专利名称：一种从啤酒废酵母中提取海藻多糖的方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，特别涉及到一种海藻多糖提取制备的方法。
背景技术：
海藻糖是由两个D-葡萄糖分子通过a-1，I糖苷键组成，其分子式为C12H22O11,相对分子质量为378. 33，经常以二水化合物存在。海藻糖为白色晶体，含有两分子结晶水，熔点为97°C，当加热到130°C时，失去结晶水，无水海藻糖熔点达214-216°C。海藻糖甜味较弱，相当于蔗糖甜度的45%，无毒性，能溶于水、冰醋酸和热乙醇，不溶于乙醚、丙酮。海藻糖性质十分稳定，是天然双糖中最稳定的，无还原性，在食品中加热不发生美拉德反应，不被一般的酶水解，可被具有特异性的海藻糖酶水解为两分子葡萄糖。海 藻糖是生物组织的非特异性天然保护剂，属于非渗透性低温保护剂，可使动植物和微生物等有机体在冷冻、高温、脱水、高渗透压及有毒试剂等环境中仍然能保持生命活力。随着研究的逐步深入，目前其已广泛应用于医学及生物学领域，有学者将其用于保存血小板、细胞、组织、器官，并取得了显著的成果。由于海藻糖具有独特的生物活性，各国科学家对其生产技术进行了大量的研究。海藻糖的制备方法包括化学合成法、微生物提取法、微生物发酵法、酶合成法、基因工程法。海藻糖的化学合成法是在2，3，4，6-四乙酰基葡糖和3，4，6_三乙酰-1，2-脱水-D-葡糖之间产生环氧乙烷加成生成。该法制备海藻糖的缺点是产率低、分离困难，目前还处于研究阶段。1950年Laura首先从酵母中提取海藻糖。微生物提取法是以酵母、乳酸菌、霉菌及其它含海藻糖的微生物为提取源，首先通过改变微生物的生长条件，使其体内积累更多的海藻糖，然后采用适当的方法将海藻糖提取出来。微生物提取法是生产海藻糖的传统方法，经过不断的改进，此法已相当成熟，至今仍然是生产海藻糖的常用方法。微生物提取法常采用酵母菌为原料，制备获得的海藻多糖纯度高，可用于医药、分子生物学试剂及食品领域。然而，微生物提取法生产海藻糖存在生产周期长，提取率低，成本高，极大的限制了其规模化生产。微生物发酵法生产海藻糖是通过微生物发酵生产海藻糖，再从发酵液中提取纯化。其关键是通过诱变、细胞融合及基因重组等方法选育高产海藻糖的菌株。如利用节杆菌属、短茎细菌、棒杆菌属、诺卡菌属、丝核菌属、微球菌属等微生物的培养液来制备。然而，该法转化率低，副产物多。酶合成法生产海藻多糖是以葡萄糖、麦芽糖或淀粉为底物，通过相应的酶作用转换成海藻糖。酶合成法生产海藻多糖，成本相对较低，但存在产品纯度低，不合适医药、生物制剂等领域的应用。在此背景下，本发明以啤酒酵母废弃物为原料，完成海藻多糖的制备，为海藻多糖的微生物提取工艺的产业化推广提供一定的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提出一种海藻多糖提取制备的方法，依此法可以有效提高海藻多糖的产量和产品纯度，提高产率，降低生产成本。I、发明技术方案一种海藻多糖提取制备的方法，主要通过如下技术方案实现(I)啤酒废弃酵母预处理向啤酒废酵母内加入适量无菌水，过100目筛子进行筛分，加入5%的酒石酸，搅拌后离心分离获得纯净的啤酒酵母，备用。预处理获得的纯净啤酒酵母98-105°C下烘干处理 40-48h。(2)索氏提取 烘干获得啤酒酵母和无菌水一定比例混匀后放入索氏提取器内，80_100°C，O. 09-0. IOMPa下完成索氏提取，提取结束后，提取液4°C下离心，取上清获得海藻糖粗提液。(3)活性炭脱色调节提取液的pH值为8. 5-9. 0，控制温度为45_50°C，按照2% _4%的百分比加入活性炭，浸提O. 5-2h，脱色次数为2-3次，至液体无色，离心留上清，备用。(4)碱金属盐沉淀除蛋白脱色液内加入适量的硫酸锌溶液，用加入Ba(OH)2调节pH值至8. 0，搅拌均匀，静置后离心留上清，备用。(5)离子交换除杂将经处理的大孔强酸性阳离子树脂和大孔强碱性阴离子树脂柱按照用量体积比2 I混合装柱，平衡后调节碱金属盐沉淀获得溶液PH值后以2. OmL/min的流速进行阴阳离子交换除杂。(6)结晶干燥将经离子交换除杂的流出液浓缩后，加入无水乙醇，搅拌均匀后投入晶种，4°C静置12h，获得海藻糖晶体。过滤获得海藻糖晶体，用少量乙醇冲洗后，于40°C下真空干燥12h获得海藻糖纯品。2、发明技术特点(I)传统微生物提取法生产海藻糖存在生产周期长，提取率低，成本高，极大的限制了其规模化生产，而本发明以啤酒废弃酵母为原料进行海藻糖的制备，可有实现废弃物的再利用，同时还具有原料利用率高，成本低，工艺简单，方法易行、操作安全，且产品纯度高，易于产业化推广；(2)本发明采用索氏提取法进行啤酒酵母内海藻多糖的提取，同传统的加热回流方法相比，提取率可提高3倍以上；(3)本发明在海藻糖精制工艺中采用了碱金属盐沉淀工艺除蛋白，有效提高了海藻糖的纯度，所获得的产品纯度达到98. 5%以上，可用于医药、化妆品和食品等领域。
