专利名称：：柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的制备方法
技术领域：
：本发明属于啤酒发酵方法
技术领域：
，具体涉及到种酵母。
背景技术：
：啤酒酵母菌是酉隨葡萄酒、啤酒和其他果酒时最主要、最常用的酒精发酵菌种，多年来在酿酒行业中许多人一直致力于寻找研究固定啤酒酵母菌的新材料、固定新技术。迄今为止，固定啤酒酵母菌的方法可归纳为4种吸附法、包埋法、交联法和自絮凝的无载体固定，研究和应用最为广泛的固定方法是包埋法。用于啤酒酵母菌包埋的载体主要分为两类其一为高分子凝胶载体，如琼脂、角叉菜胶、壳聚糖和海藻酸钠等，另一类为有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶、光硬化树脂等。天然高分子凝胶一般对微生物无毒，传质性能较好，但强度较低，在厌氧条件下已被微生物分解，使用寿命短，在发酵过程中不能长久反复利用，如包埋酵母菌常用的海藻,内在含高浓度的磷酸盐或在含WMg+、K+等阳离子溶液中形成的凝胶不稳定、易破碎和溶解；有机合成的高分子凝胶强度好于天然高分子凝胶，但这些高分子物质大部分有毒性，在使用过程中污染发酵液；另外它们形成的凝胶传质性能较差，在对细胞进行包埋的过程中，因自身的毒性和凝胶交联过程中放热，降低了酵母菌的活性。中国是歪柿的原产国，也是主产国，有丰富的柿资源。柿果富含单宁，青柿果含单宁2%以丄单宁是一种天然高分子酚类化合物，自身可进行酚羟基的縮合反应，产生凝胶，木材胶黏剂、金属络合剂的栲胶、烤漆就是利用这一原理，从富含单宁的植物材料中提取单宁，再经过縮合而形成胶团。另外，柿单宁的大量酚羟基与蛋白质主链的氨基羧基之间通过疏水和氢键作用也可发生交联反应，产生凝胶
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服上述包埋酵母菌方法的缺点，提供一种安全、无毒、包埋率高、能最大程度的保持啤酒酵母菌活力的柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的制备方法。解决上述技术问题所采用的方案由下述步骤组成1、提取柿单宁取打浆机粉碎的青柿果，按青柿果与提取剂、盐酸的质量比为l:4:0.05加入提取器的烧瓶中，在90"C回流提取20^I中，再重复提取2次，合并3次提取液，室温静置1小时，抽滤，除去残渣，滤液用旋转薄膜蒸发仪于455(TC减压浓縮至相对密度为1.21.3g/cm3、蒸发，除去提取剂，得粗提取物，将活化好的AB-8大孔吸P(嫩月^A3.5cmX80cm色谱柱中，fflM取働B蒸馏水^f畢至10呢/mL，以2mL/分钟上柱，充分吸附，用蒸馏水淋洗至洗出液用苯酚-硫酸法检测不出糖为止，再用3倍f據体积的提取剂以2mL/分钟洗脱，将洗脱液用旋转薄膜蒸发仪于455(TC蒸发，除去提取剂和部分水，再用真空冷冻干燥机真空干燥，冷阱温度为-5(TC，绝对真空度为50100Pa，得到柿单宁粗品。上述的提取剂是质量浓度为50%的甲醇水溶液、质量浓度为50%的丙酮水溶液、质量浓度50%乙醇水溶液、蒸馏水中的任意一种，盐酸为分析纯。2、配审赂液用无菌蒸馏水将柿单宁粗品配制成质量浓度为3%6%的单宁水溶液，用蒸馏水配制质量浓度为2.5%4%的明胶水溶液和质量浓度为1%3。/。的聚乙烯醇水溶液。3、制备啤酒酵母菌菌悬液将啤酒酵母菌在25mL麦芽汁液体培养基中30。C活化24小时，再在250mL麦芽汁培养基中3(TC扩大培养3天，制备成啤酒酵母菌增殖培养液，装入无菌离心管中，3000转/力H中离心10分钟，倾去上清液，得到菌体，用无菌蒸馏水洗涤菌体，在相同条件再离心菌体，得湿菌体，加入无菌蒸馏水，制成菌液浓度为2.8Xl(T个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，备用。上述的麦芽汁培养基是可溶性固形物(可溶性固形物为GB/T12295-90水果、蔬菜制品可溶性固形物含量测定一折射仪法的测试指标。)浓度为10%的麦芽汁培养基。