞是 一种组培苗建立外植体时的消毒杀菌剂；
2)无菌条件下将经步骤1)处理后的苹果芽接于包含30g/L蔗糖、7g/L琼脂、 0. 6mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基的培养基上，培养温度为 20 22°C，光照1 500 20001x，培养一个半月左右得组培苗叶片。
上述步骤幻先将培养好的受体材料进行浸染前，在其背部横切数刀。
上述供体菌株是农杆菌EHA105。
上述LB液体培养基包括10g/L氯化钠、5g/L酵母以及10g/L胰蛋白胨或10g/L氯 化钠、5g/L酵母、10g/L胰蛋白胨以及琼脂158/1，其？!1为7.2。其中液体培养基不需要琼 脂，在培养菌之前加入卡那霉素、链霉素和利福平三种成分作用抑制其它杂菌生长有利于 农杆菌生长。
上述供体菌株接种到LB液体培养基上培养的条件是置于恒温摇床，以ISOrpm的 转速在的条件下培养Mh。
上述离心条件是常温下以3000rpm的转速离心8分钟。
上述生根培养用生根培养基培养，所述生根培养基包括吲哚乙酸0. 2mg/L,200mg/ L头孢霉素、50mg/L卡那霉素以及一半体积的MS培养基；
所述培养条件为光周期14h/10h、光照强度20001x以及温度25士2°C。
上述组培苗叶片暗培养的温度是20°C，时间是2天。
上述浸染后的叶片吸去表面附着的菌液是置于无菌滤纸上进行。
本发明具有以下优点
本发明建立苹果矮化砧木“M26”农杆菌介导高效转化体系的方法，通过优化农杆 菌转化时所涉及到的各项影响条件，包括菌液浓度、侵染时间、侵染条件、培养时间、抑菌素 浓度等，提供了一套适合苹果矮化砧木“M26”的农杆菌介导转化体系；本发明克服了现有 农杆菌介导技术遗传转化效率低的缺陷，建立起以叶片为受体材料的高效农杆菌转化体 系；通过本发明获得转基因植株苹果矮化砧木“iG6”植株的抗盐性等的抗逆性明显增强。
图1为转基因植株苹果矮化砧木“M26”的抗性筛选。
图2为转基因植株的nhx目的基因的PCR检测。
图3为转基因植株的nptll基因的PCR检测。
图4为为转基因植株的nhx目的基因Southern杂交检测。
图5为为转基因植株的nptll报告基因Southern杂交检测。
图6实时定量目的基因检测。
图7移栽生长状况图。
具体实施方式
下面结合发明人给的具体实施例和试验例对本发明的方法和使用效果做进一步 阐明。
苹果砧木“M26”外植体的培养，组培苗叶片通过以下步骤获取
1)取苹果芽，在超净工作台上用体积百分比为70%的酒精浸泡30或40s后，再用 体积百分比为0. 的升汞浸泡8min，再用无菌水冲洗5 6遍，最后浸没于无菌水中；其 中升汞是一种组培苗建立外植体时的消毒杀菌剂；
2)无菌条件下将经步骤1)处理后的苹果芽接于包含30g/L蔗糖、7g/L琼脂、 0. 6mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基的培养基上，培养温度为 20 22°C，光照1 500 20001x，培养一个半月左右得组培苗叶片。
一种利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，包括以下步骤
1)选继代培养3周的苹果组培苗的叶片，用无菌手术刀在其叶背部划几道伤口接 种于4. Omg/L 6-苄基氨基嘌呤和0. 2mg/L3-吲哚乙酸的MS培养基的分化培养基暗培养2 天作为受体材料，培养条件为22°C ；
2)将供体菌株农杆菌EHA105接种到加有100mg/L卡那霉素以及50mg/L链霉素 的LB液体培养基上培养J8°C，180rpm恒温摇床上过夜，将菌液收集到IOml离心管中， 3000rpm常温离心8分钟，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释，浓度0D600为0. 4 0. 6 时进行侵染转化，其中LB液体培养基包括10g/L氯化钠、5g/L酵母、10g/L胰蛋白胨以及琼 脂 15g/L，其 pH 为 7. 2;
3)将预培养两天的叶片放入盛放菌液系时候的液体MS中，浸泡并轻轻摇动4 5min,将侵染过的叶片放到滤纸上吸干，而后接种到分化培养基上暗培养3d，而后接种到 的筛选分化培养基上，22°C暗培养两周，其中分化培养基4. 0mg/L6-苄基氨基嘌呤、0. 2mg/ L3-吲哚乙酸以及MS培养基，筛选分化培养基包括200mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素、 0. 6mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基；
4)将抗性芽移植到继代培养基上进行进一步的筛选培养，2 3周后，进行生根 培养，而后进行移栽，其中继代培养基包括200mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基。
试验例1转基因苹果砧木m26的抗性筛选
