啤酒废酵母中谷胱甘肽和核糖核酸的高效提取的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种从啤酒废酵母中高效提取谷胱甘肽和核糖核酸的生产方法，其步骤包括：加入两性生物絮凝剂，对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附。将湿酵母进行酶辅助热破胞抽提，离心收集上清。将上清液采用截留孔径为10000道尔顿的陶瓷膜进行超滤，分子量大于10000为核酸和大分子杂蛋白，小于10000为谷胱甘肽和小分子杂质。将核糖核酸大分子蛋白经硅胶柱吸附，95％乙醇洗柱，60℃无菌水洗脱，干燥得高纯度核酸。谷胱甘肽小分子杂质经纳滤，扩张床亲和层析，浓缩，乙醇沉淀干燥后得谷胱甘肽。本发明得到的产品具有纯度高、生物活性好，可循环利用废弃物，环保高效，同时降低了生产成本，适于大规模工业化生产。
【专利说明】啤酒废酵母中谷胱甘肽和核糖核酸的高效提取
一、【技术领域】
[0001]本项目自主研发啤酒废酵母高效提取技术制备谷胱甘肽和核糖核酸工艺，涉及微生物有效脱苦、除杂技术，破胞技术，相容性高效分离和纯化技术，多酶复合、可靠酶解技术生产谷胱甘肽和核糖核酸。
二、技术背景
[0002]啤酒废酵母细胞内含有丰富的蛋白质、核酸、维生素、碳水化合物、类脂物质、矿物质等多种营养成分。以干重计算，啤酒酵母中含有4%?8%的核糖核酸(RNA)、50%的蛋白质(含有18种氨基酸)、1%的谷胱甘肽，2%的B族维生素、。在啤酒废酵母含有的18种氨基酸中，其中人体必需的8种氨基酸含量及氨基酸的组成比例接近联台国粮农组织(FAO)推荐的理想氨基酸的比例，因此啤酒废酵母对于生物的生长和代谢具有极佳的营养价值，利用啤酒废酵母生产的发酵培养基对动物和微生物的生长具有积极作用。此外，从啤酒废酵母中还可以提取多种高附加值生理活性物质，如谷胱甘肽、核糖核酸、葡聚糖等物质。其中，谷胱甘肽是一种具有抗氧化和解毒功能的寡糖，对于人体具有消除自由基、提高免疫力、抗衰老和抗肿瘤等多种有益作用，已在医药、食品领域得到了广泛应用，具有重要的经济价值。核糖核酸是制备核苷酸的重要原料，在食品、植物生长调节剂和医药生产中具有广泛的应用价值。
[0003]目前，啤酒废酵母在国外已得到了综合利用，通过利用啤酒废酵母生产高档培养基和提取生理活性成分产生了巨大的经济效益。例如，日本啤酒行业对啤酒废酵母的利用情况为:50%的啤酒废酵母被用于生产混合饲料；20%被用于提取多种营养因子，用于生产强化食品和功能性食品；17?18%被用于提取各种生理活性物质，用于生产药品和保健品；12?13%被用于生产强化饲料。但在国内，目前对啤酒废酵母的利用水平和利用度都非常低，大部分废酵母的利用方式是被烘干制成混合饲料或蛋白饲料添加剂。这导致我们每年都要从国外进口大量高档酵母提取物用于高端基因工程和细胞工程产品的发酵生产。虽然目前已有不少企业已开始对啤酒废酵母进行综合利用，以啤酒废酵母为原料生产蛋白提取物或提取生理活性物质，但由于所采用的技术不够先进和完善、生产规模小，导致对啤酒废酵母的利用存在技术水平较低、资源利用度不足、产品质量不高、企业效益不佳的局面。为了解决当前啤酒废酵母综合利用行业存在的低水平重复建设和无序竞争的问题，有必要对废啤酒酵母的高效、集约、综合利用技术进行攻关，开发高效率、高水平的啤酒废酵母综合利用技术和工艺，实现啤酒废酵母的高效和复合利用。