4、制备柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌将质量浓度为2.5%4%的明胶7乂溶液和交联剂在110T:灭菌15分钟，冷却至2545°C，将质量浓度为2.5%4%的明胶水溶液和交联剂混合，搅拌均匀，加入菌液浓度为2.8Xl(T个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，混合均匀，2545'C水浴中保温，搅拌过程中缓優加入质量浓度为3%6%的单宁水溶液，质量浓度为2.5%4%的明胶水溶液与交联剂、菌液浓度为2.8X10'('个/mL的啤酒酵母菌菌悬液、质量浓度为3%6%的单宁水溶液的体积比为1:0.025:0.25:1，单宁与明胶发生凝胶化作用，形成包埋剂，包埋啤酒酵母菌，包埋完毕后，室温静置12小时，过80目筛，分离聚沉物，制备成柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌。上述交联剂是质量浓度为1%3°/。的聚乙烯醇水溶液或质量浓度为P/。的CaCl2水溶液。5、柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌保存将柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌保存在04。C冰箱内。在本发明的步骤2中，优选配帝顿量浓度为4%6%的单宁水溶液、质量浓度为2.5%3.5%的明胶水溶液和交联剂；在步骤4中，优选质量浓度为2.5%3.5°/。的明胶水溶液和交联剂，在110。C灭菌15分钟、冷却至2535。C、将质量浓度为2.5%3.5%的明胶水溶液和交联剂混合，搅拌均匀，加入菌液浓度为2，8Xl(T个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，混合均匀，优选2535。C水浴中保温、搅拌过程中缓慢加入质量浓度为4%6%的单宁水溶液，交联齐1」优选为质量浓度为1%2%的聚乙烯醇水溶液。在本发明的步骤2中，最佳配制质量浓度为4.5%的单宁水溶液、质量浓度为3%的明胶水溶液和交联剂；在步骤4中，最佳质量浓度为3°/。的明胶水溶液和交联剂在110r灭菌15分钟、冷却至25°C，将最佳质量浓度为3%的明胶水溶液和交联剂混合，搅拌均匀，加入菌液浓度为2.8X10"个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，混合均匀，最佳25'C7K浴中保温、搅拌过程中缓慢加入质量浓度为4.5%的单宁水溶液，交联剂最佳为质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液。本发明以天然无毒的柿单宁为基础材料，根据单宁自身的縮合性和蛋白质之间的膨疑作用原理，与明胶蛋白反应，包埋啤酒酵母菌，克服了形成的凝胶不稳定、易破碎和溶解、有毒性，对细胞进行包埋的过程中，因自身的毒性和凝胶交联过程中放热，降低了酵母菌的活性，在发酵过程中不能长久反复禾拥、啤酒酵母菌使用寿命短等缺点。经过大量的实验研究，结果表明，本发明制备的柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌使用寿命长、发酵速度高、能最大程度的保持酵母菌的发酵活力。图1是实施例l制备的柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌的扫描电镜图。具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例l以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其4也原茅斗和酉己比以及制备方法如下1、提取柿单宁取打浆机粉碎的青柿果100g，加入提取器的烧瓶中，加入400g质量浓度为50。/。的丙酮水溶液和5g盐酸，青柿果与质量浓度为50%的丙酮水溶液、盐酸的质量比为1:4:0.05，在90'C回流提取20分钟，再重复提取2次，合并3次提取液，室温静置1小时，抽滤，除去残渣，滤液用旋转薄膜蒸发仪于45'C减压浓縮相对密度为l.21.3g/cm3、蒸发，除去丙酮和水，得粗提取物；取AB-8大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24小时，充分溶胀，除去上浮树脂碎片和杂物，湿法装柱，用95%乙醇洗至流出液无白色浑浊现象，用蒸馏水洗至无醇味，再用34倍柱床体积的质量浓度为5。