一种海藻多糖p155及其制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种海藻多糖P155及其制备工艺，采用多级串联柱纯化方式，上样液在层析柱间依次流动，溶液中乙醇有助于杂质的溶解，而使需要去除的杂质分别吸附在不同介质的层析柱上，海藻多糖最终吸附在阴离子交换柱上，实现一次性洗脱收集，极大地简化了纯化工艺流程；制备工艺不采用季铵盐等有机试剂，减少了安全隐患，取消了繁杂的有机试剂去除过程，体现了绿色环保的生成理念实现无污染排放等特点；本发明制备工艺降低了生产成本，是一种无污染、低成本、简洁实用的海藻多糖的制备工艺。
【专利说明】
一种海藻多糖P155及其制备工艺
[0001 ] 技术领域:
本发明提供一种海藻多糖P155，本发明进一步公开了该海藻多糖P155的制备工艺，属于海洋植物提取制备技术领域。
[0002]技术背景:
多项研究表明，海藻多糖具有多种生物学活性和广泛的药用价值，越来越受到人们的重视，现已有多种从藻类植物中提取海藻多糖方法，但现有的海藻多糖提取方法多采用耗能大、污染重、成本高的生产流程，制备过程中多采用对人有害，特别是提取过程中经常使用氯化十六烷吡啶(CPC)与十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)等季铵盐沉淀海藻多糖，而这类季铵盐具有杀菌消毒作用，除食入毒性外，还有很强吸入毒性，对皮肤、粘膜具有强刺激作用，操作时需认真防护，同时这类季铵盐在后期处理中难以去除，去除操作增加了生产成本。
[0003]
【发明内容】
:
本发明提供一种海藻多糖P155，为一种新的海藻多糖，可用于制药、食品等技术领域。
[0004]本发明进一步提供了一种海藻多糖P155的制备工艺，克服现有海藻多糖制备工艺中的不足，创建一种无污染、低成本、简洁实用的海藻多糖的制备工艺。
[0005]本发明所述的一种海藻多糖Pl55的制备工艺，包括以下步骤:
1)将海带洗净后剪碎，60?90°C烤箱脱水干燥，用粉碎机破碎成细颗粒，过30目筛网；
2)热水浸提:海带颗粒按4?6倍体积加入纯净水，在回流提取装置中80?85°C浸提3~6小时，反复浸提2次，减压浓缩，合并浸提液；
3)滤液收集:浸提液用纱布过滤，收集过滤清液；
4)调酸沉淀:用盐酸将过滤清液调节至pH2.0，搅拌均匀；
5)离取上清:将调酸的浸提液8000rpm离心30分钟，收集上清液；
6)调碱中和:用氢氧化钠将上述离心上清液调节至中性；
7)超滤浓缩:用10kD超滤膜包进行循环浓缩，同时进行纯水置换除盐；
8)低温醇析:将浓缩液用无水乙醇调整至浓度85%，低温醇析；
9)析出分离:醇析液3000rpm离心20分钟，吸去上清，保留粗多糖结晶沉淀；
10)乙醇洗涤:用无水乙醇将粗多糖结晶离心洗涤2次；
11)粗多糖收集:将收集到的粗多糖结晶自然干燥；
12)大孔树脂去杂质:将粗多糖按lg/20ml比例溶解于6%乙醇水中，过AB-8大孔树脂去除色素等杂质；
13)大孔树脂去蛋白:将步骤12)的柱流出液直接同过HPD-600大孔树脂，进一步去除粗多糖中色素，同时去除粗多糖中的蛋白质；
14)离子交换柱层析:将步骤13)的柱流出液直接通过平衡好的DEAESepharose CL-6B阴离子层析柱，用0.2mol/L NaCl冲洗层析柱，用0.2-lmol/L NaCl溶液对吸附在离子交换柱上的多糖进行线性洗脱，收集第二个主要洗脱峰组分；