[0004]本项目研究采用两性生物絮凝剂对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附，实现在破胞前对啤酒废酵母进行清洗就能有效去除这些杂质；开发了谷胱甘肽和核酸的相容性高效分离、纯化技术；利用能专一性吸附核酸的硅胶树脂进行核糖核酸的吸附，实现对核糖核酸的高纯度、高收率提取；采用独有的扩张床亲和层析技术进行谷胱甘肽的特异性纯化，采用亲和选择性更高、亲和力更强的亲和层析来替代传统的离子交换层析来彻底解决杂质干扰的问题；采用酶工程技术对传统的蛋白酶进行了蛋白质工程改造，获得了具有更好的酶解性能的新型蛋白酶，并利用多酶复合、可控酶解技术，达到了蛋白质降解的最优化，为工业大规模生产谷胱甘肽和核糖核酸提供可靠的理论依据。本发明利用啤酒废酵母高效提取谷胱甘肽和核糖核酸，其生产工艺简单，产率大，适于大规模生产。
三、
【发明内容】
[0005]1.采用对啤酒废酵母高效加工和利用来制备谷胱甘肽和核糖核酸，
[0006]包括以下几个步骤:
[0007](I)两性生物絮凝剂应用于啤酒废酵母脱苦、去杂处理
[0008]在啤酒废酵母细胞内外存在大量在啤酒酿造过程中产生的苦味和色素物质。这些物质不仅会影响所制备的酵母抽提物的色泽和气味，而且还会干扰亲和层析介质对谷胱甘肽的选择吸附、降低谷胱甘肽的分离和纯化效果。传统去除这些物质的方法是对啤酒废酵母细胞进行反复清洗。这种方法不仅会消耗大量的水和能量，而且仅能去除亲水性色素和苦味物质、对亲脂性色素和苦味物质的去除效果不佳。本项目创造性地采用两性生物絮凝剂对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附，只需在破胞前对啤酒废酵母进行一次清洗，就能有效去除这些杂质。然后放置在冰箱中沉降絮凝，用鼓式过滤机连续过滤去杂后得湿酵母。这不仅为谷胱甘肽的提取和高端酵母提取物的制备创造了有利条件，而且简化了工艺步骤，减少了生产用水，降低了后续对废水进行回收和处理的负荷，具有显著的经济和环保效益。对于清洗产生的废水，则设置清洗废水的循环回收处理装置，收集清洗废水过滤后进行连续的好氧和厌氧处理，在降低废水BOD的同时生产沼气作为锅炉燃料，处理后的水一部分循环用于酵母的清洗，另一部分用于设备的冲洗，达到废水零排放。
[0009](2)多酶复合、可靠酶解技术应用于啤酒废酵母酶辅助热破胞抽提
[0010]谷胱甘肽和核酸都位于酵母细胞内，要提取谷胱甘肽和核酸，首先要采取有效手段对酵母细胞进行破胞处理，以实现谷胱甘肽和核酸的充分释放，同时又要避免谷胱甘肽和核酸的失活。本项目研发团队通过采用酶工程技术对传统的蛋白酶进行了蛋白质工程改造，获得了具有更好的酶解性能的新型蛋白酶，并利用多酶复合、可控酶解技术，对啤酒废酵母进行酶辅助热破胞抽提，达到了蛋白质降解的最优化。热水抽提谷胱甘肽:湿酵母与废水按1: 15质量比混合，加热到90°C后，快速冷却到20°C以下，再用盐酸调整pH值至3.5后离心收集上清液。
[0011](3)膜分离技术应用于谷胱甘肽和核酸的相容性高效分离、纯化
[0012]在酵母破胞过程中，不仅会释放出谷胱甘肽，胞内的一些蛋白质和多肽分子也会同时释放。研究发现，某些蛋白质和多肽分子不仅会干扰谷胱甘肽的分离与纯化、降低谷胱甘肽的回收率，而且会发生核酸的降解，显著降低核酸的收率。因此，如何排除这些物质的干扰，保证谷胱甘肽的回收率是从啤酒废酵母中制备谷胱甘肽和核酸的一个关键技术问题。由于啤酒废酵母破胞液中存在干扰谷胱甘肽分离纯化的蛋白质、多肽、寡肽等杂质，传统的离子交换树脂吸附法在分离谷胱甘肽时存在吸附效率低、谷胱甘肽回收率和产品纯度不高的不足。