/。的HCl溶液以每小时2倍树脂床体积的流速通过树脂柱，水洗至中性，用34倍柱床体积的质量浓度为2。/。的NaOH溶液以相同流速通过树脂柱，7乂洗至中性，浸泡于蒸馏水，得到活化好的AB-8大孔吸附树脂；将活化好的AB-8大孔吸附树脂装入3.5cmX80cm色谱柱中，粗提取物加蒸馏TK稀释至IOmg/mL，以2mL/分钟上柱，充分吸附，用蒸馏7夂淋洗至洗出液用苯酚-硫酸法检测不出糖为止，再用3倍柱床体积的提取剂以2mL/^H中洗脱，将洗脱液用旋转薄膜蒸发仪于45。C蒸发，除去提取剂和部分蒸馏7jC，再用真空冷冻千燥机真空千燥，冷阱温度-50°C，绝对真空度50100Pa，得到柿单宁;fi品，单宁的提取率为80.82%。2、配制溶液按常规方法用无菌蒸馏水将柿单宁粗品配制成质量浓度为4.5%的单宁水溶液，用蒸馏水配制质量浓度为3%的明胶水溶液和质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液。3、制备啤酒酵母菌菌悬液将啤酒酵母菌在25mL可溶性固形物为l(m的麦芽汁液体培养基中30"C活化24小时，再在250mL可溶性固形物为10。/。的麦芽汁培养基中3(TC扩大培养3天，制备成啤酒酵母菌增殖培养液，装入无菌离心管中，3000转/分钟离心10分钟，倾去上清液，得到菌体，用无菌蒸馏水洗涤菌体，在相同条件再离心菌体，得湿菌体，加入无菌蒸馏7jC，制成菌液浓度为2.8X10"'个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，备用。4、制备柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌将质量浓度为3。/。的明胶7jC溶液和质量浓度为l。/。的聚乙烯醇水溶液分别在110。C灭菌15分^中，冷却至25°C，取质量浓度为3%的明胶水溶液200mL、质量浓度为1°/。的聚乙烯醇水溶液5mL混合，搅拌均匀，加入菌液浓度为2.8Xl(f个/mL的啤酒酵母菌菌悬液50mL，混匀，在25"C7jC浴中保温，在搅拌过程中缓慢加入质量浓度为4.5站勺单宁水溶液200mL，质量浓度为3%的明胶水溶液与质量浓度为1°/。的聚乙烯醇7JC溶液、菌液浓度为2.8Xl(T个/mL啤酒酵母菌菌悬液、质量浓度为4.5%的单宁水溶液的体f^比为l:0.025:0.25:1，单宁与明胶发生凝^交化作用，形成包埋剂，包埋啤酒酵母菌，包埋完毕后，室温静置12小时，过80目筛，分离聚沉物，制备成柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌。5、柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌保存将柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌保存在(T4。C冰箱内。实施例2以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其他原料和配比以及制备方法如下在实施例1的步骤2中，用无菌蒸馏水将柿单宁粗品配制成质量浓度为3%的单宁7K溶液，用蒸馏水配帝顿量浓度为2.5%的明胶水溶液和质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液。在步马聚4中，所用的质量浓度为3%的明胶水溶液用等体积的质量浓度为2.5%的明胶7乂溶液替换，质量浓度为4.5%的单宁水溶液用等体积的质量浓度为3%的单宁7K溶液替换，该步骤的其他步骤与实施例l相同。其他步骤与实施例l相同。实施例3以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其他原料和配比以及制备方法如下-在实施例1的步骤2中，用无菌蒸馏水将柿单宁粗品配制成质量浓度为6%的单宁7jC溶液，用蒸馏7綠己制质量浓度为4%的明胶水溶液和质浓度为3%的聚乙烯醇水溶水溶液替换，质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液用等体积的质量浓度为4%的聚乙烯醇水溶液替J奂，质量浓度为4.5%的单宁水溶液用等体积的质量浓度为6%的单宁水溶液替换，该步骤的其他步骤与实施例l相同。