15)凝胶过滤柱层析:将步骤14)离子交换层析分离组分浓缩后，过0.05mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-200凝胶过滤柱层析，对离子交换层析分离组分进行进一步纯化；
16)超滤浓缩:步骤15)的纯化液用10kD超滤浓缩除盐；
17)真空干燥:对浓缩后的海藻多糖进行真空干燥或冷冻干燥，即得。
[0006]本发明所述的海藻多糖P155在医药产品、食品和日用品开发方面具有广阔的应用前景。
[0007]本发明在制备过程中均未使用有机试剂，在去除海藻中蛋白质的过程中采用树脂吸附的方式，避免了有害试剂的应用。本发明工艺采用多级串联柱纯化方式，上样液在层析柱间依次流动，溶液中6%的乙醇有助于杂质的溶解，而使需要去除的杂质分别吸附在不同介质的层析柱上，海藻多糖最终吸附在阴离子交换柱上，实现一次性洗脱收集，极大地简化了纯化工艺流程。
[0008]本发明的积极效果在于:制备工艺不采用季铵盐等有机试剂，减少了安全隐患，取消了繁杂的有机试剂去除过程，体现了绿色环保的生成理念实现无污染排放等特点；采用多级串联柱纯化方式，使杂质及产物分别吸附在各自不同的层析柱上，实现一次性洗脱收集，极大地简化了纯化工艺流程，降低了生产成本，是一种无污染、低成本、简洁实用的海藻多糖的制备工艺。
【附图说明】
[0009]图1为实施例1离子交换层析图谱；
图2为实施例1凝胶过滤层析图谱；
图3为实施例2离子交换层析图谱；
图4为实施例2凝胶过滤层析图谱；
图5为实施例3离子交换层析图谱；
图6为实施例3凝胶过滤层析图谱。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实验例对本发明作进一步说明，但并不仅仅限于以下实施例。
[0011]实施例1:
1)将海带洗净后剪碎，60°C烤箱脱水干燥，用粉碎机破碎成细颗粒，过30目筛网；
2)热水浸提:称取海带颗粒400g加入4倍体积纯净水，在回流提取装置中80°C浸提3小时，反复浸提2次，减压浓缩，合并浸提液；
3)滤液收集:浸提液用纱布过滤，收集过滤清液；
4)调酸沉淀:用4mol/L盐酸将过滤清液调节至pH2.0，搅拌均匀；
5)离取上清:将调酸的浸提液8000rpm离心30分钟，收集上清液；
6)调碱中和:用2mol/L氢氧化钠将上述离心上清液调节至中性；
7)超滤浓缩:用10kD超滤膜包进行循环浓缩，同时进行纯水置换除盐；
8)低温醇析:将浓缩液用无水乙醇调整至浓度85%，低温醇析；
9)析出分离:醇析液3000rpm离心20分钟，吸去上清，保留粗多糖结晶沉淀；
10)乙醇洗涤:用无水乙醇将粗多糖结晶离心洗涤2次；
11)粗多糖收集:将收集到的粗多糖结晶自然干燥;获得粗多糖42克，提取率为10.5%; 12)大孔树脂去杂质:将粗多糖按lg/20ml比例溶解于6%乙醇水中，过AB-8大孔树脂去除色素等杂质；
13)大孔树脂去蛋白:将步骤12)的柱流出液直接同过HPD-600大孔树脂，进一步去除粗多糖中色素，同时去除粗多糖中的蛋白质;粗多糖中色素的去除率为94%，蛋白质去除率为91 %，多糖回收率为89%(参见图1);
14)离子交换柱层析:将步骤13)的柱流出液直接通过平衡好的DEAESepharose CL-6B阴离子层析柱，用0.2mol/L NaCl冲洗层析柱，用0.2-lmol/L NaCl溶液对吸附在离子交换柱上的多糖进行线性洗脱，收集第二个主要洗脱峰组分;经测定，第二主要洗脱组分占总粗多糖上样量的45%(参见图2);