获得再生芽后，转移至含有卡那霉素的分化培养基上，若是转基因植株在抗生素 培养基上生长良好，若为非转基因植株，在抗生素培养基上黄化死亡，如图1所示，图中所反应的内容是再生芽的抗性筛选左边为抗性植株右边为非抗性植株。
试验例2转基因植株NHX目的基因的PCR检测
用于遗传转化的基因含有NHX目的基因，采用CTAB法提取叶片的DNA进行检测， 扩增片断长度为2000bp，如图2所示，图中M代表marker，14代表阳性对照，13代表空白对 照，12代表阴性对照，1 11代表转基因植株。
25μ L 的反应体系包括2. 5μ LlOXPCR Bufer, 1. 5μ L 25mmol/L MgCl2,2y L 2. 5mmol/L dN TPs, 1 μ LlOmmol/L DHARs 引物，1 μ LlOmmol/L DHAfci 引物，0. 25 μ L5U/μ L 的Taq DNA聚合酶，2 μ L模板DNA，用灭菌双蒸水补齐至25 μ L。
PCR扩增程序为94°C变性5min，然后依次在94°C变性50s、55°C退火50s、72°C延 伸aiiin的条件下循环35次，最后在72°C延伸7min。PCR反应结束后，取样8 μ L在1 %琼 脂糖凝胶上进行电泳检测。 目的基因检测引物根据苹果NHX基因设计合成特异引物， 上游引物(5' -ATG GCG GTT CCA CAT TTG AG-3')和下游引物(5' -TCA TTG CCA CTG AAC GTT GT-3‘)。
试验例3转基因植株报告基因PCR检测
用于遗传转化的基因含有报告目的基因，采用CTAB法提取叶片的DNA进行检测， 扩增片断长度为750bp，如图3所示，图中M代表marker，14代表阳性对照，13代表空白对 照，12代表阴性对照，1-11代表转基因植株。
25μ L 的反应体系包括2. 5μ LlOXPCR Bufer, 1. 5μ L 25mmol/L MgCl2,2y L 2. 5mmol/L dN TPs, 1 μ LlOmmol/L DHARs 引物，1 μ LlOmmol/L DHAfci 引物，0. 25 μ L5U/μ L 的Taq DNA聚合酶，2 μ L模板DNA，用灭菌双蒸水补齐至25 μ L。
PCR扩增程序为94°C变性5min，然后依次在94°C变性50s、55°C退火50s、72°C延 伸aiiin的条件下循环35次，最后在72°C延伸7min。PCR反应结束后，取样8 μ L在1 %琼 脂糖凝胶上进行电泳检测。
根据苹果报告基因设计合成特异引物，上游引物(5' -AGA CAA TCG GCT GCT CTG ΑΤ-3')和下游引物(5‘ -TCA TTT CGA ACC CCA GAG TC-3')。
试验例4转基因植株的nhx目的基因Southern-blot检测
PCR检测阳性的植株进行Southern印迹杂交，以非转化植株为对照。用上、下游 引物对质粒进行扩增，用扩增产物制备杂交探针。苹果砧木叶片总DNA经HindIII单酶切 后，在8g/L琼脂糖凝胶上电泳分离，将DNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。Southern杂交使 用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 杂交试剂盒，具体操作 按照说明书进行。
如图4所示，抗性植株的southern杂交检测9.阳性对照；8.未转化植株；1 7.转化植株。
试验例5转基因植株的报告目的基因Southern-blot检测
PCR检测阳性的植株进行Southern印迹杂交，以非转化植株为对照。用上、下游 引物对质粒进行扩增，用扩增产物制备杂交探针。苹果砧木叶片总DNA经HindIII单酶切 后，在8g/L琼脂糖凝胶上电泳分离，将DNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。Southern杂交使 用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 杂交试剂盒，具体操作 按照说明书进行。
如图4所示，抗性植株的southern杂交检测1.未转化植株；2.阳性对照；3 9.转化植株。
试验例5实时定量检测结果目的基因
22-48为转化植株，ck为未转化植株
试验例6移栽生长状况图
22，39，47为转化植株，ck为未转化植株。
权利要求