其他步骤与实施例l相同。实施例4以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其4也原料和配比以及制备方法如下在实施例13的步骤1中，所用质量浓度为50%的丙酮水溶液用等体积的质量浓度为50%的甲醇水溶液替换。在步骤4中，所用聚乙烯醇水溶液用等体禾只的质量浓度为P/。的CaCl冰溶液替换，该步骤的其他歩骤与相应的实施例相同。其j也步骤与实施例1相同。实施例5以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其他原料和配比以及制备方法如下在实施例13的的步骤1中，所用质量浓度为50%的丙酮水溶液用等体积的质量浓度为50%的乙醇7jC溶液替换。其他步骤与实施例1相同。实施例6以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其他原料和配比以及制备方法如下在实施例13的步骤1中，所用质量浓度为50%的丙酮水溶液用等体积的蒸馏水替换。其他步骤与实施例l相同。实施例7以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其他原料和配比以及制备方法如下在实施例16的步骤4中，110"灭菌15分钟，冷却至35。C，在35。C水浴中保温，该歩骤的其他步骤与相应的实施例相同。其他步骤与实施例l相同。实施例8以制备柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌所用原料打浆机粉碎的青柿果IOOg为例，所用的其他原料和配比以及制备方法如下在实施例16的步骤4中，110'C灭菌15分钟，冷却至45°C，在45。C水浴中保温，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。其他步骤与实施例l相同。为了确定本发明的最佳配比以及最佳工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研究，各种实验情况如下实验祠t斗涩柿，牛心柿果，2007年7月10日采摘于陕西省长安区郭杜镇；菌株，啤酒酵母菌(&cc力aro膠cescerew'a'ae)，保存于陕西师范大学食品工程与营养科学学院食品发酵实验室。实验j义器JSM-6700F扫描电镜，由日本电子有限公司生产；S.SW-CJ-1F型净化工作台，由上海跃进医疗器械厂生产；Motic(BA200)光学显微镜；隔水式(GSP-908(MBE)电热恒温培养箱，由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；高压灭菌器，由上海佳腾实验设备有限公司生产；UN工C02000型可见分光光度计，由上海尤尼柯i义器有限公司生产。测定方法(1)观IJ定菌悬液菌数采用血球板计数法；(2)测定总齡量采用斐林试剂法；(3)测定单宁含量采用香草醛/硫酸比色法；(4)测定表观发酵度采用阿贝折光仪测定发酵前和发酵后麦芽汁的糖度，并按下式i十算表观发酵度表观雄度(%)=原始芽汁糖度xl,原始麦芽汁糖度(5)观i淀真实发酵速度测定发酵前发酵液总糖的含量及发酵36小时后发酵液中残糖的含量，用下式计算真实发酵速度真实发酵速度=忌、翻t;j糖含量x，。总禾屠3里(6)测定菌悬液浓度采用比浊法，用分光光度计在波长600nm测定光密度(0D)。(7)测定包埋率在600nm，用可见分光光度计分别测定包埋前菌悬液的0D值和包埋后菌悬液的OD值，用下式计算包埋率f]一包埋前菌悬液OD值-包埋后菌悬液OD值x一包埋前菌悬液OD值x0取10g用打浆机粉碎的青柿果共7份，分别置于7个提取器的烧瓶中，柿果单宁含量为2.78%，分别加入40g无水甲醇、无水乙醇、无水丙酮、质量浓度为50%的甲醇水溶液、质量浓度为50%的丙酮水溶液、质量浓度为50%的乙醇水溶液、蒸馏水作为提取齐U，再分别加入盐酸0.5g，在90'C回流提取20分钟，再重复提取2次，合并3次提取液，室温静置l小时，抽滤，除去残渣，滤液用旋转薄膜蒸发仪于455(TC减压浓缩至相对密度为1.21.3g/crri'、蒸发，除去提取剂，得粗提取物。