同时，为了实现对啤酒废酵母中核酸和谷胱甘肽的同步提取，必须对传统的提取方法进行创新性的改造。针对这一问题，本项目团队从两个方面对谷胱甘肽和核酸的分离和纯化方法进行了创新，开发了谷胱甘肽和核酸的相容性高效分离、纯化技术。谷胱甘肽和核糖核酸属于两种完全不同的物质，在分子量、电荷等性质上存在较大差异。在已有的啤酒废酵母综合利用的研究和报道中，都未有同时提取谷胱甘肽和核糖核酸的先例。因此，将这两个物质的提取工艺进行整合，实现这两个物质的同时提取，不仅是项目的关键创新点，更是项目成功的关键。本项目采用截留孔径为10000道尔顿的陶瓷膜对破胞液进行超滤，通过超滤将破胞液中相对分子量大于10000的物质与小于10000的物质进行分离。前者包括一些核酸和大的蛋白质杂质，后者包括谷胱甘肽和一些分子量较小的杂质。由于在这一步实现了核糖核酸和谷胱甘肽的分流，因此在后续的分离纯化过程中，就不必再担心两种物质在提取方法上的不兼容性，只需分别关注各自的分离与纯化即可。
[0013](4)核糖核酸的分离纯化
[0014]对于核糖核酸的分离，传统方法是先通过盐析去除蛋白质杂质，然后再通过在酸性条件下进行等电点低温沉淀收集核糖核酸，再用酒精对核糖核酸沉淀进行洗涤进一步去除蛋白质。该方法虽然简单，但对蛋白质杂质的去除率不高，而且对核酸的回收率偏低，导致核酸的总收率偏低，产品纯度不高。针对这一问题，本项目团队利用能专一性吸附核酸的硅胶树脂进行核糖核酸的吸附，实现对核糖核酸的高纯度、高收率提取，使核糖核酸的收率达到4%。采用硅胶柱吸附(高盐低pH值)，实现对核酸的专一性吸附，去除蛋白质杂质，然后用95%的乙醇洗柱。60°C无菌水洗脱核糖核酸，喷雾干燥，得高纯度核糖核酸，产品纯度大于80%。
[0015](5)谷胱甘肽的分离纯化
[0016]对于谷胱甘肽的分离，首先采用截留孔径为100道尔顿的卷式膜进行纳滤，去除相对分子量小于100的杂质，同时实现对谷胱甘肽的浓缩。由于谷胱甘肽相对分子量为307.33，因此通过精心设定的超滤和纳滤处理，不仅能有效去除干扰谷胱甘肽分离纯化的杂质，而且谷胱甘肽的损失少、处理成本低。其次，为了进一步消除杂质对谷胱甘肽与离子交换树脂相互作用的干扰，本项目采用独有的扩张床亲和层析技术进行谷胱甘肽的特异性纯化，采用亲和选择性更高、亲和力更强的亲和层析来替代传统的离子交换层析来彻底解决杂质干扰的问题。由于传统的固定床亲和层析存在处理规模小、处理效率低的不足，本项目还将亲和层析与扩张床进行耦合，利用扩张床独具的上样量大、洗脱浓度高的优点，设计了新颖的扩张床亲和吸附层析工艺，使谷胱甘肽吸附的效率、回收率和纯化纯度等指标都同时得到了显著改善，一次吸附和洗脱可以从料液中回收超过80%以上的谷胱甘肽。洗脱液经纳滤浓缩、乙醇沉淀结晶、真空干燥后得谷胱甘肽成品，产品纯度大于90%。
[0017]该法生产核糖核酸和谷胱甘肽工艺简单，产率大，得到的产品纯度高、生物活性好，并实现了资源的综合利用，提高啤酒发酵产业的资源利用水平，同时降低了生产成本，适于大规模工业化生产。
【权利要求】