15)凝胶过滤柱层析:将步骤14)离子交换层析分离组分浓缩后，过0.05mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-200凝胶过滤柱层析，对离子交换层析分离组分进行进一步纯化;经测定海藻多糖P155的含量为离子交换第二洗脱组分上样量的55%，为分子量较大的组分，纯度为95%;凝胶过滤得到的第一峰，即分子量较大的组分，为终产物海藻多糖P155;
16)超滤浓缩:步骤15)的纯化液用10kD超滤浓缩除盐；
17)真空干燥:对浓缩后的海藻多糖进行真空干燥或冷冻干燥，即得海藻多糖P155，其中，硫酸基含量22.3%，糖醛酸含量10.4%。岩藻糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为5.7:3.7:1。
[0012]
实施例2:
1)将海带洗净后剪碎，80°C烤箱脱水干燥，用粉碎机破碎成细颗粒，过30目筛网；
2)热水浸提:取400克干燥的海带颗粒，加入5倍体积纯净水，在回流提取装置中83°C浸提4小时，反复浸提2次，减压浓缩，合并浸提液；
3)滤液收集:浸提液用纱布过滤，收集过滤清液；
4)调酸沉淀:用盐酸将过滤清液调节至pH2.0，搅拌均匀；
5)离取上清:将调酸的浸提液8000rpm离心30分钟，收集上清液；
6)调碱中和:用氢氧化钠将上述离心上清液调节至中性；
7)超滤浓缩:用10kD超滤膜包进行循环浓缩，同时进行纯水置换除盐；
8)低温醇析:将浓缩液用无水乙醇调整至浓度85%，低温醇析；
9)析出分离:醇析液3000rpm离心20分钟，吸去上清，保留粗多糖结晶沉淀；
10)乙醇洗涤:用无水乙醇将粗多糖结晶离心洗涤2次；
11)粗多糖收集:将收集到的粗多糖结晶自然干燥;获得粗多糖39克，本次粗多糖提取率为9.8%(参见图3);
12)大孔树脂去杂质:将粗多糖按lg/20ml比例溶解于6%乙醇水中，过AB-8大孔树脂去除色素等杂质；
13)大孔树脂去蛋白:将步骤12)的柱流出液直接同过HPD-600大孔树脂，进一步去除粗多糖中色素，同时去除粗多糖中的蛋白质;测定结果表明，粗多糖中色素的去除率为95%，蛋白质去除率为90%，多糖回收率为88%(参见图4);
14)离子交换柱层析:将步骤13)的柱流出液直接通过平衡好的DEAESepharose CL-6B阴离子层析柱，用0.2mol/L NaCl冲洗层析柱，用0.2-lmol/L NaCl溶液对吸附在离子交换柱上的多糖进行线性洗脱，收集第二个主要洗脱峰组分;经测定，第二主要洗脱组分占总粗多糖上样量的42%;
15)凝胶过滤柱层析:将步骤14)离子交换层析分离组分浓缩后，过0.05mol/L NaCl平衡过的Sephadex G-200凝胶过滤柱层析，对离子交换层析分离组分进行进一步纯化；
16 )超滤浓缩:步骤15 )的纯化液用I OOkD超滤浓缩除盐;经测定海藻多糖P15 5的含量为离子交换第二洗脱组分上样量的58%，为分子量较大的组分，纯度为94%;凝胶过滤得到的第一峰，即分子量较大的组分，为终产物Pl 55 ；
17)真空干燥:对浓缩后的海藻多糖进行真空干燥或冷冻干燥，即得海藻多糖P155，其中，硫酸基含量20.5%，糖醛酸含量9.8%。岩藻糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为5.4:3.2:1。
[0013]
实施例3:
1)将海带洗净后剪碎，90°C烤箱脱水干燥，用粉碎机破碎成细颗粒，过30目筛网；
2)热水浸提:海带颗粒500g加入6倍体积纯净水，在回流提取装置中85°C浸提3~6小时，反复浸提2次，减压浓缩，合并浸提液；