取AB-8大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24小时，充分溶胀，除去上浮树脂碎片和杂物，湿法装柱，用95%乙醇洗至流出液无白色浑浊现象，用蒸馏水洗至无醇味，再用34倍柱床体积的质量浓度为5。/。的HCl溶液以每小时2倍树脂床体积的流速通过树脂柱，水洗至中性，用34倍柱床体积的质量浓度为2灿勺NaOH溶液以相同流速通过树脂柱，水洗至中性，浸泡于蒸馏水，得至赔化好的AB-8大孔吸附树脂。将活化好的AB-8大孔吸附树脂装入3.5cmX80cm色谱柱中，粗提取物加蒸馏水稀释至10mg/mL，以2mL/分钟上柱，充分吸附，用蒸馏水淋洗至洗出液用苯酚-硫酸法检测不出糖为止，再用3倍柱床体积的提取剂以2mL/分钟洗脱，将洗脱液用旋转薄膜蒸发仪于455(TC蒸发，除去提取剂和部分水，再用真空冷冻干燥机真空干燥，冷阱温度为-5(TC，绝对真空度为50100Pa，得到柿单宁粗品，按下式计算提取率粗单宁提取;l提取率(％)=鲜果总单宁含实验和计算结果见表l。表1不同提取齐树柿单宁提取效果的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表1可见，质量浓度为50%的甲醇水溶液和质量浓度为50%的丙酮水溶液提取率较高，分别为80.82%和82.91%。2、不同提取剂提取的柿单宁对酵母菌包埋率的影响取质量浓度为1%的明胶水溶液200mL、菌液浓度为2.8X1(T个/mL的啤酒酵母菌菌悬W支50mL共7份，分别置于7个烧杯中，混合均匀，25'C7]C浴中保、温，在搅拌过禾呈中分别缓慢加入不同提取剂提取的质量浓度为3%的单宁水溶液200mL，发生凝胶IM乍用，质量浓度为1%的明胶水溶液与菌液浓度为2.8Xl(f个/mL的啤酒酵母菌菌悬液、质量浓度为3%的单宁水溶液的体积比为1:0.25:1。单宁与明胶发生凑赶交化作用，形成包埋剂，包埋啤酒酵母菌，包埋完毕后，室温静置12小时，过80目筛，分离聚沉物，制备成柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌。测定不同提取剂提取的柿单宁制备的凝胶对啤酒酵母菌的包埋率，实验结果见表2。表2不同提取剂提取的柿单宁对酵母菌包埋率的影响提取剂^tK甲醇无水乙醇无水内S蒸馏水50%甲醇'水溶液50%乙醇水溶液50%丙酮水溶液包埋率(％)28.9237.6039.8263.2158.3060.1261.21由表2可见，无水甲醇、无水乙醇、无水丙酮的包埋率最低；用质量浓度为50%的有机溶剂7jC溶液提取的柿单宁制备的凝胶包埋剂，包埋率略低于蒸馏水。综合实验1和实验2的结果表明，质量浓度为50%的甲醇水溶液、质量浓度为50%的丙酮水溶液、质量浓度50%乙醇水溶液、蒸馏水的包埋率较高。优选质量浓度为50%的甲醇水溶、液或质量浓度为50%的丙酮7乂溶液作为柿单宁提取剂。以下实验均采用质量浓度为50%的丙酮水溶液为提取剂。3、交联齐树柿单宁与明胶形成凝胶的效果影口向取质量浓度为1%的无菌明胶水溶液200raL共5份，其中一份不加任何物质作为对照，其他4份分别加入5inL质量浓度为iy。的聚乙烯醇(PVA)7jC溶液、质量浓度为P/o的CaCl2水溶液、质量浓度为40%的甲醛溶液、质量浓度为40%的双氧水，所用的其他原料以及操作歩骤与实验2相同。用无菌蒸馏水冲洗柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌，取柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌12g(湿重)投入到50mL含可溶性固形物为10%的麦芽汁培养基中，28。C发酵36小时，测其表观发酵度。实验结果见表3。表3交联剂对柿单宁与明胶形成凝胶的效果影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表3可见，以质量浓度为1%的PVA作交联剂，表观发酵度最高，其次是加了aCl2水溶液形成的凝胶的表观发酵度。