四
图I :啤酒废酵母制备海藻糖工艺流程图五具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。实施例一 称取啤酒废酵母1kg，加入IOL无菌水稀释均匀后，过100目筛子筛分2次，加入酒石酸终浓度达到5%，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得纯净的啤酒酵母，备用。预处理获得的纯净啤酒酵母放入烘箱内，100°C烘干42h。烘干处理好的啤酒废酵母用纱布包裹好放入索氏提取器内，用25L去离子水，在80°C、真空度为O. 09MPa的条件下进行索氏提取，提取结束后，提取液，4000r/min离心15min，取上清获得海藻糖粗提液。调节海藻糖粗提液的pH值为8. 5，加入活性炭终浓度达到3 %，调节粗提液温度为45°C进行活性炭脱色，每次处理时间为lh，脱色次数为2次，至液体无色，离心留上清，备用。按照I : 100的体积比向脱色处理液内加入质量分数为10%的硫酸锌溶液，搅拌均匀 后用Ba(OH)2调节溶液pH值至8. 0，静置后离心留上清。将经处理的大孔强酸性阳离子树脂DOOl和大孔强碱性阴离子树脂柱D280按照用量体积比2 I混合装柱，平衡后调节碱金属盐沉淀获得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速进行阴阳离子交换除杂，流出液浓缩至40%后，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后投入晶种，4°C静置12h，获得海藻糖晶体。过滤获得海藻糖晶体，用少量乙醇冲洗后，于40°C下真空干燥12h获得海藻糖纯品，HPLC检测产品纯度达到98. 6%。实施例二称取啤酒废酵母1kg，加入8L无菌水稀释均匀后，过100目筛子筛分2次，加入酒石酸终浓度达到5%，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得纯净的啤酒酵母，备用。预处理获得的纯净啤酒酵母放入烘箱内，105°C烘干42h。烘干处理好的啤酒废酵母用纱布包裹好放入索氏提取器内，用25L去离子水，在80°C、真空度为O. 09MPa的条件下进行索氏提取，提取结束后，提取液，4000r/min离心15min，取上清获得海藻糖粗提液。调节海藻糖粗提液的pH值为9. O，加入活性炭终浓度达到2%，调节粗提液温度为45°C进行活性炭脱色，每次处理时间为O. 5h，脱色次数为2次，至液体无色，离心留上清，备用。按照I. 5 100的体积比向脱色处理液内加入质量分数为12%的硫酸锌溶液，搅拌均匀后用Ba(0!1)2调节溶液pH值至8. O，静置后离心留上清。将经处理的大孔强酸性阳离子树脂D72和大孔强碱性阴离子树脂柱D296按照用量体积比2 I混合装柱，平衡后调节碱金属盐沉淀获得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速进行阴阳离子交换除杂，流出液浓缩至50%后，加入5倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后投入晶种，4°C静置12h，获得海藻糖晶体。过滤获得海藻糖晶体，用少量乙醇冲洗后，于40°C下真空干燥12h获得海藻糖纯品，HPLC检测产品纯度达到98. 7%。实施例三称取啤酒废酵母1kg，加入IOL无菌水稀释均匀后，过100目筛子筛分I次，加入酒石酸终浓度达到5%，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得纯净的啤酒酵母，备用。预处理获得的纯净啤酒酵母放入烘箱内，100°C烘干45h。烘干处理好的啤酒废酵母用纱布包裹好放入索氏提取器内，用25L去离子水，在80°C、真空度为O. 09MPa的条件下进行索氏提取，提取结束后，提取液，4000r/min离心15min，取上清获得海藻糖粗提液。