3)滤液收集:浸提液用纱布过滤，收集过滤清液；
4)调酸沉淀:用盐酸将过滤清液调节至pH2.0，搅拌均匀；
5)离取上清:将调酸的浸提液8000rpm离心30分钟，收集上清液；
6)调碱中和:用氢氧化钠将上述离心上清液调节至中性；
7)超滤浓缩:用10kD超滤膜包进行循环浓缩，同时进行纯水置换除盐；
8)低温醇析:将浓缩液用无水乙醇调整至浓度85%，低温醇析；
9)析出分离:醇析液3000rpm离心20分钟，吸去上清，保留粗多糖结晶沉淀；
10)乙醇洗涤:用无水乙醇将粗多糖结晶离心洗涤2次；
11)粗多糖收集:将收集到的粗多糖结晶自然干燥;获得粗多糖62克，本次粗多糖提取率为12.4%(参见图5);
12)大孔树脂去杂质:将粗多糖按lg/20ml比例溶解于6%乙醇水中，过AB-8大孔树脂去除色素等杂质；
13)大孔树脂去蛋白:将步骤12)的柱流出液直接同过HPD-600大孔树脂，进一步去除粗多糖中色素，同时去除粗多糖中的蛋白质;测定结果表明，粗多糖中色素的去除率为92%，蛋白质去除率为90%，多糖回收率为86%;
14)离子交换柱层析:将步骤13)的柱流出液直接通过平衡好的DEAESepharose CL-6B阴离子层析柱，用0.2mol/L NaCl冲洗层析柱，用0.2-lmol/L NaCl溶液对吸附在离子交换柱上的多糖进行线性洗脱，收集第二个主要洗脱峰组分;经测定，第二主要洗脱组分占总粗多糖上样量的40%(参见图6);
15)凝胶过滤柱层析:将步骤14)离子交换层析分离组分浓缩后，过0.05mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-200凝胶过滤柱层析，对离子交换层析分离组分进行进一步纯化;经测定P155的含量为离子交换第二洗脱组分上样量的60%，为分子量较大的组分，纯度为92%。凝胶过滤得到的第一峰，即分子量较大的组分，为终产物P155;
16)超滤浓缩:步骤15)的纯化液用10kD超滤浓缩除盐；
17)真空干燥:对浓缩后的海藻多糖进行真空干燥或冷冻干燥，即得海藻多糖P155，其中，硫酸基含量23.7%，糖醛酸含量10.9%。岩藻糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为5.6:3.9:1。
【主权项】
1.一种海藻多糖P155，其特征在于是通过以下工艺制成的: 1)将海带洗净后剪碎，60?90°C烤箱脱水干燥，用粉碎机破碎成细颗粒，过30目筛网； 2)热水浸提:海带颗粒按4?6倍体积加入纯净水，在回流提取装置中80?85°C浸提3~6小时，反复浸提2次，减压浓缩，合并浸提液； 3 )滤液收集:浸提液用纱布过滤，收集过滤清液； 4)调酸沉淀:用盐酸将过滤清液调节至pH2.0，搅拌均匀； 5)离取上清:将调酸的浸提液8000rpm离心30分钟，收集上清液； 6)调碱中和:用氢氧化钠将上述离心上清液调节至中性； 7)超滤浓缩:用10kD超滤膜包进行循环浓缩，同时进行纯水置换除盐； 8)低温醇析:将浓缩液用无水乙醇调整至浓度85%，低温醇析； 9)析出分离:醇析液3000rpm离心20分钟，吸去上清，保留粗多糖结晶沉淀； 10)乙醇洗涤:用无水乙醇将粗多糖结晶离心洗涤2次； 11)粗多糖收集:将收集到的粗多糖结晶自然干燥； 12)大孔树脂去杂质:将粗多糖按lg/20ml比例溶解于6%乙醇水中，过AB-8大孔树脂去除色素等杂质； 13)大孔树脂去蛋白:将步骤12)的柱流出液直接同过HPD-600大孔树脂，进一步去除粗多糖中色素，同时去除粗多糖中的蛋白质； 