以质量浓度为40%的甲醛、质量浓度为40%的双氧水作交联剂，表观发酵度较低，因为甲醛、双氧水都是强抑菌剂，对酵母细胞有毒害作用，以它们为交联剂，大多数酵母菌被杀死，仅剩下少许酵母菌有活性。质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液或1。/。CaCl2水溶液为交联剂的表^l发酵度较好。4、单宁浓度对啤酒酵母菌包埋率的影响取明胶水溶液与质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液、啤酒酵母菌菌悬液的混合液共9份，在不断搅拌中分别缓慢的加入无菌蒸馏水配制成2%、2.5%、3%,3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6y。的单宁水溶液各200mL，所用的其他原料以及操作步骤与实验2相同。包埋完毕后，取上清液用可见分光光度计在600nm测OD值，计算不同单宁浓度时啤酒酵母菌的包埋率。实验和计算结果见表4。表4单宁浓度对啤酒酵母菌包埋率的影响单宁浓度(％)22.533.544.555.56包埋率(％)10.021.343.457.263.267.469.370.070.6由表4可见，单宁的质量浓度为3%6%时，包埋率较高，包埋率随着单宁浓度的增加而增加，当单宁浓度大于4.5%时，包埋率增加幅度变缓。本发明选择单宁的质量浓度为3%6%，其中最佳浓度为4.5°/。。5、聚乙烯醇浓度对啤酒酵母菌包埋率的影响取200mL质量浓度为1%的明胶水溶液共8份，分别加入5mL质量浓度为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的聚乙烯醇(PVA)水溶液，再加入质量浓度为4.5%的单宁水溶液，所用的其他原料以及操作步骤与实验2相同。柿单宁与明胶发生凝胶作用，形成包埋剂，包埋啤酒酵母菌，包埋完毕后，分别取上清液测0D值，计算啤酒酵母菌的包埋率。实验和计算结果见表5。表5聚乙烯醇水'溶液浓度对啤酒酵母菌包埋率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表5可见，交联剂聚乙烯醇的质量浓度为1%3%时，啤酒酵母菌的包埋率较高，随着聚乙烯醇浓度的继续增加，包埋率逐渐减小，'本发明选择交联剂的质量浓度为1%3%，最佳质量浓度为1%。6、明S交浓度对啤酒酵母菌包埋率的影响分别取200mL质量浓度为1%、1.5%、2%、2.5°/。、3%、3.5%、4.0%的明胶水溶液共7份，所用的其他原料以及操作与实验2相同。柿单宁与明胶发生凝胶作用，形成包埋剂，包埋啤酒酵母菌，包埋完毕后，分别取上清液测0D值，计算啤酒酵母菌的包埋率。实验和计算结果见表6。表6明胶浓度对啤酒酵母菌包埋率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表6可见，啤酒酵母菌的包埋率随着明胶浓度的增大而增大，当明胶的质量浓度>3%时，包埋率增大不明显，趋于平衡。实验结果表明，不同浓度的明胶与柿单宁反应形成凝胶时，明胶浓度小所形成凝胶比较困难，所需的时间较长，明胶浓度大时比较容易成形。进行发酵后，固定化颗粒未见破碎，溶液透明澄清与发酵液没有区别，反应良好。本发明选择质量浓度为2.5%4%的明胶水溶液与单宁反应包埋啤酒酵母菌，优选质量浓度为2.5%3.5%的明胶水溶液，最佳质量浓度为3%的明胶水溶液。7、温度对啤酒酵母菌包埋率的影响取质量浓度为3.0%的无菌明胶水溶液200mL、质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液5mL、菌液浓度为2.8X1(T个/mL的啤酒酵母菌菌悬液50mL共5份，分别置于1000mL的烧杯中，混合均匀，分别在25。C、30。C、35。C、40。C、45。C水浴中保^显，搅拌过程中分别缓優地加入质量浓度为4.5%的单宁水溶液200mL，所用的其他原料以及操作步骤与实验2相同。柿单宁与明胶发生凝胶作用，形成包埋剂，包埋啤酒酵母菌，包埋完毕后，取上清液测0D值，计算啤酒酵母菌的包埋率，实验和计算结果见表7。表7^^对啤酒酵母菌包埋率的影响鹏(。