调节海藻糖粗提液的pH值为8. 5，加入活性炭终浓度达到4%，调节粗提液温度为45°C进行活性炭脱色，每次处理时间为lh，脱色次数为2次，至液体无色，离心留上清，备用。按照I : 100的体积比向脱色处理液内加入质量分数为11%的硫酸锌溶液，搅拌均匀后用Ba(OH)2调节溶液pH值至8. 0，静置后离心留上清。将经处理的大孔强酸性阳离子树脂D72和大孔强碱性阴离子树脂柱D280按照用量体积比2 I混合装柱，平衡后调节碱金属盐沉淀获得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速进行阴阳离子交换除杂，流出液浓缩至45%后，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后投入晶种，4°C静置12h，获得海藻糖晶体。过滤获得海藻糖晶体，用少量乙醇冲洗后，于40°C下真空干燥12h获得海藻糖纯品，HPLC检测产品纯度达到98.6%。实施例四称取啤酒废酵母1kg，加入9L无菌水稀释均匀后，过100目筛子筛分2次，加入酒石酸终浓度达到5%，搅拌20min后，3000r/min离心分离获得纯净的啤酒酵母，备用。·预处理获得的纯净啤酒酵母放入烘箱内，98°C烘干48h。烘干处理好的啤酒废酵母用纱布包裹好放入索氏提取器内，用30L去离子水，在80°C、真空度为O. 09MPa的条件下进行索氏提取，提取结束后，提取液，4000r/min离心15min，取上清获得海藻糖粗提液。调节海藻糖粗提液的pH值为9. O，加入活性炭终浓度达到2 %，调节粗提液温度为45°C进行活性炭脱色，每次处理时间为lh，脱色次数为2次，至液体无色，离心留上清，备用。按照I. 2 100的体积比向脱色处理液内加入质量分数为11%的硫酸锌溶液，搅拌均匀后用Ba(OH)2调节溶液pH值至8. O，静置后离心留上清。将经处理的大孔强酸性阳离子树脂DOOlSC和大孔强碱性阴离子树脂柱D380按照用量体积比2 I混合装柱，平衡后调节碱金属盐沉淀获得溶液PH值至6. O后以2. OmL/min的流速进行阴阳离子交换除杂，流出液浓缩至40%后，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后投入晶种，4°C静置12h，获得海藻糖晶体。过滤获得海藻糖晶体，用少量乙醇冲洗后，于40°C下真空干燥12h获得海藻糖纯品，HPLC检测产品纯度达到98. 8%。
权利要求
1.一种从啤酒废酵母中提取海藻多糖的方法，其特征是以啤酒废弃酵母为原料，经预处理除杂、烘干灭酶、超声波破碎后提取获得海藻多糖粗提液后，采用超声波破碎、索氏提取获得海藻多糖的提取液，进一步经活性炭脱色、碱金属盐沉淀脱蛋白、离子交换除杂、浓缩、结晶干燥后获得海藻多糖纯品。
2.如权利要求I中所述的啤酒废弃酵母预处理除杂，其特征在于向啤酒废酵母内加入无菌水，调节酵母悬液浓度为8% -10%，过100目筛子进行筛分1-2次，加入5%的酒石酸，搅拌15-30min, 3000r/min离心分离获得纯净的啤酒酵母,备用。
3.如权利要求I中所述的烘干处理，其特征在于预处理获得的纯净啤酒酵母烘干处理过程中，烘干温度为98-105°C，处理时间为40-48h。
4.如权利要求I中所述的索氏提取工艺，其特征在于烘干获得啤酒酵母和无菌水的料液比I 25-1 30，提取温度为80-1001，真空度0.09-0.1010^，提取结束后，提取液，4000r/min离心15min,取上清获得海藻糖粗提液。
5.如权利要求I所述的活性炭脱色工艺中，其特征在于提取液的pH值为8.5-9.0，温度为45-50°C，活性炭的添加量为2% -4%，提取时间为O. 5-2h，脱色次数为2_3次，至液体无色,离心留上清,备用。
6.如权利要求I所述的碱金属盐沉淀工艺，其特征在于加入的硫酸锌溶液的质量分数为10-12%，添加比例为I 100-1.5 100。
7.如权利要求I所述的离子交换除杂工艺，其特征在于采用的强酸性大孔阳离子交换树脂可选择D001，001X7，D001SC, D72，强碱性打孔阴离子交换树脂可选择D280，D296，D201，D380中的一种，阴阳树脂用量体积比为2 1，混合装柱，流速为2. OmL/min。
8.如权利要求I所述的结晶干燥工艺，其特征在于将经离子交换除杂的流出液浓缩至40%-50%后，加入4-5倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后投入晶种，4°C静置12h，获得海藻糖晶体。过滤获得海藻糖晶体，用少量乙醇冲洗后，于40°C下真空干燥12h获得海藻糖纯品O
9.如权利要求I所述的一种海藻多糖提取制备的方法，其特征在于制备获得的海藻糖纯度达到98. 5%以上。
全文摘要
本发明公开了一种从啤酒废酵母中提取海藻多糖的方法，属于生物技术范畴。本方法利用啤酒废酵母为原料进行海藻多糖的制备，主要工艺为啤酒废酵母预处理去杂后烘干灭酶，再采用索氏提取获得海藻多糖提取液，进一步经活性炭脱色、碱金属盐沉淀脱蛋白、离子交换除杂、浓缩、结晶干燥后获得海藻多糖，纯度达到98.5％以上，可用于医药、化妆品和食品等领域。本发明具有原料利用率高、成本低、工艺简单、方法易行、操作安全和产品纯度高等特点，易于产业化生产。
文档编号C07H3/04GK102850410SQ20121036147
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者李少民 申请人:西藏金稞集团有限责任公司