14)离子交换柱层析:将步骤13)的柱流出液直接通过平衡好的DEAESepharose CL-6B阴离子层析柱，用0.2mol/L NaCl冲洗层析柱，用0.2-lmol/L NaCl溶液对吸附在离子交换柱上的多糖进行线性洗脱，收集第二个主要洗脱峰组分； 15)凝胶过滤柱层析:将步骤14)离子交换层析分离组分浓缩后，过0.05mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-200凝胶过滤柱层析，对离子交换层析分离组分进行进一步纯化； 16)超滤浓缩:步骤15)的纯化液用10kD超滤浓缩除盐； 17)真空干燥:对浓缩后的海藻多糖进行真空干燥或冷冻干燥，即得。2.如权利要求1所述的一种海藻多糖P155的制备工艺，包括以下步骤: 1)将海带洗净后剪碎，60?90°C烤箱脱水干燥，用粉碎机破碎成细颗粒，过30目筛网； 2)热水浸提:海带颗粒按4?6倍体积加入纯净水，在回流提取装置中80?85°C浸提3~6小时，反复浸提2次，减压浓缩，合并浸提液； 3 )滤液收集:浸提液用纱布过滤，收集过滤清液； 4)调酸沉淀:用盐酸将过滤清液调节至pH2.0，搅拌均匀； 5)离取上清:将调酸的浸提液8000rpm离心30分钟，收集上清液； 6)调碱中和:用氢氧化钠将上述离心上清液调节至中性； 7)超滤浓缩:用10kD超滤膜包进行循环浓缩，同时进行纯水置换除盐； 8)低温醇析:将浓缩液用无水乙醇调整至浓度85%，低温醇析； 9)析出分离:醇析液3000rpm离心20分钟，吸去上清，保留粗多糖结晶沉淀； 10)乙醇洗涤:用无水乙醇将粗多糖结晶离心洗涤2次； 11)粗多糖收集:将收集到的粗多糖结晶自然干燥； 12)大孔树脂去杂质:将粗多糖按lg/20ml比例溶解于6%乙醇水中，过AB-8大孔树脂去除色素等杂质； 13)大孔树脂去蛋白:将步骤12)的柱流出液直接同过HPD-600大孔树脂，进一步去除粗多糖中色素，同时去除粗多糖中的蛋白质； 14)离子交换柱层析:将步骤13)的柱流出液直接通过平衡好的DEAESepharose CL-6B阴离子层析柱，用0.2mol/L NaCl冲洗层析柱，用0.2-lmol/L NaCl溶液对吸附在离子交换柱上的多糖进行线性洗脱，收集第二个主要洗脱峰组分； 15)凝胶过滤柱层析:将步骤14)离子交换层析分离组分浓缩后，过0.05mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-200凝胶过滤柱层析，对离子交换层析分离组分进行进一步纯化； 16)超滤浓缩:步骤15)的纯化液用10kD超滤浓缩除盐； 17)真空干燥:对浓缩后的海藻多糖进行真空干燥或冷冻干燥，即得。3.如权利要求1所述的海藻多糖P155在医药产品、食品和日用品中的用途。
【文档编号】C08B37/00GK106046193SQ201610591201
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月26日 公开号201610591201.2, CN 106046193 A, CN 106046193A, CN 201610591201, CN-A-106046193, CN106046193 A, CN106046193A, CN201610591201, CN201610591201.2
【发明人】乌垠, 李玉新, 鲍永利, 孙陆果, 于春雷, 易静雯
【申请人】东北师范大学