c)2530354045包埋率(％)73.9473.6963.5253.4650.56由表7可见，柿单宁凝胶对啤酒酵母菌的包埋率随着形成凝胶温度的升高反而减小，2545。C的包埋率较高。本发明选择形成凝胶的温度为2545。C，最佳为25。C。8、柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的微观结构根据实施例1制备成柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌，用扫描电镜观测其表面微观结构，结果见图l。由图la可见，柿单宁凝胶呈不规则的表面形态，凝胶内部具有较疏松的多孔网状结构，这种结构为固定化细胞的栖息和繁殖提供了良好的微环境，便于营养物质和代谢物质的传递，更适合微生物的生长；由图lb和图lc可见，柿单宁凝胶中有很多啤酒酵母菌，说明用柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌有利于啤酒酵母菌的繁殖。9、柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的发酵效果取pH值为6.0、初始可溶性固形物为12%的麦芽汁培养基100mL共3份，分别装入500mL的三角瓶中，再分别加入5g游离酵母菌菌悬液、柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌、常用的海藻酸钠-药固定的酵母菌包埋剂，发酵温度为30°C，发酵36小时，观ij定真实发酵度。实验结果见表8。表8柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的发酵效果酵母菌类型、游禺的啤、目母菌菌悬液柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌海藻Mh钙固定啤酒酵母菌真实发酵度(％)73.2286.5184.71由表8可见，在同一条件，柿单宁溶液和明胶溶液形成凝胶，固定的啤酒酵母菌的真实发酵度高，达86.51%。权利要求1、一种柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的制备方法，其特征在于他是由下述步骤组成(1)提取柿单宁取打浆机粉碎的青柿果，按青柿果与提取剂、盐酸的质量比为1∶4∶0.05加入提取器的烧瓶中，在90℃回流提取20分钟，再重复提取2次，合并3次提取液，室温静置1小时，抽滤，除去残渣，滤液用旋转薄膜蒸发仪于45～50℃减压浓缩至相对密度为1.2～1.3g/cm3、蒸发，除去提取剂，得粗提取物，将活化好的AB-8大孔吸附树脂装入3.5cm×80cm色谱柱中，粗提取物加蒸馏水稀释至10mg/mL，以2mL/分钟上柱，充分吸附，用蒸馏水淋洗至洗出液用苯酚-硫酸法检测不出糖为止，再用3倍柱床体积的提取剂以2mL/分钟洗脱，将洗脱液用旋转薄膜蒸发仪于45～50℃蒸发，除去提取剂和部分水，再用真空冷冻干燥机真空干燥，冷阱温度为-50℃，绝对真空度为50～100Pa，得到柿单宁粗品；上述的提取剂是质量浓度为50％的甲醇水溶液、质量浓度为50％的丙酮水溶液、质量浓度50％乙醇水溶液、蒸馏水中的任意一种，盐酸为分析纯；(2)配制溶液用无菌蒸馏水将柿单宁粗品配制成质量浓度为3％～6％的单宁水溶液，用蒸馏水配制质量浓度为2.5％～4％的明胶水溶液和质量浓度为1％～3％的聚乙烯醇水溶液；(3)制备啤酒酵母菌菌悬液将啤酒酵母菌在25mL麦芽汁液体培养基中30℃活化24小时，再在250mL麦芽汁培养基中30℃扩大培养3天，制备成啤酒酵母菌增殖培养液，装入无菌离心管中，3000转/分钟离心10分钟，倾去上清液，得到菌体，用无菌蒸馏水洗涤菌体，在相同条件再离心菌体，得湿菌体，加入无菌蒸馏水，制成菌液浓度为2.8×1010个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，备用；上述的麦芽汁培养基是可溶性固形物浓度为10％的麦芽汁培养基；(4)制备柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌将质量浓度为2.5％～4％的明胶水溶液和