1.一种利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果转基因幼苗的方法，其特征在于，该方 法包括以下步骤1)切取组培苗叶片置于包括4.0mg/L6-苄基氨基嘌呤和0. aiig/L3-吲哚乙酸的MS培 养基的分化培养基上暗培养作为受体材料；2)将供体菌株接种到加有100mg/L卡那霉素以及50mg/L链霉素的LB液体培养基上培 养，收集菌液，离心，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释至浓度0D600为0. 4 0. 6 ；3)将步骤幻收集的菌液加入稀释后的液体MS中，放入步骤1)培养好的受体材料进行 浸染；取出浸染后的叶片吸去表面附着的菌液，并接种到所述分化培养基上共培养2-4天， 再接种到筛选分化培养基上，24 27°C暗培养直至长出抗性芽，尤其温度在^TC生长较 好；所述筛选分化培养基包括200mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L6_苄基氨基嘌 呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基；4)将步骤幻得到的抗性芽移植到继代培养基上进行进一步的筛选培养，3 5周后， 进行生根培养，而后进行移栽，培养苹果幼苗完成；所述继代培养基包括200mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L 6-苄基氨基嘌呤、 0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基。
2.根据权利要求1所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征在 于，所述步骤1)的组培苗叶片通过以下步骤获取1)取苹果芽，用体积百分比为70%的酒精浸泡30 40s后，再用体积百分比为0.1% 的升汞浸泡7 8min，再用无菌水冲洗5 6遍，最后浸没于无菌水中；2)无菌条件下将经步骤1)处理后的苹果芽接于包含30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.6mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培养基的培养基上，培养温度为20 22°C， 光照1 500 20001x，培养一个半月左右得组培苗叶片。
3.根据权利要求1所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征在 于所述步骤幻先将培养好的受体材料进行浸染前，在其背部横切数刀。
4.根据权利要求1 3任一利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果转基因幼苗的方 法，其特征在于所述供体菌株是农杆菌EHA105。
5.根据权利要求4所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征在 于所述LB液体培养基包括10g/L氯化钠、5g/L酵母以及10g/L胰蛋白胨或10g/L氯化钠、 5g/L酵母、10g/L胰蛋白胨以及琼脂158/1，其？!1为7.2。
6.根据权利要求5所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征在 于，所述供体菌株接种到LB液体培养基上培养的条件是置于恒温摇床，以ISOrpm的转速 在的条件下培养Mh。
7.根据权利要求5所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征在 于，所述离心条件是常温下以3000rpm的转速离心8分钟。
8.根据权利要求6所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征在 于所述生根培养用生根培养基培养，所述生根培养基包括吲哚乙酸0. 2mg/L,200mg/L头 孢霉素、50mg/L卡那霉素以及一半体积的MS培养基；所述培养条件为光周期14h/10h、光照强度20001x以及温度25士2°C。
9.根据权利要求7所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征在 于所述组培苗叶片暗培养的温度是20°C，时间是2天。
10.根据权利要求8所述利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法，其特征 在于所述浸染后的叶片吸去表面附着的菌液是置于无菌滤纸上进行。
全文摘要
一种利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果转基因幼苗的方法，包括以下步骤该方法包括主要包括以植株叶片为受体材料、供体菌株的培养、抑菌素浓度的确定、农杆菌转化条件的优化几个步骤，提供了一种适用于苹果砧木品种“M26”农杆菌转化体系。本发明通过优化农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件，提供了一套适合苹果矮化砧木“M26”的农杆菌介导转化体系，本发明克服了现有农杆菌介导技术遗传转化效率低的缺陷，建立起以叶片为受体材料的高效农杆菌转化体系。通过本发明获得转基因植株苹果矮化砧木“M26”植株的抗盐性等的抗逆性明显增强。
文档编号C12N15/84GK102031270SQ20091002419
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者冯凤娟, 师守国, 张燕子, 李永红, 马锋旺 申请人:西北农林科技大学