1.一种啤酒废酵母高效提取技术制备谷胱甘肽和核糖核酸的制备方法，其特征包括以下几个步骤: (1)两性生物絮凝剂应用于啤酒废酵母脱苦、去杂处理 废啤酒酵母泥加2倍以上冰水搅拌均匀，加入两性生物絮凝剂对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附，只需在破胞前对啤酒废酵母进行一次清洗，就能有效去除这些杂质。然后放置在冰箱中沉降絮凝，用鼓式过滤机连续过滤去杂后得湿酵母。 (2)多酶复合、可靠酶解技术应用于啤酒废酵母酶辅助热破胞抽提 通过采用酶工程技术对传统的蛋白酶进行了蛋白质工程改造，获得了具有更好的酶解性能的新型蛋白酶，并利用多酶复合、可控酶解技术，对啤酒废酵母进行酶辅助热破胞抽提，达到了蛋白质降解的最优化。热水抽提谷胱甘肽:湿酵母与废水按1: 15质量比混合，加热到90°C后，快速冷却到20°C以下，再用盐酸调整pH值至3.5后离心收集上清液。 (3)膜分离技术应用于谷胱甘肽和核酸的相容性高效分离、纯化 采用截留孔径为10000道尔顿的陶瓷膜对破胞液进行超滤，通过超滤将破胞液中相对分子量大于10000的物质与小于10000的物质进行分离。前者包括一些核酸和大的蛋白质杂质，后者包括谷胱甘肽和一些分子量较小的杂质。谷胱甘肽和核糖核酸属于两种完全不同的物质，在分子量、电荷等性质上存在较大差异。在已有的啤酒废酵母综合利用的研究和报道中，都未有同时提取谷胱甘肽和核糖核酸的先例。而本项目的这一步实现了谷胱甘肽和核糖核酸的分流，从而达到了对这两个物质的同时提取。因此在后续的分离纯化过程中，就不必再担心两种物质在提取方法上的不兼容性，只需分别关注各自的分离与纯化即可。 (4)核糖核酸的分离纯化 利用能专一性吸附核酸的硅胶树脂进行核糖核酸的吸附，实现对核糖核酸的高纯度、高收率提取，使核糖核酸的收率达到4%、纯度大于80%。硅胶柱吸附(高盐低pH值)，实现对核酸的专一性吸附，去除蛋白质杂质，然后用95%的乙醇洗柱。60°C无菌水洗脱核糖核酸，喷雾干燥，得高纯度核糖核酸。 (5)谷胱甘肽的分离纯化 采用截留孔径为100道尔顿的卷式膜进行纳滤，去除相对分子量小于100的杂质，同时实现对谷胱甘肽的浓缩。由于谷胱甘肽相对分子量为307.33，因此通过精心设定的超滤和纳滤处理，不仅能有效去除干扰谷胱甘肽分离纯化的杂质，而且谷胱甘肽的损失少、处理成本低。其次，为了进一步消除杂质对谷胱甘肽与离子交换树脂相互作用的干扰，本项目采用独有的扩张床亲和层析技术进行谷胱甘肽的特异性纯化，采用亲和选择性更高、亲和力更强的亲和层析来替代传统的离子交换层析来彻底解决杂质干扰的问题。由于传统的固定床亲和层析存在处理规模小、处理效率低的不足，本项目还将亲和层析与扩张床进行耦合，利用扩张床独具的上样量大、洗脱浓度高的优点，设计了新颖的扩张床亲和吸附层析工艺，使谷胱甘肽吸附的效率、回收率和纯化纯度等指标都同时得到了显著改善，一次吸附和洗脱可以从料液中回收超过80%以上的谷胱甘肽。洗脱液经纳滤浓缩、乙醇沉淀结晶、真空干燥后得谷胱甘肽成品，产品纯度大于90%。
2.如权利要求1中(I)所诉，其特征在于加入两性生物絮凝剂对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附。
3.如权利要求1中(2)所诉，其特征在于采用酶工程技术获得的新型蛋白酶。
4.如权利要求1中(2)所诉，其特征在于采用酶辅助热破胞抽提。
5.如权利要求1中(3)所诉，其特征在于采用截留孔径为10000道尔顿的陶瓷膜。
6.如权利要求1中(4)所诉，其特征在于采用专一性吸附核酸的高盐低pH值硅胶柱。
7.如权利要求1中(5)所诉，其特征在于采用截留孔径为100道尔顿的卷式膜进行纳滤。
8.如权利要求1中(5)所诉，其特征在于采用亲和层析与扩张床耦合技术。
【文档编号】C07H21/02GK104371000SQ201310361878
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】梅乐和 申请人:梅乐和