交联剂在110℃灭菌15分钟，冷却至25～45℃，将质量浓度为2.5％～4％的明胶水溶液和交联剂混合，搅拌均匀，加入菌液浓度为2.8×1010个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，混合均匀，25～45℃水浴中保温，搅拌过程中缓慢加入质量浓度为3％～6％的单宁水溶液，质量浓度为2.5％～4％的明胶水溶液与交联剂、菌液浓度为2.8×1010个/mL的啤酒酵母菌菌悬液、质量浓度为3％～6％的单宁水溶液的体积比为1∶0.025∶0.25∶1，单宁与明胶发生凝胶化作用，形成包埋剂，包埋啤酒酵母菌，包埋完毕后，室温静置12小时，过80目筛，分离聚沉物，制备成柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌；上述交联剂是质量浓度为1％～3％的聚乙烯醇水溶液或质量浓度为1％的CaCl2水溶液；(5)柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌保存将柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌保存在0～4℃冰箱内。2、按照权利要求l所述的柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的制备方法，其特征在于:在步骤2中，配制质量浓度为4%6%的单宁水溶液、质量浓度为2.5%3.5%的明胶水溶液和交联剂；在步骤4中，质量浓度为2.5%3.5%的明胶水溶液和交联剂在110。C灭菌15分钟，冷却至2535°C，将质量浓度为2.5%3.5%的明胶水溶液和交联剂混合，搅拌均匀，加入菌液浓度为2.8X10"'个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，混合均匀，2535。C水浴中保温、搅拌过程中缓優加入质量浓度为4%6%的单宁水溶液，交联剂为质量浓度为1%2%的聚乙烯醇水溶液。3、按照权利要求1所述的柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的制备方法，其特征在于在步骤2中，酉己制质量浓度为4.5%的单宁水溶液、质量浓度为3%的明胶水溶液和交联剂；在步骤4中，质量浓度为3%的明胶水溶液和交联剂在110"C灭菌155H中，冷却至25X:，将质量浓度为3%的明胶水溶液和交联剂混合，搅拌均匀，加入菌液浓度为2.8X1(T个/mL的啤酒酵母菌菌悬液，混合均匀，25T水浴中保温，搅拌过程中缓慢加入质量浓度为4.5%的单宁水溶液，交联剂为质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液。全文摘要一种柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌的制备方法，由提取柿单宁、配制溶液、制备啤酒酵母菌菌悬液、制备柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌、柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌保存步骤组成。采用本发明制备的柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌，用扫描电镜观测其表面微观结构，柿单宁凝胶呈不规则的表面形态，凝胶内部具有较疏松的多孔网状结构，为固定化细胞的栖息和繁殖提供了良好的微环境，便于营养物质和代谢物质的传递，适合微生物的生长，有利于啤酒酵母菌的繁殖。柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌与游离酵母菌菌悬液、海藻酸钠-钙固定的酵母菌包埋剂的发酵效果对比实验表明，在同一条件，柿单宁溶液和明胶溶液形成凝胶，固定的啤酒酵母菌的真实发酵度高，达86.51％。文档编号C12N11/04GK101638648SQ20091002374公开日2010年2月3日申请日期2009年8月31日优先权日2009年8月31日发明者烛姜,张宝善,军王,陈锦屏申请人:陕西师范大学